Đánh giá theo hình thái
Bảng 3.10. Kết quảđông lạnh TBT GV Vật mang Số TBT đem đông lạnh Tỉ lệ TBT thu hồi (%) Tỉ lệ TBT sống/ĐL (%) Tỉ lệ TBT sống/thu hồi (%) Cọng rạ 2288 95,54 ± 0,43 a (2186 TBT) 66,22 ± 0,99a (1515 TBT) 69,30 ± 0,99 a Vi giọt 2151 97,49 ± 0,34 b (2097 TBT) 73,18 ± 0,96b (1574 TBT) 75,06 ± 0,94 b
a,b: khác nhau theo cột, có ý nghĩa thống kê ởđộ tin cậy 95%
Ở thí nghiệm bảo quản TBT bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ: có
2.288 TBT được bảo quản lạnh qua hai đợt thí nghiệm (đợt 1: 8 lần lặp lại với tổng cộng 760 TBT; đợt 2: 6 lần lặp lại với tổng cộng 1528 TBT, xem phụ lục 3, mục 4.1). Sau khi giải đông đã thu hồi được 2.186 TBT, đạt tỉ lệ 95,54 ± 0,43%. Có 1.515 TBT sống theo hình thái sau giải đông, đạt tỉ lệ 66,22 ± 0,99% trên tổng số
TBT đem đông lạnh và 69,30 ± 0,99% trên tổng số TBT thu hồi.
Ở thí nghiệm bảo quản TBT bằng phương pháp thủy tinh hóa trong vi giọt, đã tiến hành trên 2.151 TBT (đợt 1: 8 lần lặp lại với tổng cộng 723 TBT; đợt 2: có 6 lần lặp lại với tổng cộng 1.428 TBT, xem phụ lục 3, mục 4.1). Sau khi giải đông đã thu hồi được 2.097 TBT, đạt tỉ lệ 97,49 ± 0,34%. Trong đó có 1.574 TBT sống theo hình thái, đạt tỉ lệ 73,18 ± 0,96% so với tổng số TBT đem đông lạnh và 75,06 ± 0,94% so với tổng số TBT thu hồi.
Đánh giá theo nhuộm
Kết quả đánh giá theo phương pháp nhuộm AO/PI được thể hiện trong Hình 3.8 và Bảng 3.11.
Hình 3.8. Kết quả nhuộm AO/PI (X20)
(a): TBT sống; (b) TBT: chết
Bảng 3.11. Kết quảđánh giá theo phương pháp nhuộm AO/PI
Nguồn TBT từ Số TBT đem nhuộm Số TBT sống Tỉ lệ sống Cọng rạ 186 98 52,69 ± 3,66%ab Vi giọt 180 87 48,33 ± 3,72%a Đối chứng 182 131 71,98 ± 3,3%c
a, b, c: khác nhau theo cột có ý nghĩa thống kê ởđộ tin cậy 95%
Từ Bảng 3.11 cho thấy tỉ lệ TBT sống theo đánh giá bằng phương pháp nhuộm từ cọng rạđạt 52,69 ± 3,66% (98/186); từ vi giọt đạt 48,33 ± 3,72% (87/180); ở lô
đối chứng đạt 71,98 ± 3,3% (131/182). Như vậy, tỉ lệ sống theo phương pháp nhuộm giữa nguồn TBT được bảo quản lạnh bằng cọng rạ và vi giọt không có sự
khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05), nhưng cả hai nhóm thí nghiệm đều thấp so lô
BÀN LUẬN
Tỉ lệ thu hồi khi thủy tinh hóa bằng cọng rạ thấp hơn so với thủy tinh hóa bằng vi giọt (P < 0,001). Kết quả này cho thấy khả năng mất TBT sau khi bảo quản lạnh theo phương pháp thủy tinh hóa bằng vi giọt là ít hơn, và sự thất thoát này cũng không đáng kể (khoảng 2,51%). Ở cả hai phương pháp này đều cho tỉ lệ thu hồi cao (trên 95%). Điều này chứng tỏkhả năng thu hồi TBT khi đông lạnh ở giai đoạn GV cao hơn hẳn so với đông lạnh ở giai đoạn MII (95,54 ± 0,43% so với 81,84 ± 1,03%, tương ứng). Kết quả này có phần thấp hơn nghiên cứu của Anchamparuthy và cs. (99,30%; 2007 [24]) khi thủy tinh hóa sử dụng vật mang là lưới nylon (nylon mesh). Hiện nay, các nghiên cứu trên thế giới đều thu hồi TBT sau giải đông đạt 95- 100%. Như vậy, kết quả thu hồi TBT sau giải đông trong thí nghiệm của chúng tôi là khá cao. Vẫn còn một lượng nhỏ TBT (2,51%) thất thoát trong quá trình thu hồi, nguyên nhân chủ yếu là do bọt khí của các vi giọt trong quá trình thao tác làm che khuất tầm nhìn. Đây là hạn chế về mặt kỹ thuật, và đã được khắc phục dần ở các lần thí nghiệm về sau (xem phụ lục 3, mục 4.1).
