Vật mang Số TBT đem nuôi Tỉ lệ sống sau nuôi (%) Tỉ lệ TBT chín trên số TBT đem nuôi (%) Tỉ lệ TBT chín trên số TBT sống sau nuôi (%) Cọng rạ 861 51,80 ± 1,70a (446 TBT) 20,79 ± 1,38a (179 TBT) 40,13 ± 2,32a Vi giọt 868 50,81 ± 1,70a (441 TBT) 12,79 ± 1,13b (111 TBT) 25,17 ± 2,07b Đối chứng 180 95,00 ± 1,62b (171 TBT) 68,33 ± 3,47c (123 TBT) 71,93 ± 3,44c
a, b, c: khác nhau theo cột, có ý nghĩa thống kê ởđộ tin cậy 95%
Từ kết quả Bảng 3.18 cho thấy: có 861 TBT được giải đông từ cọng rạ đem nuôi, tỉ lệ TBT sống sau khi nuôi đạt 51,80 ± 1,70% (446 TBT); trong đó có 179 TBT chín, chiếm tỉ lệ 20,79 ± 1,38%. Đối các TBT được giải đông từ vi giọt, có 441/868 TBT sống sau khi nuôi, đạt 50,81 ± 1,70% và có 111 TBT chín, đạt tỉ lệ
12,79 ± 1,13%. Trong khi đó ở lô đối chứng, có 171/180 TBT sống sau khi nuôi, đạt
95,00 ± 1,62% và có tới 123 TBT chín, đạt tỉ lệ68,33 ± 3,47%.
Tỉ lệ sống sau khi nuôi ở lô cọng rạ và lô vi giọt có sự khác biệt nhau và thấp hơn 1,8 lần so với lô đối chứng, sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê, P < 0,001 (xem phục lục 3, mục 5.2.2.2). Ởđợt thí nghiệm này, nguồn TBT được giải đông từ
cọng rạ và vi giọt đều có TBT đạt đến giai đoạn chín và cả hai nguồn đều có tỉ lệ
sống sau đông lạnh tương đương nhau (P > 0,05). Nguồn TBT giải đông từcọng rạ
cho tỉ lệ chín cao hơn gấp 1,6 lần so với nguồn TBT giải đông từvi giọt (20,79% so với 12,79%, P < 0,001), tuy nhiên, cả hai nguồn TBT này đều có tỉ lệ chín thấp hơn rất nhiều so với lô đối chứng (68,33%, P < 0,001), (xem phục lục 3, mục 5.2.2.2).
BÀN LUẬN
Ở đợt thí nghiệm 1, khi nuôi chín in vitro TBT từ nguồn TBT GV đông lạnh trong môi trường N2 cho tỉ lệ chín cao hơn so với môi trường N1 (P < 0,001). Kết quả này thấp hơn so với các nghiên cứu của Dong-Hoon Kim và cs. (2007) [79], Yunus Cetin và cs. (2006) [39] có tỉ lệ TBT đạt đến giai đoạn MII lần lượt là 44,4% và 34,1%. Kết quả của chúng tôi thấp hơn có thể là do một số thể cực không được phát hiện khi đánh giá bằng quan sát hình thái, từđó dẫn đến việc bỏ sót trong quá trình đánh giá sự trưởng thành của TBT. Ở trong nước, cho đến thời điểm này chưa có công trình nào công bố về kết quả nuôi chín in vitro TBT bò từ nguồn TBT GV đông lạnh. Do đó, có thể coi đây là kết quả khởi đầu cho nghiên cứu về hướng này.
