Thụ tinh trong ống nghiệm được thực hiện theo phương pháp của các nhà khoa học Nhật Bản (Japan Livestock Technology Association [76], có cải biến.
Bước 1: Chuẩn bị TBT
Chuẩn bị các vi giọt (100µl/vi giọt) môi trường BO bổ sung 10mg/ml BSA, có phủ dầu khoáng trong đĩa petri nhựa ɸ35mm để rửa các TBT trước khi cho vào vi giọt thụ tinh; chuẩn bị các vi giọt (100µl/vi giọt) môi trường IVM, N2 có phủ dầu khoáng trong đĩa petri nhựa ɸ35mm giữ các TBT trước khi cho vào vi giọt thụ tinh. (chuẩn bị ít nhất 2 giờ trước khi sử dụng, nhưng không quá 24 giờ).
Đối với các TBT MII được bảo quản lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa sẽ được giải đông (xem 2.3.5.1), đánh giá theo hình thái. Các TBT được cho là sống theo hình thái sau khi giải đông được nuôi trong vi giọt chứa môi trường nuôi IVM (TCM-199 + 10% FBS + 10ng/ml EGF + 0,2mM Natri pyruvate + 50µg/ml Gentamicin) khoảng 2-3 giờ trong tủấm ở điều kiện 38,5oC, 5% CO2, hơi nước bão hòa. Đối với các TBT GV được bảo quản lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa sẽ được giải đông (xem 2.3.5.1), đánh giá theo hình thái. Các TBT được cho là sống theo hình thái sau khi giải đông được nuôi trong vi giọt chứa môi trường nuôi N2 (tương ứng với môi trường khảo sát) khoảng 20-24 giờ trong tủ ấm ở điều kiện 38,5oC, 5% CO2, hơi nước bão hòa. Chọn các TBT chín để trong các vi giọt chứa môi trường nuôi cấy N2, chờ chuyển vào vi giọt thụ tinh. Cần tinh toán thời gian thích hợp để phù hợp với thời gian thực hiện IVF.
Chuẩn bị một lô thí nghiệm nuôi chín các TBT chưa qua đông lạnh đạt đến giai đoạn MII, để chuẩn bị IVF làm lô đối chứng. Tất cả các công đoạn này phải chuẩn bị trước khi chuẩn bị tinh trùng 1 giờ.
Bước 2: Chuẩn bị tinh trùng
Giải đông tinh trùng
Lấy 1-2 cọng rạ chứa tinh trùng khỏi bình nitơ lỏng, giữ trong không khí 5 giây. Giải đông cọng rạ trong nước ấm ở 35-37oC khoảng 30 giây. Sau đó, cắt một
đầu cọng rạ cho vào sát đáy ống falcon (loại 15ml), nhanh chóng cắt đầu còn lại và thổi nhẹđể chuyển toàn bộ tinh trùng vào đáy ống falcon.
Hoạt hóa tinh trùng
Tinh trùng sau khi giải đông được pha loãng và hoạt hóa trong môi trường BO (6ml) bổ sung sodium caffeine benzoate 0,3885 mg/ml và heparin 4 l/ml, sau đó li tâm lần thứ nhất 1800 vòng/phút trong 5 phút, hút bỏ phần trên, để lại phần dưới đáy khoảng 0,5 ml và huyền phù dịch này. Tiếp theo, tiến hành li tâm lần thứ hai với tốc
độ và thời gian như lần thứ nhất; phần lắng dưới đáy ống falcon được pha loãng bằng môi trường BO bằng cách cho thêm 0,5-0,8 ml dung dịch rửa tinh dịch (môi trường BO bổ sung sodium caffeine benzoate 0,3885mg/ml và heparin 4l/ml). Thể tích ban
đầu của dung dịch tinh trùng lúc này khoảng 0,6-0,8ml.
Kiểm tra sức đề kháng của tinh trùng bằng nước muối sinh lí 3% bằng cách hút 50µl dung dịch tinh trùng cho vào 4,95µl dung dịch nước muối sinh lí 3% và xác định mật độ tinh trùng bằng buồng đếm hồng cầu.
Điều chỉnh mật độ tinh trùng khoảng 25x106 tinh trùng/ml bằng cách thêm dung dịch pha loãng tinh trùng (môi trường BO bổ sung 20mg/ml BSA), tiếp tục pha loãng sao cho đạt mật độ 5-6x106 tinh trùng/ml (theo Otoi, 1998 [109]). Dịch huyền phù này dùng để tạo vi giọt thụ tinh trong đĩa 4 giếng (100µl/giọt), phủ dầu khoáng một phần vi giọt thụ tinh (500µl/giọt), giữ trong tủấm 38,5oC, 5% CO2.
Bước 3: Thụ tinh trong ống nghiệm
Các TBT đang được ủ trong các môi trường nuôi tương ứng sẽ được chuyển vào các vi giọt rửa TBT được chuẩn bị trong đĩa petri nhựa ɸ35mm. Chuyển 15-20 TBT chín vào mỗi vi giọt thụ tinh (có sẵn tinh trùng với thể tích 100µl/giọt) trong
đĩa 4 giếng có phủ dầu khoáng. Lưu ý, khi chuyển TBT, hút càng ít lượng môi trường nuôi TBT kèm theo thì càng tốt. Phủ dầu khoáng cho bao phủ hết vi giọt (thêm 500µl/giọt), đặt đĩa trên vào tủ nuôi ở 38,5oC; 5% CO2 trong 5-6 giờ. Sau đó, quan sát đánh giá kết quả thụ tinh.