Bảng 3.4. Kết quả IVF từ TBT MII đông lạnh theo quy trình 1
Lô
Số TBT
đem thụ
tinh
Tỉ lệ các giai đoạn phát triển của phôi (%)
Phôi 2 TB Phôi 8-16 TB Phôi dâu Phôi nang
TN 781 12,93 ± 1,2a (101) 11,01 ± 1,12a (86) 5,76 ± 0,83a (45) 3,71 ± 0,68a (29) ĐC 316 53,48 ± 2,81b (169) 46,84 ± 2,81b (148) 35,44 ± 2,69b (112) 26,27 ± 2,48b (83)
Hình 3.5. Các giai đoạn chính của phôi tạo ra từ TBT MII đông lạnh
(a) phôi 2 tế bào, (b) phôi 8-16 tế bào, (c) phôi dâu và (d) phôi nang
Tiến hành thụ tinh cho 781 TBT MII sống tốt sau khi giải đông qua 10 lần thí nghiệm, chỉ có 101 TBT được thụ tinh-giai đoạn phôi 2 tế bào, đạt tỉ lệ12,93 ± 1,2%. Trong khi đó, có tới 169/316 TBT thụ tinh ở lô đối chứng (TBT không trải qua bảo quản lạnh), đạt tỉ lệ 53,48 ± 2,81%. Tỉ lệ thụ tinh ở lô đối chứng cao hơn lô thí nghiệm 40,55% (P < 0,001). Tỉ lệ phôi phát triển đến giai đoạn 8-16 tế bào, phôi dâu, phôi nang ở lô thí nghiệm và lô đối chứng lần lượt là 11,01 ± 1,12% so với 46,84 ± 2,81%; 5,76 ± 0,83% so với 35,44 ± 2,69% và 3,71 ± 0,68% so với 26,27 ± 2,48%, sự
khác biệt này đều rất có ý nghĩa về mặt thống kê (P < 0,001). Cụ thể, tỉ lệ phôi 8-16 tế bào ở lô đối chứng cao hơn lô thí nghiệm 35,82%; tỉ lệ phôi dâu ở lô đối chứng cao hơn lô thí nghiệm 29,68%; tỉ lệ phôi nang ở lô đối chứng cao hơn lô thí nghiệm 22,55% (xem phụ lục 3, 3.1.1).
Xét sự chuyển tiếp của phôi từ giai đoạn phôi 8-16 tế bào lên phôi dâu và từ
phôi dâu lên phôi nang ở từng lô, kết quả thể hiện ở Bảng 3.5.
(a) (b)
(c) (d)
(X20) (X20)
Bảng 3.5. So sánh sự chuyển tiếp của phôi 8-16 tế bào lên phôi dâu và từ phôi dâu lên phôi nang
Lô
Số phôi các giai đoạn Tỉ lệ chuyển tiếp của phôi (%)
Phôi 8-16
tế bào Phôi dâu Phôi nang
Phôi 8-16 tế bào lên phôi dâu Phôi dâu lên phôi nang Chỉ số P theo hàng TN 86 45 29 52,33 64,44 0,092 ĐC 148 112 83 75,68 74,11 0,614 Chỉ số P theo cột 0,00025 0,226
Ở lô thí nghiệm có 52,33% phôi từ giai đoạn 8-16 tế bào chuyển tiếp lên phôi dâu và 64,44% phôi dâu phát triển lên phôi nang, tỉ lệ chuyển tiếp của phôi ở hai mốc giai đoạn này khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05). Ở lô đối chứng có 75,68% phôi từ giai đoạn 8-16 tế bào chuyển tiếp lên phôi dâu và 74,11% phôi dâu phát triển lên phôi nang, tỉ lệ chuyển tiếp của phôi ở hai mốc giai đoạn này khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05). Khi so sánh giữa lô đối chứng và lô thí nghiệm, sự chuyển tiếp từ giai đoạn phôi 8-16 tế bào lên phôi dâu ở lô đối chứng cao gấp 1,45 lần lô thí nghiệm (P < 0,001); trong khi sự chuyển tiếp từ giai đoạn phôi dâu lên phôi nang sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05). Kết quả
này cho thấy, các TBT MII sau khi trải qua bảo quản lạnh và giải đông đem IVF bị “block” ở giai đoạn 8-16 tế bào chuyển lên phôi dâu nhiều hơn so với các TBT MII chưa trải qua bảo quản lạnh. Đây là kết quả tất yếu, vì phôi bò thường bị “block” ở
giai đoạn 8-16 tế bào, nên đối với phôi tạo ra từ TBT đông lạnh sự phân chia của phôi thường thấp hơn nhiều so với phôi tạo ra TBT chưa qua đông lạnh.