Nguyên nhân dẫn đến tỉ lệ TBT chín ở môi trường có bổ sung dịch nang trứng (N2) khi tiến hành nuôi TBT GV thu từcọng rạ có kết quả cao hơn thu từvi giọt có thểđược lí giải như sau: (1) Sốc nhiệt trong quá trình giải đông: trong cọng rạ, các TBT được đưa từ từ qua các nhiệt độ (5 giây cân bằng ở miệng bình nitơ, 10 giây cân bằng trong becher nước ấm 37oC rồi mới chuyển qua các môi trường giải đông); với vi giọt, cryotube đựng vi giọt được đổ trực tiếp ra đĩa nhựa trong nhiệt độ phòng (không qua bước cân bằng với nhiệt độ của nước cất 37oC) nên ít nhiều ảnh hưởng
đến sự chênh lệch kết quả của 2 phương pháp đông lạnh cọng rạ và vi giọt. (2) Mỗi lần giải đông bằng cọng rạ ta có thể chỉ thực hiện lần lượt 1-2 cọng rạ (10-12 TBT), số TBT tương đối ít nên việc thu TBT trong môi trường thủy tinh hóa nhanh hơn trong giải đông bằng vi giọt (khoảng 40-50 TBT/cryotube). Do đó, giải đông bằng
cọng rạ hạn chế thời gian tiếp xúc hơn giữa các TBT với môi trường thủy tinh hóa (nồng độ chất bảo quản cao thường gây độc với TBT) nên giảm bớt phần nào tổn thương của TBT trước khi nuôi chín in vitro.
Nguyên nhân của tỉ lệ TBT sống và trưởng thành trong môi trường N2cao hơn
N1 có thể giải thích như sau: Trong môi trường có bổ sung dịch nang trứng (10% thể tích môi trường) có chứa nguồn dinh dưỡng, các enzyme cần cho quá trình giảm
phân (dịch nang trứng là một dung dịch nhớt, giàu hormone sinh sản steroid và nhiều hormone sinh sản khác cũng như các yếu tố không phải hormone giúp điều hòa chức năng buồng trứng và sự phát triển của TBT [61, 76]). Do đó sẽ tạo cho các TBT một môi trường cũng như điều kiện gần giống với in vivo hơn là môi trường không có bổ sung dịch nang trứng.
Ở đợt thí nghiệm thứ 2: dựa trên kết quả của TN1, nên chỉ tiến hành nuôi TBT
được đông lạnh trong môi trường N2. Tỉ lệ sống của TBT theo hình thái sau khi nuôi 22-24 giờ trong thí nghiệm đạt 50-51%. Tỉ lệ này còn thấp hơn rất nhiều so với công bố của Kim và cs. (2007). Nhóm tác giả này tiến hành cân bằng TBT với dung dịch thủy tinh hóa trong 3 phút và 5 phút thu được kết quả lần lượt là 68,4% và 73,8% [79]. Tỉ lệ TBT chín trong thí nghiệm của chúng tôi chỉ đạt ở mức 20,79%
(từcọng rạ) và 12,79% (từvi giọt). Tỉ lệ này thấp hơn lô đối chứng rất nhiều (3,29 lần và 5,34 lần, từ cọng rạ và từ vi giọt, tương ứng). Tuy nhiên tỉ lệ này có cải thiện hơn so với các thí nghiệm ở đợt 1: 20,79% so với 13,30% (từ cọng rạ, P < 0,05) và 12,79% so với 6,08% (từ vi giọt, P < 0,001). Kết quả này có phần cao hơn so với một số tác giả đã công bố: Abe và cs. (2005; 10%, đông lạnh một bước), Cetin và cs. (2006; 13,3%), Yamada và cs. (2007; 11,7%), Prentice (2010; 10%) [16, 39, 118, 150]; nhưng thấp hơn so với một số tác giả khác. Cụ thể:
- Nhóm nghiên cứu của Abe và cs. (2005) khi thủy tinh hóa TBT bò GV qua 3 bước, chất bảo vệ lạnh là EG và Ficoll-70 cùng với đường sucrose hoặc trehalose, sử dụng vật mang là lưới nylon. Kết quả thu được tỉ lệ chín tương đương nhau 64,1 ± 4% và 63,1 ± 1,5%, tương ứng (P < 0,05) [16]. Nhóm này cho rằng các TBT GV trong quá trình bảo quản lạnh bị tổn thương do ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu cùng với sự bão hòa các chất bảo vệ nội bào [16]. Bên cạnh đó TBT GV khi tiếp xúc với các chất bảo vệ lạnh sẽ giảm sự phát triển tiếp theo sau khi nuôi cấy. Vì ở giai đoạn này TBT rất nhạy cảm với sự thay đổi áp suất thẩm thấu, làm cho độ dẫn nước thấp hơn gần 2 lần so với các TBT ở giai đoạn MII [18, 62].
