PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
3.5.1.2. Thí nghiệm đánh giá đa dạng di truyền của các mẫu giống đậu cô ve thu thập dựa trên chỉ thị phân tử
thu thập dựa trên chỉ thị phân tử
a) Chiết tách ADN
ADN đƣợc chiết tách theo phƣơng pháp của Doyle and Doyle (1990) có cải tiến. Nghiền 200 mg mẫu lá đậu tƣơi trong 700 l dung dịch đệm chiết (2% CTAB, 100 mM Tris/HCl 1.4 M NaCl, 20 mM Ethylene Diamine Tetra Acetic acid (EDTA), pH 8.0, 20 μl/ml mercaptoethanol) bằng cối chày sứ đến khi tạo dung dịch đồng nhất. Chuyển toàn bộ dịch nghiền sang ống eppendorf 1,5ml, ủ ở 65oC trong 1h (thỉnh thoảng đảo đều). Bổ sung 700µl phenol: chloroform: isoamylalcohol (25:24:1), đảo đều sau đó ly tâm 12.000 v/p trong 10 phút ở 4oC, hút dịch nổi phía trên cho vào ống eppendorf 1,5ml mới. Bổ sung 600 l dung dịch Chloroform: isoamylalcohol (24:1) đảo đều sau đó ly tâm 12.000 v/p trong 10 phút ở 4o
C, hút dịch nổi phía trên cho vào ống eppendorf 1,5ml mới. Bổ sung Isopropanol (theo tỷ lệ 1:1 về thể tích) đảo nhẹ để ở tủ -20oC trong 30 phút. Sau đó ly tâm 12.000 v/p trong 5 phút ở ở 4o
C, loại bỏ dịch nổi, thu tủa. Rửa tủa bằng cách bổ sung 800µl cồn 70% và ly tâm 12.000v/p trong 5 phút ở 4oC sau đó loại cồn thu tủa. Làm khô ADN ở nhiệt độ phòng. Hoà tan ADN trong 100µl TE và bảo quản ở -20oC.
b) Phản ứng PCR:
- Với các chỉ thị phân tử SSR trong thí nghiệm đánh giá đa dạng di truyền của quần thể đậu cô ve, phản ứng PCR đƣợc thực hiện trong ống nghiệm 0.2 µl, chu kỳ nhiệt gồm: hai chu kỳ biến tính đầu 30s ở nhiệt độ 94oC, ủ trong 60s tại 37oC, và kéo dài trong 2 phút tại 72oC; chu kỳ thứ hai, biến tính 30s ở nhiệt độ 94oC, ủ trong 60s tại 50oC, và kéo dài trong 2 phút tại 72oC; sâu đó 41 chu kỳ với nhiệt độ biến tính giảm xuống 93oC, sau đó 4 phút tại 72oC. Sau khuyếch đại sản phẩm phản ứng đƣa lên gel Agarose 4% điện di, nhuộm bằng ethidium bromide và quan sát bằng đèn UV và chụp ảnh cho phân tích.