Tỉ lệ TBT sống theo hình thái sau giải đông ở phương pháp thủy tinh hóa bằng
vi giọt cao hơn thủy tinh hóa trong cọng rạ (P < 0,001). Kết quả này phù hợp với lí thuyết của Dinnyes, 2000 [49]. Dinnyes cho rằng cọng rạ tạo một lớp cách nhiệt giữa môi trường chứa TBT và nitơ lỏng nên làm giảm tốc độ làm lạnh, sự thủy tinh hóa có thể không hoàn toàn nên ảnh hưởng đến khả năng sống của TBT sau giải
đông. Ngược lại, với phương pháp thủy tinh hóa trong vi giọt, môi trường chứa mẫu
được tiếp xúc trực tiếp với nitơ lỏng nên khắc phục được nhược điểm của thủy tinh hóa trong cọng rạ. Do vậy mà tỉ lệ TBT sống sau giải đông có phần cao hơn. Kết quả thí nghiệm của chúng tôi còn thấp hơn so với các nghiên cứu được công bố: Abe và cs. (2005) thủy tinh hóa TBT bò giai đoạn GV bằng lưới nylon, sử dụng chất bảo vệ là EG và Ficoll-70, dùng quy trình cân bằng một bước (single step) và bậc thang (step-wise), thu được tỉ lệ sống theo hình thái lần lượt là 98% và 96,8% [16]; Kim và cs. (2007) tiến hành thủy tinh hóa TBT bò giai đoạn GV bằng vi giọt,
dùng chất bảo quản lạnh là EG kết hợp với DMSO, cân bằng 3 phút và 5 phút có tỉ
lệ sống theo hình thái lần lượt là 80,9% và 84,0% [79]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi chưa cao, điều này có thểđược giải thích như sau:
(i) Chất lượng TBT không ổn định ở các lần thí nghiệm như đã trình bày ở
phần đông lạnh TBT MII;
(ii) Phương pháp thủy tinh hóa đòi hỏi sự chính xác về thời gian. TBT chỉ tiếp xúc với các dung dịch thủy tinh hóa trong vòng vài giây (45 giây trong môi trường cân bằng và 25 giây trong dung dịch thủy tinh hóa). Bên cạnh đó, thao tác đông lạnh và giải đông bằng vi giọt còn khá mới, đều làm cho thời gian chuyển TBT giữa các môi trường không đảm bảo, gây ảnh hưởng không tốt đến khả năng sống của TBT. Sự khử nước bên trong TBT xảy ra trong suốt quá trình đông lạnh rất cần cho khả
năng sống của TBT sau giải đông. TBT hình cầu nên tỉ lệ diện tích bề mặt trên thể
tích của TBT thấp, dẫn đến lượng nước mất không hoàn toàn trong quá trình khử
nước [71, 118]. Sử dụng phương pháp thủy tinh hóa tránh được sự hình thành tinh thể đá nội bào nhờ thay đổi thành phần nội bào từ pha lỏng sang pha rắn như thủy tinh, xảy ra một cách nhanh chóng. Khi thời gian xử lí TBT trong dung dịch thủy tinh quá lâu trong nồng độ quá cao của các chất bảo vệ lạnh cũng có khả năng gây
độc và ảnh hưởng đến tỉ lệ sống của TBT;
(iii) Quy trình đông lạnh thường đòi hỏi tế bào tiếp xúc với một hay nhiều chất bảo vệ lạnh với nồng độ cao, nồng độ các chất này đặc biệt cao ở phương pháp thủy tinh hóa. Việc thêm chất bảo vệ lạnh với nồng độ cao sẽ làm dung dịch ngoại bào