- Nhóm nghiên cứu của Cetin và cs. (2006) tiến hành thủy tinh hóa TBT bò GV, chất bảo vệ lạnh là EG bổ sung sucrose, vật mang là cọng rạ 0,25ml. Kết quả
thu được tỉ lệ chín đạt 31,6% theo đánh giá hình thái, 34,1% theo đánh giá nhuộm bằng dung dịch Giemsa stock [39]. Có nhiều báo cáo cho rằng các TBT GV còn nhiều tế bào cumulus bao quanh, làm cho các chất bảo vệ lạnh khó thấm vào bên trong tế bào, từđó ảnh hưởng đến sự phát triển các giai đoạn về sau [39, 138].
- Nhóm nghiên cứu của Kim và cs. (2007) tiến hành bảo quản TBT bò GV bằng phương pháp thủy tinh hóa vi giọt qua 2 bước, chất bảo vệ lạnh là DMSO kết hợp với EG và 0,5M sucrose. Khi cân bằng 3 phút và 5 phút ở bước 1 thu được 41,1% và 27,4% TBT chín sau khi nuôi, tương ứng (P < 0,05). Khi cân bằng 3 phút
ở bước 1 và 1 phút ở bước 2 thu được tỉ lệ chín sau khi nuôi là 44,4% [79]. Nhóm này cho rằng tỉ lệ chín của TBT chưa cao như lô TBT tươi (71,2%) là do khe nối giữa TBT và cumulus đã bị tổn thương trong quá trình bảo quản lạnh. TBT GV rất nhạy cảm với sự thay đổi của nhiệt độ, áp suất từđó làm cho cấu trúc bên trong của TBT, đặc biệt là vi ống, vi sợi có những thay đổi về cấu trúc. Từđó ảnh hưởng đến sự trưởng thành của TBT [48].
- Nhóm nghiên cứu của Yamada và cs. (2007) tiến hành bảo quản TBT bò GV bằng cọng rạ, chất bảo vệ DMSO kết hợp với EG, cân bằng 10 phút trong bước 1 và 30 giây trong dung dịch thủy tinh hóa (bước 2). Kết quả thu được tỉ lệ chín đạt 29,2%. Nhóm này cho rằng thời gian tiếp xúc trong dung dịch thủy tinh hóa càng lâu (trên 60 giây) sẽảnh hưởng xấu đến sự phát triển của TBT về sau. Chính phức hợp TBT - cumulus là một tác nhân tác động xấu đến sự cân bằng các chất bảo vệ
lạnh giữa môi trường nội bào và ngoại bào [150]. TBT là một tế bào đơn rất lớn, có tỉ lệ bề mặt/thể tích nhỏ, có các cumulus bao quanh nên hạn chế sựđi vào của các chất bảo vệ lạnh, từđó ảnh hưởng đến sự phát triển tiếp theo của TBT [95].
- Theo Prentice (2010), tỉ lệ chín của TBT giai đoạn GV sau khi nuôi đạt 16% so với lô không đông lạnh là 61% (P < 0,001). Khi sử dụng cryotop làm vật mang, tỉ
tiếp xúc của tế bào với nồng độ thấp hơn của chất bảo vệ lạnh (VS1) trước khi chuyển chúng sang nồng độ cao (VS2) có thể có khả năng làm giảm tác dụng độc hại của chất bảo vệ lạnh [107]. Việc cân bằng của TBT trong VS1, chứa một nửa nồng độ chất bảo vệ lạnh của VS2, thường được khuyến cáo trước khi thủy tinh hóa [110]. Điều này sẽ cung cấp cho các TBT các nguyên tố nhằm giảm thiểu sốc về độc do nồng độ cao của chất bảo vệ lạnh trong VS2. Hơn nữa, việc cân bằng được cho là để điều chỉnh tính thấm của màng tế bào, giúp duy trì kết nối giữa các TBT và tế bào cumulus, và có thể hỗ trợ trong việc tránh các thay đổi áp suất thẩm thấu một cách nhanh chóng [25].
