Các TBT được nuôi trong 3 môi trường IVM1, IVM2 và IVM3. Sau 22-24 giờ
nuôi cấy, các TBT được đánh giá sự trưởng thành thông qua sự giãn nở của lớp cumulus và sự xuất hiện của thể cực thứ nhất (Hình 3.1).
Hình 3.1. Tế bào trứng bò
(a) - thu từ buồng trứng (X10); (b) - chín theo độ giãn nở cumulus và (c) - có thể cực thứ nhất sau khi IVM (X20)
Các TBT khi mới thu nhận từ buồng trứng có lớp tế bào cumulus nén chặt, dày (Hình 3.1a). Sau 22-24 giờ nuôi cấy, các TBT được đánh giá chín theo độ giãn nở
(b)
(c)
cumulus, tế bào cumulus giãn nở rộng (Hình 3.1b). Sau khi loại bỏ cumulus, một số
TBT thấy có xuất hiện thể cực thứ nhất, một số khác chưa xuất hiện thể cực thứ
nhất nhưng vẫn chưa thấy dấu hiệu của sự thoái hóa (Hình 3.1c). Kết quả nuôi trưởng thành TBT được trình bày trong Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả nuôi chín TBT trong ống nghiệm
Các loại môi trường nuôi Sốđợt TN Tổng số TBT đem nuôi Tỉ lệ (%) TBT chín IVM 1 10 2557 82,42 ± 0,73 (2085) IVM 2 10 980 82,24 ± 1,22 (806) IVM 3 6 2756 83,09 ± 0,71 (2290) P > 0,05
Tỉ lệ chín của TBT ở các môi trường IVM1 đạt 82,42 ± 0,73% (2085/2557); IVM2 đạt 82,24 ± 1,22% (806/980); IVM3 đạt 83,09 ± 0,71% (2290/2756). Nhìn chung tỉ lệ chín đạt từ82-83% và tương đối ổn định ở những lần thí nghiệm của cả
3 môi trường khảo sát (xem phụ lục 3, 1.1). Tỉ lệ chín của TBT ở cả 3 môi trường không có sự khác biệt (P > 0,05) (xem phụ lục 3, 1.1), như vậy, tỉ lệ chín của TBT khi nuôi ở 3 môi trường là tương đương nhau và chưa thấy ảnh hưởng của FCS và hCG lên kết quả nuôi chín TBT tươi. Ở môi trường IVM1, tiến hành loại bỏ
cumulus của 190 TBT chín theo sự giãn nở cumulus để khảo sát sự xuất hiện của thể cực thứ nhất. Kết quả có 154/190 TBT có thể cực, đạt tỉ lệ 81,05 ± 2,84%. Kết quả cho thấy tỉ lệ chín theo thể cực không có sự khác biệt so với tỉ lệ chín theo độ
giãn nở cumulus (P > 0,05) (xem phụ lục 3, 1.2). Như vậy, kết quả của chúng tôi
đánh giá tỉ lệ chín của TBT bò theo độ giãn nở cumulus và theo sự xuất hiện thể cực thứ nhất là tương đương, và tỉ lệ chín như vậy tương đối cao (> 80%).
BÀN LUẬN
Kết quả nuôi chín TBT của chúng tôi cao hơn các kết quả nghiên cứu trong nước: Nguyễn Hữu Đức (76,83%; 2003) [2], Nguyễn Văn Lý (65,61% và 71,19%; 2006) [5]; Phan Kim Ngọc (69,83%; 2009) [8]; và một số nghiên cứu được công bố
của nước ngoài: Yang và cs. (55,00%; 1998) [152], Morato và cs. (73,9%; 2008a) [103], Prentice (61,00%; 2010) [118]. Theo Yang và cs. (1998), Nguyễn văn Lý (2006), những TBT thu nhận từ các nang có đường kính từ 1-2mm làm giảm tỉ lệ
chín, từđó ảnh hưởng đến tỉ lệ nuôi; nếu thu các TBT từ các nang có đường kính từ
5-8mm cho tỉ lệ chín cao (84%) [5, 152]. Lonergan và cs. (1994) [90] cho rằng các TBT thu từ các nang có đường kính trên 6mm có khả năng phát triển tốt hơn so với các TBT thu từ các nang nhỏ hơn. Kết quả nuôi TBT chín của chúng tôi cao hơn có thể do chúng tôi thu nhận TBT từ những nang có đường kính từ 3-8mm, trong khi
đó các tác giả này thu nhận TBT từ các nang có đường kính từ 2-10mm. Mặt khác, chúng tôi đánh giá tỉ lệ chín của TBT tổng thể trên tất cả các nang thu được mà không phân chia thành các nhóm kích thước khác nhau.