ưu trương hơn nhiều. Kết quả là khi tế bào tiếp xúc với dung dịch này, sẽ có khuynh hướng lệch thể tích, có thể làm tổn hại đến màng và ảnh hưởng đến khả năng sống của TBT. Quy trình đông lạnh trong thí nghiệm của chúng tôi có sử dụng thuyền giấy bạc thay cho bề mặt rắn như các thí nghiệm ở nước ngoài, dùng chất bảo vệ
lạnh là EG kết hợp với DMSO và sucrose. Nồng độ sucrose sử dụng là 0,5M giống với Kim và cs. (2007), trong khi đó Abe và cs. (2005) sử dụng 0,3M. Việc sử dụng sucrose đã được chứng minh là không gây độc cho TBT và phôi khi sử dụng ở nồng
độ cao (1M/lít) [55]. Ở đây thể tích của dung dịch thủy tinh hóa chứa TBT rất quan trọng. Đối với vi giọt, thể tích càng nhỏ càng tốt (1-2 µl), nhưng trong thí nghiệm của chúng tôi có thể chưa đạt được thể tích chuẩn xác như vậy, mà thể tích có thể
lớn hơn (2-4µl). Điều này góp phần ảnh hưởng đến kết quả chung của thí nghiệm.
Tỉ lệ sống theo phương pháp nhuộm AO/PI khi dùng cọng rạ hay vi giọt đều khác biệt so với lô đối chứng. Khi so sánh riêng từng cặp cho thấy tỉ lệ sống theo hình thái và theo phương pháp nhuộm ở lô cọng rạ, ở lô vi giọt đều có sự cách biệt
đáng kể: 52,69% so với 66,22% và 48,33% so với 71,18%, P < 0,001, tương ứng (xem phụ lục 3, mục 4.2.2); riêng cặp thí nghiệm (ở lô cọng rạ và lô vi giọt) sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05). Nguyên nhân có thể là do thao tác nhuộm TBT: TBT phải được làm sạch cumulus trước khi nhuộm và được rửa nhiều lần trước và sau khi nhuộm (khoảng 6 lần), chính điều này có thểđã làm tổn thương màng TBT, gây chết TBT. Bên cạnh đó, trong quá trình nhuộm, TBT tiếp xúc với chất nhuộm độc với tế bào khá lâu (1 giờ). Do đó, có thể TBT chết dần trong quá trình nhuộm làm kết quả đánh giá theo phương pháp này giảm xuống đáng kể. Mặt khác, nồng độ sucrose của môi trường thủy tinh hóa sử dụng trong thí nghiệm là 0,5M, thấp hơn so với các thí nghiệm của các tác giả khác (1M). Có thể với nồng độ đường thấp, TBT chưa loại bỏ hết nước bên trong, nên khi giải đông, hình thái TBT vẫn tròn, giống như hình thái TBT sau giải đông được đánh giá là sống qua hình thái, gây nhầm lẫn trong đánh giá. Ngoài ra, có thể các TBT trong quá trình bảo quản lạnh đã bị apoptosis, nhưng khi đánh giá bằng hình thái vẫn chưa nhận biết được do hình dạng còn tròn đều, nên dẫn đến tỉ lệ sống theo đánh giá bằng phương pháp nhuộm có sự cách biệt so với hình thái. Điều này cũng hợp lí, vì TBT rất khó bảo quản và tỉ lệ thụ tinh của đối tượng này thường rất thấp. Hiện nay, trong nước chưa có công trình nghiên cứu nào về bảo quản lạnh TBT bò sử dụng phương pháp đánh giá này. Vì vậy, kết quảđánh giá chỉ mang tính khởi đầu.
Tóm lại, tỉ lệ thu hồi và tỉ lệ sống của TBT sau giải đông ở giai đoạn GV trong thí nghiệm này nằm trong khoảng tương đối cao.