- Nhóm nghiên cứu của Hajarian và cs. (2011) tiến hành khảo sát các dung dịch thủy tinh hóa và các vật mang là cọng rạ và cryotop. Họ đã chứng minh rằng dung dịch bảo vệ lạnh cryotop (7,5% DMSO + 7,5% EG (bước 1) và 15% DMSO + 15% EG + 0,5M sucrose (bước 2)) thu được tỉ lệ chín là 36,2% (từ cryotop) và 29,5% (từ cọng rạ) [64]. Nhóm này cũng cho thấy các chất bảo vệ lạnh được sử
dụng khi dùng vật mang là cryotop ít gây độc đối với TBT GV hơn so với cọng rạ
[104].
Tóm lại, cùng nuôi trong môi trường N2 nhưng ởđợt thí nghiệm 2 đã cho tỉ lệ chín cao hơn so với trong đợt 1. Kết quả này đã phần nào khẳng định được kỹ thuật, thao tác của chúng tôi ngày càng hoàn thiện dần và đây chính là những kết quả khởi đầu của hướng nghiên cứu này ở nước ta.
3.7. KẾT QUẢ THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM TỪ CÁC TẾ BÀO TRỨNG GV ĐÔNG LẠNH ĐƯỢC NUÔI CHÍN IN VITRO TRỨNG GV ĐÔNG LẠNH ĐƯỢC NUÔI CHÍN IN VITRO
Tiến hành IVF từ các TBT GV được đông lạnh bằng cọng rạ (CR), đông lạnh bằng vi giọt (VG); từ nguồn TBT tươi làm đối chứng (ĐC). Kết quả thể hiện ở Bảng 3.19.
Bảng 3.19. Kết quả IVF từ TBT GV đông lạnh được nuôi chín in vitro Nguồn TBT từ Số TBT đem thụ tinh
Tỉ lệ (%) các giai đoạn phát triển của phôi Phôi 2 tế bào 8-16 tế bào Dâu Nang
CR 179 15,64 ± 2,72 a (28) 9,50 ± 2,19a (17) 3,35 ± 1,35a (6) 1,12 ± 0,79a (2) VG 111 12,61 ± 3,15 a (14) 7,21 ± 2,45a (8) 2,70 ± 1,54a (3) 00,00 (0) ĐC 123 51,22 ± 4,51 b (63) 36,59 ± 4,34b (45) 25,20 ± 3,91b (31) 18,70 ± 3,52b (23)
a, b, c thể hiện sự khác biệt theo cột, có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95%
Tiến hành thụ tinh cho 179 TBT (từcọng rạ) qua 6 đợt thí nghiệm lặp lại, có 28 TBT được thụ tinh (phôi 2 tế bào), đạt tỉ lệ 15,64 ± 2,72%. Trong khi đó, có 14/111 TBT được đông lạnh bằng vi giọt thụ tinh, đạt tỉ lệ 12,61 ± 3,15%; còn ở lô
đối chứng (không qua đông lạnh) có tỉ lệ thụ tinh đạt 51,22 ± 4,51%. Tỉ lệ phôi phát triển đến giai đoạn 8-16 tế bào, phôi dâu, phôi nang ở lô cọng rạ lần lượt là 9,50%; 3,35% và 1,12%. Ở lô vi giọt và lô đối chứng, tỉ lệ này lần lượt là 7,21%; 2,70%; 00,00% và 36,59%; 25,20%; 18,70%, tương ứng.
BÀN LUẬN
Tỉ lệ thụ tinhở lô cọng rạ cao hơn lô vi giọt (15,64% so với 12,61%), sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê P > 0,05), nhưng cả 2 lô đều thấp hơn rất nhiều so với lô ĐC từ 3-4 lần (P < 0,001). Tỉ lệ thụ tinh trong thí nghiệm của chúng tôi
thấp hơn rất nhiều so với kết quả của Vieira và cs. (2002; 49%) [143], Abe và cs. (2005; 37,7%) [16], Kim và cs. (2007; 55,7%) [79], Prentice (2010; 42% ở nhóm không cần bằng và 59% ở nhóm cân bằng) [118]. Tuy nhiên, kết quả của chúng tôi
cao hơn so với công bố của Mastumoto và cs. khi dùng vật mang là lưới nylon (2001; 7%) [97].