BÀN LUẬN
Kết quả của Albarracin và cs. (2005), tỉ lệ thụ tinh từ TBT MII sau khi được thủy tinh hóa chỉ đạt 12,6% và không có phôi nào phát triển đến giai đoạn phôi nang; trong khi đó ở lô TBT tươi đạt 73,9% và 10,1%, tương ứng. Nhóm này cũng
sử dụng quy trình thủy tinh hóa 2 bước, dùng cọng rạ kéo mở (OPS) làm vật mang, chất bảo vệ lạnh là EG và DMSO, môi trường thụ tinh là Tyrode bổ sung 25 mM natri bicarbonat, 22 mM Na-lactate, 1 mM Na-pyruvate, 6 mg/ml BSA và 10 mg/ml heparinsodium (Calbiochem, Darmstadt, Germany); môi trường nuôi phôi là SOF [20]. Nhóm này cho rằng kết quả đạt được chống lại (withstand) với quy trình bảo quản lạnh TBT và hiện tượng sốc thẩm thấu (osmotic shock) làm ảnh hưởng đến sự
thành công của quy trình này. Kết quả của nhóm này cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đó: các giai đoạn phát triển của TBT cũng đáp ứng khác nhau đối với sự
sốc nhiệt và TBT ở giai đoạn MII ít nhạy cảm với tổn thương lạnh nhất (Fuku và cs., 1995 [55]; Zeron và sc., 1999 [154]). Nhóm nghiên cứu cũng cho thấy sự thủy tinh hóa đã ảnh hưởng đến sự sắp xếp lại tổ chức của thoi vô sắc trong quá trình giảm phân, từđó ảnh hưởng đến các giai đoạn phát triển về sau của phôi.
Theo công bố của Anchamparuthy (2007), tỉ lệ thụ tinh, phôi dâu và phôi nang từ các TBT bò MII đông lạnh là 42,8%, 16,6% và 7,0% so với 64,7%, 43,7% và 26,9% ở lô đối chứng, tương ứng. Nghiên cứu này sử dụng quy trình thủy tinh hóa
bậc thang (stepwise) và sử dụng vật mang là lưới nylon (nylon mesh), chất bảo vệ lạnh là EG và Ficoll. Kết quả cho thấy, các TBT có kích thước nang trung bình (4-10mm) có tỉ lệ phát triển phôi cao hơn sau khi được thủy tinh hóa [24]. Trong thí nghiệm của chúng tôi sử dụng các TBT thu từ các nang có đường kính trung bình từ 3-8mm, có thể vì thế kết quả của chúng tôi thấp hơn so với kết quả của Anchamparuthy.
Byoung-Chul Yang và cs. (2008) với 20,6% phôi hai tế bào và 0,9% phát triển
đến phôi nang so với lô TBT tươi là 36% và 4,8%, tương ứng [151]. Nhóm tác giả
này đã tiến hành loại bỏ cumulus trước khi thực hiện IVF, nên có thể gia tăng khả
năng xâm nhập của tinh trùng vào TBT, làm tăng tỉ lệ thụ tinh. Tuy nhiên, nhóm này cũng làm một thí nghiệm so sánh sự hình thành hai tiền nhân giữa nhóm TBT tươi và TBT đã qua đông lạnh. Kết quả cho thấy tỉ lệ hình thành hai tiền nhân ở
nhóm TBT đã qua đông lạnh thấp hơn rất nhiều so với nhóm TBT tươi (21,7% so với 59,9%, tương ứng); tỉ lệ một tiền nhân ở nhóm TBT đông lạnh cao hơn rất nhiều
so với nhóm TBT tươi (70,6% so với 23,3%, tương ứng); có 7,74% ở nhóm TBT
đông lạnh xuất hiện 3 tiền nhân. Kết quả của nhóm này cũng phù hợp với các công bố trước đó: các TBT bị loại bỏ cumulus sẽ làm giảm khả năng hình thành hai tiền nhân và gia tăng hiện tượng đa tinh trùng (Behalova và cs, 1993 [32]). Đồng thời nhóm này cũng cho rằng tỉ lệ thụ tinh và phát triển của phôi thấp là do các TBT ở
giai đoạn MII rất khó bảo quản lạnh, sau khi giải đông màng trong suốt thường bị
xơ cứng, hoặc cấu trúc vi ống, vi sợi, ti thể bị tổn thương. Chính các yếu tố này đã làm giảm tỉ lệ thụ tinh và phân chia của phôi về sau.
