Các TBT được cho là chín dựa theo độ giãn nở cumulus được bảo quản lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa, dùng vật mang là cọng rạ theo các quy trình 1, 2 và 3 (xem 2.3.4). Sau thời gian bảo quản lạnh, tiến hành giải đông và đánh giá theo hình thái (Hình 3.2). Kết quảđược thể hiện trong Bảng 3.2.
Hình 3.2. Đánh giá TBT MII sau giải đông
a: TBT trứng sống và b: TBT chết (X20); c: TBT sau khi giải đông (X10)
(a) (b)
Bảng 3.2. Kết quảđông lạnh TBT MII Quy trình Sốđợt TN Tổng số TBT đông lạnh
Tỉ lệ (%) các chỉ tiêu sau đông lạnh Thu hồi TBT sống/ĐL TBT shốồng/thu i 1 10 1404 81,84 ± 1,03 (1149 TBT) 62,89 ± 1,29 (883 TBT) 76,85 ± 1,24 a 2 16 1350 87,85 ± 0,89 (1186 TBT) 59,63 ± 1,34 (805 TBT) 67,88 ± 1,36 b 3 16 1285 88,33 ± 0,90 (1135 TBT) 64,51 ± 1,33 (829 TBT) 73,04 ± 1,32 c
a, b, c: khác nhau theo cột, có ý nghĩa thống kê ởđộ tin cậy 95%
Số lượng TBT thu hồi sau giải đông ở quy trình 1 đạt 81,84 ± 1,03%
(1.149/1.404); ở quy trình 2 đạt 87,85 ± 0,89% (1.186/1.350) và ở quy trình 3 đạt
88,33 ± 0,90% (1.135/1.285). Kết quả thu hồi TBT sau khi giải đông nhìn chung
đạt trên 80%, điều này cho phép khẳng định khả rằng sau khi đông lạnh, khả năng thu hồi được số lượng TBT đầy đủ là rất cao và số TBT mất trong quá trình bảo quản và giải đông là không đáng kể.
Tỉ lệ TBT sống sau giải đông trên tổng số TBT đem đông lạnh trung bình ở
quy trình 1 đạt 62,89 ± 1,29% (883/1.404); ở quy trình 2 đạt 59,63 ± 1,34%
(805/1.350) và ở quy trình 3 đạt 64,51 ± 1,33% (829/1.285).
Tỉ lệ TBT sống sau giải đông trên tổng số TBT thu hồi được ở quy trình 1 đạt
76,85 ± 1,24%; ở quy trình 2 đạt 67,88 ± 1,36% và ở quy trình 3 đạt 73,04 ± 1,32%. Sự khác biệt của 3 tỉ lệ này có ý nghĩa thống kê (P < 0,01). Kết quả so sánh riêng từng cặp về chỉ tiêu này ở cả 3 cặp đều có sự khác biệt về mặt thống kê: ở quy trình 1 và quy trình 2 (P < 0,001); ở quy trình 1 và quy trình 3 (P < 0,05); ở quy trình 2 và quy trình 3 (P < 0,01). (xem phụ lục 3, phần 2.2.)
Qua phân tích trên cho thấy, tỉ lệ sống của TBT MII sau khi bảo quản lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa ở quy trình 3 cao nhất, kế đến là quy trình 1 và
cuối cùng là quy trình 2. Đây chỉ là kết quả đánh giá tỉ lệ sống của TBT sau giải
đông theo quan sát hình thái.
Kết quả theo đánh giá nhuộm PI được thể hiện trong Hình 3.3, Hình 3.4 và Bảng 3.3.
Hình 3.3. TBT có NST không tổn thương Hình 3.4. TBT có NST tổn thương
Mũi tên màu trắng là vùng NST, mũi tên màu xanh là thể cực thứ nhất.
