Sự hình thành tinh thểđá
Sự hình thành tinh thể
nước đá trong và ngoài tế
bào là yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến sức sống của tế bào sau đông lạnh. Tốc độ làm lạnh chính là yếu tố quyết định dạng tinh thể nước đá hình thành. Khi làm lạnh với tốc độ thích hợp thì tinh thể nước đá hình thành có dạng sáu cạnh. Khi tốc độ
làm lạnh được đẩy lên thì hình dạng của nó sẽ là hình cây thông không đồng dạng và hình cầu (Hình 1.1) [12, 103, 112].
Khi tốc độ làm lạnh đạt đến 20.000oC/giây, nước nguyên chất tạo băng vô
định hình mà không có dạng tinh thể. Tuy nhiên, quá trình làm ấm trong giải đông
Hình 1.1. Ảnh hưởng của tốc độđông lạnh lên sự hình thành tinh thểđá và trạng thái của tế bào [13]
sẽ xảy ra quá trình tái tạo tinh thể nước đá từ nhỏđến lớn. Vì vậy, tốc độ nâng nhiệt chậm trong quá trình giải đông sẽ gây bất lợi cho tế bào [12, 103, 112].
Ở môi trường đẳng trương (áp lực thẩm thấu ở khoảng 300mOm/kg), tinh thể đá thường được hình thành ở nhiệt độ -5 đến -15oC. Tuy nhiên, tinh thểđá chỉ được hình thành ở nhiệt độ -10oC khi trong dung dịch có các phân tử chất rắn nhỏ. Nhiệt
độ càng giảm thì tinh thể đá càng tăng. Ở nhiệt độ khoảng -130oC, tất cả các chất liệu trong dung dịch đều ở dạng hạt kết tinh hay dạng thủy tinh. Quá trình này gọi là sự kết tinh hay hiện tượng thủy tinh hóa (vitrification) [12, 61, 103].
Sự khử nước
Sự khử nước của tế bào là rất cần thiết trong quá trình làm lạnh. Một khi tế
bào không được khử nước thì cấu trúc đá nội bào sẽ hình thành nếu nhiệt độ xuống dưới 0oC. Tốc độ khử nước của tế bào phụ thuộc vào nhiều yếu tố: tính thấm nước của màng, năng lượng hoạt hóa của tính thấm và tỉ lệ diện tích bề mặt/thể tích tế
bào (S/V). Những yếu tố này thay đổi tùy thuộc vào loại tế bào, vì vậy, chúng đóng vai trò quyết định trong việc xác định quá trình đông lạnh thích hợp nhất [12, 118].
Độ pH của dung dịch
Độ pH của dung dịch sẽ giảm theo nhiệt độ. Cân bằng acid - base của môi trường biến đổi theo hướng tăng lực ion, làm cho các phân tử protein hòa tan trong môi trường dễ bị kết tủa (salting out). Các chất bảo vệ đông lạnh với bản chất hóa học của nó giữ vai trò quan trọng trong việc kiểm soát biến đổi acid - base của dung dịch. Glycerol và các glycol hoạt động như những base yếu, trong khi DMSO lại hoạt động như những base mạnh. Độ pH thích hợp nhất để duy trì hoạt động sinh lí của tế bào phụ thuộc vào nhiệt độ mà tế bào được bảo quản. Người ta nhận thấy rằng, sự sống có thể tồn tại sau bảo quản ở các nhiệt độ xấp xỉ 0oC với độ pH lớn hơn 9 [12, 75, 118].
Sự hình thành bọt khí
Trong quá trình bảo quản lạnh, tế bào bị tổn thương và có thể chết vì nhiều cách khác nhau do sự hình thành tinh thểđá. Thể tích nước bị đông lạnh sẽ tăng lên (tỉ trọng của nước đá thấp hơn tỉ trọng của nước) dẫn đến việc bọt khí có thể hình thành khi nhiệt độ giảm xuống. Kích thước của bọt khí thay đổi từ 25-100µm và tỉ
lệ nghịch với tốc độ làm lạnh, trong khi số lượng bọt khí tỉ lệ thuận với tốc độ làm lạnh [12, 75, 118].
Bên cạnh các khí hòa tan theo nồng độ, môi trường nuôi cấy còn sử dụng CO2 làm đệm nhằm cân bằng acid - base. Khi làm lạnh thì các khí này không còn ở dạng hòa tan mà tách ra thành những bọt khí có khả năng gây tổn thương cho tế bào. Khi tiến hành giải đông, bọt khí có thểđược hình thành và có thể phát triển thành không bào rất lớn trong nội bào, làm tế bào phồng to quá mức và có thể bị phá hủy hoàn toàn. Sự tạo thành bọt khí xảy ra nhiều trong môi trường sử dụng đệm bicarbonate, vì vậy, sử dụng môi trường PBS (Phosphate-buffered saline) có thể hạn chế số lượng bọt khí [12, 75, 118].