Tuy nhiên, kết quả của chúng tôi vẫn còn thấp hơn một số nghiên cứu trên thế
giới: Saeki và cs. (90%; 1994) [125], Lonergan và cs. (87-97%; 1996 [89]), Morato và cs. (89,10%; 2008a) [103]. Sở dĩ các nghiên cứu này cho tỉ lệ chín của TBT cao là vì hầu như các tác giả này đều bổ sung EGF vào môi trường nuôi TBT. Theo các nghiên cứu đã công bố cho thấy EGF có vai trò kích thích sự giãn nở của tế bào cumulus và nâng cao tỉ lệ chín của TBT khi bổ sung với nồng độ thích hợp [1, 89]. Trong kết quả của chúng tôi, các môi trường được khảo sát đều có bổ sung 10ng EGF/ml, chính vì vậy tỉ lệ chín của TBT cũng được cải thiện. Ngoài ra, còn một số
Chất lượng và tính đồng đều của nguồn mẫu chưa cao
Các bò cái đưa vào các lò mổ được thu mua từ nhiều nguồn nên không có sự đồng đều về độ tuổi, cân nặng, di truyền. Mặt khác, những con bò này phần lớn là bò già, sức sinh sản yếu, thể trạng kém và buồng trứng có thể vàng tồn lưu lớn. Hình dáng buồng trứng thu được có nhiều buồng trứng xấu, không cân đối, dạng kéo dài có ít nang trứng và nhiều sẹo. Đôi khi, có một vài bò cái còn đang mang thai lớn. Vì vậy, chất lượng TBT chưa đảm bảo độđồng đều.
Thao tác thu nhận TBT
Theo các tài liệu công bố cho thấy, nếu chọc hút với lực quá mạnh sẽ làm ảnh hưởng đến sự liên kết giữa TBT và lớp cumulus, điều này không những làm tăng tỉ
lệ TBT loại C mà còn làm giảm chất lượng TBT. Cumulus tiếp xúc trực tiếp với TBT có nguyên sinh chất kéo dài, xuyên qua màng trong suốt và kết thúc ở chỗ
phồng ra gần với TBT [1, 61, 76]. Tầm quan trọng của chỗ nối này càng được củng cố khi người ta biết rằng màng TBT không có khả năng xuyên thấm đối với các chất trao đổi chất có phân tử lượng thấp (ví dụ như choline, uridine và inositol) [5, 47]. Sự xâm nhập của các chất kể trên được xem là thông qua chỗ tiếp xúc giữa cumulus và TBT. Nguyên nhân này hầu hết các nhóm nghiên cứu khi dùng phương pháp chọc - hút để thu nhận TBT đều gặp phải, và nhóm nghiên cứu của chúng tôi cũng không ngoại lệ. Bên cạnh đó trong quá trình thao tác thu TBT có thể đã để TBT phải tiếp xúc trực tiếp với các yếu tố bất lợi của môi trường như ánh sáng, nhiệt độ,
độ ẩm... những yếu tố này cũng góp phần làm hạn chế tỉ lệ trưởng thành của TBT trong nghiên cứu.
Nhìn chung, kết quả nuôi trưởng thành TBT bò ở các phòng thí nghiệm trên thế giới đều đạt tỉ lệ chín từ 70-90%: Lonergan và cs. (87-97%; 1996 [89]), Yamada và cs. (81,3%; 2007 [150]), Morato và cs. (89,10%; 2008a [103]). Như vậy, trong nghiên cứu của chúng tôi, tỉ lệ chín của TBT bò đạt 82-83% là chấp nhận được. Kết
quả này đã khẳng định sự thành công trong việc nuôi trưởng thành TBT bò trong
ống nghiệm.