Tỉ lệ phôi nang ở lô TN của chúng tôi chỉđạt 3,71%, thấp hơn các nghiên cứu
đã được công bố đối với TBT bò giai đoạn MII được thủy tinh hóa khi sử dụng vật mang là cryoloop (Luster: 10% (2004) [92]; Checura và Siedel: 8,7% (2007 [40]); khi sử dụng vật mang là cọng rạ kéo mở, Checura và Siedel (2007) thu được 5,3%; Morato và cs., 2008b sử dụng vật mang là cryotop thu được 5,3% [104]; Sripunya và cs., 2010 sử dụng vật mang là cryotop thu được 8,7%, còn thủy tinh hóa trên bề
mặt rắn thu được 9,8% [133]. Tương tự, khi thủy tinh hóa sử dụng vật mang là cọng rạ, Hochi và cs., 1998 [66] thu được 4,8% phôi phát triển đến giai đoạn phôi nang. Như vậy, tỉ lệ phát triển đến giai đoạn phôi nang của các TBT MII sau khi được bảo quản lạnh đạt thấp có thểmột phần do yếu tố vật mang chi phối. Các vật mang khi nạp TBT lên với một thể tích chất bảo vệ cực nhỏ (1-2µl) như cryotop, cryoloop thường cho tỉ lệ thụ tinh cao hơn so với các vật mang như cọng rạ. Bên cạnh đó, các tác giả này đều cho rằng sự hiện diện của tế bào cumulus bao quanh TBT quyết
định đến sự trưởng thành hoàn toàn của TBT và khả năng phát triển về sau. Zhang và cs., 1995 [155] chưa chú ý đến vai trò của các tế bào cumulus. Theo Parks và cs., 2001 [111], tế bào cumulus rất có lợi trong việc bảo vệ TBT tránh khỏi sốc thẩm thấu khi các chất bảo quản lạnh bị cô đặc hay pha loãng, ngăn sự hóa cứng cấu trúc xung quanh TBT, ngăn sự tổn thương theo hình thái.
Ở thí nghiệm của chúng tôi, tỉ lệ thụ tinh được tính từ giai đoạn phôi 2 tế bào thay vì giai đoạn hai tiền nhân. Theo các nghiên cứu được công bố cho thấy khi tiếp
xúc với các chất bảo vệ lạnh có thể làm nguy cơ tăng lượng Ca2+ nội bào, từđó gây ra hiện tượng bài xuất sớm các vật liệu của hạt vỏ [83]. Lớp nguyên liệu này chứa enzyme làm màng trong suốt trở nên dày hơn, vì vậy, tinh trùng xuyên qua màng trong suốt khó khăn hơn [62]. Tỉ lệ phát triển của phôi về sau trong nghiên cứu của chúng tôi chưa cao như các công bố ở thế giới. Theo Gosden (2005), trở ngại đầu tiên là TBT có độ nhạy cao với việc làm lạnh (đặc biệt là ở TBT người và TBT bò), một phần là do thoi vô sắc mỏng manh và lượng lipid bên trong tế bào cao [28, 62]. Khi TBT bò được làm lạnh tại ở nhiệt độ phòng thì sự sống của chúng bị giảm đi một cách đáng kể [94, 127].
Mặc dù các nghiên cứu về IVF ở TBT bò đông lạnh đã và đang được nghiên cứu rất nhiều ở các nước, song ở nước ta, thí nghiệm này là một trong số ít nghiên cứu khởi đầu. Kết quả đạt được đã khẳng định sự thành công trong việc bảo quản lạnh TBT bò giai đoạn MII bằng phương pháp thủy tinh hóa.