Bảng 3.3. Chất lượng TBT MII sau đông lạnh theo phương pháp nhuộm PI
Lô TN Số lần TN Số TBT đem nhuộm Số TBT sống theo nhuộm Tỉ lệ (%) TBT sống theo nhuộm PI QT2(1) 10 245 187 76,33 ± 2,72 QT3(1) 10 209 166 79,43 ± 2,80 P > 0,05
QT2(1): đông lạnh theo quy trình cải tiến 1 (không có Taxol) QT3(1): đông lạnh theo quy trình cải tiến 2 (có Taxol)
Kết quả Bảng 3.3 và phụ lục 3, phần 2.3.2 cho thấy: có 245 TBT ở QT2(1) và 209 TBT ở QT3(1) được nhuộm qua 10 đợt; chất lượng TBT MII sau đông lạnh
được đánh giá theo phương pháp nhuộm PI đạt 76,33 ± 2,72% (187/245) ở QT2(1) và 79,43 ± 2,80% (166/209) ở QT3(1). Tỉ lệ này không khác biệt ởđộ tin cậy 95%
(P > 0,05). Như vậy, tỉ lệ sống theo hình thái và theo quan sát sự tổn thương NST ở
thí nghiệm có bổ sung Taxol và thí nghiệm không được bổ sung Taxol chưa khác biệt nhau. Khi xét tỉ lệ TBT sống trên tổng số TBT đem đông lạnh so với TBT sống theo nhuộm trên tổng số TBT đem nhuộm trong cùng QT3(1) cũng cho kết quả
không khác biệt (P > 0,05). Kết quả này một lần nữa khẳng định tỉ lệ sống của TBT sau khi bảo quản lạnh theo hình thái và theo phương pháp nhuộm PI không có sự sai khác, tức là phương pháp đánh giá TBT sống sau khi bảo quản lạnh của chúng tôi là chấp nhận được.
BÀN LUẬN
Qua quá trình thực hiện thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy, còn khoảng 12-19% lượng TBT bị thất thoát trong quá trình thu hồi. TBT bị mất chủ yếu ở giai đoạn giải đông: khi chuyển TBT vào môi trường giải đông thường có hiện tượng bọt khí tạo ra rất nhiều. Chính những yếu tố này làm cản trở phần nào việc tìm và thu nhận TBT. Dù đã khắc phục dần trong những lần thí nghiệm tiếp theo (xem bảng ở phụ
lục 3, mục 2), nhưng vẫn không tránh khỏi khả năng bỏ sót TBT khi thực hiện trên số
lượng lớn. Đây cũng chính là hạn chế về mặt kỹ thuật của chúng tôi.
Tỉ lệ sống theo quan sát hình thái:
Tỉ lệ trung bình TBT sống trên tổng số TBT đem đông lạnh của quy trình 3
cao hơn quy trình 2 là 4,88% (P < 0,01); ở quy trình 1 so với quy trình 2 và quy trình 3, tỉ lệ này không khác biệt (P > 0,05). Tỉ lệ TBT nguyên vẹn về mặt hình thái so với tổng số TBT đem đông lạnh giảm dần theo thứ tựở các quy trình 3, quy trình 1 và quy trình 2 lần lượt là 64,51 ± 1,33%, 62,89 ± 1,29% và 59,63 ± 1,34%. Theo chúng tôi, sở dĩ có kết quả khác nhau vì: ở quy trình 1 có thể là khi đánh giá về hình thái TBT chưa thật chuẩn xác; kết quả của mỗi đợt TN (10 đợt) chưa đồng đều (xem phụ lục 3, mục 2 phần quy trình 1). Đây cũng là một trong số nguyên nhân giải thích cho tỉ lệ thụ tinh ở lô TN này thấp hơn các lô sau. Trong khi đó, ởquy trình 2
này đều sử dụng chung môi trường cơ bản (TCM-199 + 10% FBS + 5% FCS), chỉ
khác ở môi trường cân bằng và thủy tinh hóa. Ở quy trình 3 có bổ sung Taxol vào môi trường cân bằng và môi trường thủy tinh hóa với nồng độ 1µM, còn lại các thành phần khác trong cả 2 quy trình đều giống nhau. Điều này chứng tỏ ở lô thí nghiệm không xử lí Taxol cho kết quả tỉ lệ sống theo hình thái thấp hơn so với nhóm có xử lí Taxol. Kết quả này chứng tỏ Taxol có tác động lên khả năng sống của TBT trong quá trình bảo quản lạnh.
Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu của Morato và cs. (2008a) [103] cho rằng, Taxol có khả năng làm ổn định bộ khung TBT, giảm thiểu sự tổn thương cũng như nâng cao khả năng phát triển của TBT bò đông lạnh. Kết quả này có phần cao hơn kết quả của Martino và cs. (1996, 34%) [94]. Như vậy, tỉ lệ TBT sống sau giải đông được quan sát bằng hình thái trong nghiên cứu là có thể chấp nhận được. Tuy nhiên, kết quả này còn thấp hơn nhiều so với kết quả 86% của Dinnyes và cs. (2000) [49]; 89,1% của Morato cs. (2008a) [103] và đặc biệt là Chian và cs. (2004) [43] thu được tỉ lệ TBT bò sống sau giải đông đạt 92%. Dinnyes và cs. dùng chất bảo vệ lạnh là EG kết hợp với polyvinyl-pyrrolidone, cụ thể nhóm này cân bằng các TBT MII trong dung dịch chứa TCM-199 + 20% FBS + 4% EG ở 39oC trong khoảng 12- 15 phút, sau đó chuyển các TBT này vào dung dịch thủy tinh hóa (TCM-199 + 20% FBS + 35% EG + 5% polyvinyl-pyrrolidone + 0,4 M trehalose), dùng phương pháp thủy tinh hóa bằng vi giọt trên bề mặt kim loại. Chian và cs. đã sử dụng chất bảo vệ
lạnh là DMSO kết hợp với EG, vật mang là cryotop, cụ thể nhóm này tiến hành đông lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa qua 2 bước. Đầu tiên các TBT được cân bằng trong môi trường DPBS + 20% FBS + 0,11mg/ml natri pyruvate + 1mg/ml glucose + 0,05µg/ml streptomycin + 7,5% EG + 7,5% DMSO tại nhiệt độ phòng khoảng 5 phút, sau đó chuyển vào dung dịch thủy tinh hóa (DPBS + 20% FBS + 0,11mg/ml natri pyruvate + 1mg/ml glucose + 0,05µg/ml streptomycin + 15% EG + 15% DMSO + 0,5M sucrose) trong khoảng 45-60 giây, sau đó được nạp vào cryotop. Nhóm này cho rằng sự kết hợp giữa hai chất bảo vệ lạnh là EG và DMSO đã nâng cao tỉ lệ sống của TBT MII sau khi thủy tinh hóa. Anchamparuthy (2007) thu được tỉ lệ sống theo hình
thái là 98,9% khi sử dụng vật mang là lưới nylon và quy trình thủy tinh hóa bậc thang (stepwise) với chất bảo vệ là EG kết hợp với Ficoll, qua 3 bước đông lạnh. Các TBT sau khi được IVM 15 giờ sẽđược cho vào dung dịch A (DPBS + 10% EG + 4,5% Ficoll-70 + 0,075M sucrose) trong 7 phút, sau đó chuyển sang dung dịch B (DPBS + 20% EG + 9% Ficoll-70 + 0,15M sucrose) trong 2 phút, tiếp tục chuyển sang dung dịch C (DPBS + 40% EG + 18% Ficoll-70 + 0,3M sucrose) trong 1 phút và sau đó được nạp lên trên lưới nylon và nhúng trực tiếp vào nitơ lỏng trong vòng 40-60 giây. Nhóm này cho rằng sự kết hợp của 2 chất bảo vệ lạnh là EG và Ficoll nâng cao tỉ lệ sống của TBT sau giải đông [24].
Tỉ lệ tổn thương NST:
Tỉ lệ NST không tổn thương theo đánh giá qua hình thái trên hình ảnh nhuộm NST đạt 79,43 ± 2,80% (mẫu đối chứng là 76,33 ± 2,72%). Kết quả này cao hơn của Saunders và Parks (1999; 31%) [113]; Morato và cs. (2008a; 46,6%) [103]. Tuy nhiên, kết quả này thấp hơn của Eroglu và cs. (1998; 86%) khi tiến hành trên TBT chuột [52]. Theo Saunders và cs., 1999 [127], Albarracin và cs., 2005 [20], TBT bò
ở giai đoạn MII sau khi được bảo quản lạnh thường có những tác dụng không mong muốn: thoi vô sắc (spindle) không còn nguyên vẹn về mặt cấu trúc và tổ chức, điều này dẫn đến nhiễm sắc thể và cấu trúc vi ống bị phá vỡ.