Sự phát triển của phôi: ở lô cọng rạ chỉ có 1,12% (2 phôi) phát triển đến giai đoạn phôi nang, trong đó chỉ có ở lần thí nghiệm 5 và 6 (xem phụ lục). Ở lô vi giọt
chưa có phôi nào phát triển đến giai đoạn phôi nang. Trong các nghiên cứu hiện nay
đều cho thấy tỉ lệ thụ tinh và sự phát triển về sau của phôi từ các TBT GV đã được thủy tinh hóa giảm rất nhiều so với nhóm đối chứng (TBT tươi). Những phát hiện này giúp chúng tôi tìm cách cải tiến phương pháp thủy tinh hóa nhằm nâng cao tỉ lệ
thụ tinh trong ống nghiệm từ các nguồn TBT này. Quá trình làm lạnh và giải đông có ảnh hưởng xấu đến khả năng phát triển của phôi về sau.
Tỉ lệ thụ tinh và phát triển của phôi từ các TBT GV được thủy tinh hóa còn thấp là do nhiều nguyên nhân. TBT có cấu trúc phân tử phức tạp, một trong số cấu trúc này là các sợi trục của thoi vô sắc trong quá trình giảm phân rất nhạy cảm với nhiệt độ thấp, áp suất thẩm thấu và số lượng các ion (ionic strength) [55, 79, 154]. Các nghiên cứu trước đây cho thấy việc tiếp xúc của các TBT giai đoạn GV với các chất bảo vệ lạnh hoặc sự thủy tinh hóa làm cho hình dạng của thoi vô sắc, cấu trúc NST và sự phân bố của vi sợi bất thường nhiều hơn sau khi nuôi chín trong ống nghiệm. Các bất thường về tế bào học có thểảnh hưởng không tốt đến sự phát triển của phôi sau khi thụ tinh [79]. Kết quả của Kim và cs. (2007) chỉ có 2,3% phát triển
đến giai đoạn phôi nang [79]; của Abe và sc. (2005) có 8% phát triển đến phôi nang khi dùng chất bảo vệ là EG kết hợp với Ficoll và sucrose, nhưng khi thay sucrose bằng trehalose thì không có phôi nào phát triển đến giai đoạn phôi nang [16].
Trong quá trình thực hiện thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy tỉ lệ thụ tinh thấp là do những nguyên nhân sau:
(i) TBT ở giai đoạn GV sau khi được thủy tinh hóa thường dễ bị bong tróc lớp tế bào cumulus, bị tổn thương cấu trúc phân tử, vì vậy ảnh hưởng đến tỉ lệ chín sau khi IVM, từđó ảnh hưởng tới tỉ lệ thụ tinh và phát triển về sau của phôi;
(ii) Chất lượng TBT chưa đồng đều về mặt di truyền, độ tuổi nên đã ảnh hưởng không nhỏđến tỉ lệ thụ tinh và phát triển về sau của phôi. Theo Nguyễn Văn Lý (2006) [5], Khurana và cs. (2000) [78], khi sử dụng TBT loại A và B có thể thu
được tỉ lệ thụ tinh 71,4-87,9%. Tuy nhiên, tỉ lệ thụ tinh ở lô đối chứng (không qua thủy tinh hóa) chỉ đạt 51,22%. Kết quả này cho thấy, chất lượng TBT ở các lô thí nghiệm này chưa thực sựđồng đều. Điều này có thể khắc phục được bằng cách chỉ
chọn những TBT GV sau khi giải đông có đủ từ 3-5 lớp tế bào cumulus bao quanh mới sử dụng cho nuôi chín in vitro. Tuy nhiên, một thực tế là các TBT GV sau khi giải đông thường rất dễ bị bong tróc các lớp cumulus. Chính vì vậy, nó đã góp phần
ảnh hưởng đến tỉ lệ chung của thí nghiệm;
(iii) Môi trường nuôi cấy và mật độ phôi có ảnh hưởng đến sự phát triển các giai đoạn phôi tiếp theo đối với các phôi tạo ra trong ống nghiệm. Môi trường IVF trong thí nghiệm dùng là môi trường BO, môi trường nuôi phôi là CR1aa. Mật độ từ
15-20 phôi trong 100 µl/vi giọt. Theo Bavister và cs. (1995) [30], khi chọn mật độ
nuôi thích hợp thì có thể do các tế bào cumulus đi cùng với phôi tiết các chất dinh