Tỉ lệ TBT bò có NST không bị tổn thương ở cả 2 lô thí nghiệm không có sự
khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05). Tức là sự tổn thương NST của TBT bò sau khi bảo quản lạnh ở nhóm xử lí Taxol tương đương với nhóm không xử lí Taxol. Kết quả này chưa thể hiện rõ hiệu quả của Taxol trong việc hạn chế tổn thương về NST của TBT bò trong quá trình bảo quản bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ. Kết quả này khác với kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả Morato và cs. (2008a) [103] cho rằng, nếu TBT bò được xử lí với 1 µM Taxol trước khi đem bảo quản bằng phương pháp thủy tinh hóa có thể đạt được tỉ lệ về cấu trúc bình thường của thoi vô sắc, vi ống, nhiễm sắc thể tương đương với các TBT tươi. Như vậy, kết
bò. Kết quả của chúng tôi khác với kết quả của Morato và cs. (2008a) có thể do trong quy trình giải đông, chúng tôi có bổ sung thêm 10% dung dịch acid Tyrode trong 20 giây, cũng có thể dung dịch này ảnh hưởng đến kết quả nhuộm NST. Mục
đích của việc bổ sung 10% dung dịch acid Tyrode trong 20 giây nhằm giúp màng trong suốt giảm bớt độ cứng sau khi bảo quản lạnh. Hiện nay, trong nước chưa có công trình nào công bố về sự tổn thương NST do quá trình bảo quản lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa. Vì vậy, đây có thể coi là kết quả khởi đầu cho việc khảo sát sự tổn thương NST của TBT bò nói riêng và TBT động vật có vú nói chung sau khi được bảo lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa.
Việc đánh giá khả năng sống sót của TBT bò sau khi được bảo quản lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa dùng cọng rạ làm vật mang theo quan sát hình thái và theo hình ảnh nhuộm trong thí nghiệm này chỉđạt 73,04 ± 1,32% và 79,43 ± 2,80%, tương ứng. Hiện nay, các nghiên cứu trên thế giới cũng đánh giá thông qua hình thái, sau đó dùng những TBT này tiến hành IVF. Các kết quả đạt được đã chứng minh rằng các TBT bò khi được nuôi chín trong ống nghiệm có thểđược bảo quản bằng phương pháp thủy tinh hóa dùng cọng rạ làm vật mang và hỗn hợp chất bảo quản là DMSO và EG. Vì đây là một trong số ít nghiên cứu đầu tiên vềđông lạnh TBT bò giai đoạn MII bằng phương pháp thủy tinh hóa ở nước ta, nên kết quảđạt
được là một điều khích lệ. Tuy nhiên, kết quảđạt được vẫn còn thấp hơn so với các nghiên cứu được công bố trên thế giới. Trong quá trình thực hiện, chúng tôi nhận thấy do các nguyên nhân sau:
(i) Thao tác chuyển TBT qua các môi trường đông lạnh diễn ra rất nhanh (ở
môi trường cân bằng trong 45 giây, ở môi trường thủy tinh hóa trong 25 giây) nên có thể chưa đảm bảo một cách tuyệt đối yêu cầu về mặt thời gian. Chính vì vậy, TBT tiếp xúc với các chất bảo quản lạnh quá lâu và không đảm bảo về nhiệt độ,
(ii) Chất lượng TBT chưa đồng đều về mặt di truyền, độ tuổi, vì buồng trứng
được thu nhận từ lò mổđịa phương. Đây cũng là một yếu tốảnh hưởng đến kết quả đông lạnh và thụ tinh trong ống nghiệm;
(iii) Khác với việc bảo quản lạnh phôi, tinh trùng và mô, TBT là đối tượng rất khó bảo quản lạnh do TBT là một thực thểđơn (entity), lớn và có tỉ lệ nước rất cao (khoảng 80%). TBT có cấu trúc màng tế bào rất nhạy với nhiệt độ lạnh, vì vậy dễ
hình thành tinh thểđá trong quá trình bảo quản lạnh, đặc biệt là đối với TBT bò đã IVM rất dễ bị tổn thương. Đây cũng là nguyên nhân mà các nhà khoa học trên thế
giới làm về lĩnh vực này đang tập trung nghiên cứu tìm cách hạn chế và khắc phục [20, 40, 133].