kháng kháng sinh tetA
Dựa vào kết quả giải trình tự các đoạn gene DKKS-T1-TraVinhVN- 2014 và DKKS-T3-TraVinhVN-2014 thuộc vi khuẩn V. cholerae, so sánh
với các trình tự tương đồng trên Genbank (BLAST), trong nghiên cứu này đã chọn ra những trình tự tương đồng cao với trình tự đoạn gene DKKS-T1- TraVinhVN-2014 với các số hiệu: AB213657.1, EU263362.1, EU263363.1, EU263361.1, EU263360.1 và các trình tự tương đồng cao với trình tự đoạn gene DKKS-T3-TraVinhVN-2014 với các số hiệu: CP001235.1,
AP014524.1, CP001233.1, CP003330.1, CP003069.1, CP001485.1,
DQ772843.1, CP002555.1.
Trong nghiên cứu này, 2 chủng V. cholerae phân lập tại Trà Vinh có
mang gene mã hoá gene kháng kháng sinh tetracycline phân lập trên mẫu nước và mẫu nghêu có tỉ lệ tương đồng về trình tự nucleotide với các chủng khác ở Thái Lan, Nhật Bản, Trung quốc, Indonesia, Brazil và Ấn Độ, tương đồng 97% với 10 chủng; tương đồng 96% với 01 chủng và tương đồng 94% với 04 chủng qua Bảng 4.19.
97
Bảng 4.19: Mức độ tương đồng đoạn gene kháng kháng sinh TetA của V. cholerae (T1 và T3) với các trình tự trên Genbank bằng công cụ BLAST.
Số hiệu gene Chủng Tổng số điểm Tỉ lệ che phủ Mức ý nghĩa Độ tương đồng
AB213657.1 Vibrio cholerae non-O1 vcmD 909 95% 0.0 97% CP001235.1 Vibrio cholerae O395 (I) 1534 84% 0.0 97% AP014524.1 Vibrio cholerae MS6 DNA, (I) 1534 84% 0.0 97% CP001233.1 Vibrio cholerae M66-2 (I) 1534 84% 0.0 97% CP003330.1 Vibrio cholerae IEC224 (I) 1534 84% 0.0 97% CP003069.1 Vibrio cholerae O1 str. 2010EL-1786 1534 84% 0.0 97% CP001485.1 Vibrio cholerae MJ-1236 (I) 1534 84% 0.0 97% DQ772843.1 Vibrio cholerae clone FLH214558-
USA-2006
1134 83% 0.0 97% CP002555.1 Vibrio cholerae LMA3894-4
chromosome I
1516 85% 0.0 96% EU263362.1 Vibrio cholerae strain N16961 MATE-
AshVCD43
832 95% 0.0 94% EU263363.1 Vibrio cholerae strain N16961 MATE-
AshVCD44
826 95% 0.0 94% EU263361.1 Vibrio fluvialis MATE-AshVFD69 837 95% 0.0 94% EU263360.1 Vibrio fluvialis MATE -AshVFD53 837 95% 0.0 94%
98
Từ cây phát sinh loài đã thể hiện rõ về cơ chế tiến hóa liên quan đến các chủng kháng kháng sinh phân lập ngoài môi trường và từ thức ăn hải sản.
Kết quả cây phát sinh loài cũng chỉ ra rằng 2 chủng V. cholerae T1 và T3 phân lập từ nước sông tại Trà Vinh mang gene kháng kháng sinh có mối liên hệ gần về trình tự nucleotide (97%) với nhiều chủng V. cholerae khác như
V. cholerae M66 phân lập tại Indonesia năm 2008; chủng V. cholerae IEC224
phân lập tại Brazil năm 2012; V. cholerae 2010EL-1786 phân lập tại Haiti
năm 2010; V. cholerae O395 phân lập tại Trung Quốc năm 2008; V. cholerae MJ-1236 phân lập tại Bangladesh năm 2009; V. cholerae MS6 phân lập tại
Thái Lan năm 2014; V. cholerae non-O1 vcmD phân lập tại Nhật Bản năm
2005. Ngoài ra, các chủng có mối liên hệ gần về trình tự nucleotide (96%) như chủng LMA3894 phân lập tại Brazil năm 2011; 2 chủng V. cholerae N16961
phân lập tại Ấn Độ năm 2007, V. cholerae clone FLH214558 phân lập tại Mỹ năm 2006, và có mối liên hệ xa nhất với loài V. fluvialis phân lập tại Ấn Độ
năm 2007.
Hình 4.11: Quan hệ di truyền của các chủng V. cholerae dựa vào gene kháng kháng sinh tetA. Lịch sử tiến hóa được suy ra bằng cách sử dụng phương pháp UPGMA (Sneath P.H.A, 1973). Cây tiến Lịch sử tiến hóa được suy ra bằng cách sử dụng phương pháp UPGMA (Sneath P.H.A, 1973). Cây tiến hoá với tổng chiều dài các nhánh = 130.99560252 được hiển thị. Cây được vẽ theo tỉ lệ, với độ dài nhánh tại các vị trí tương tự như những khoảng cách tiến hóa sử dụng để suy ra cây phát sinh loài. Khoảng cách tiến hóa đã được tính toán bằng cách sử dụng phương pháp tổng hợp (Tamura K., 2004) và trong các đơn vị của số lượng base thay thế cho mỗi vị trí. Các phân tích liên quan đến 15 trình tự nucleotide. Vị trí codon bao gồm là 1 + 2 + 3 + không mã hoá. Tất cả các mục có chứa khoảng trống và dữ liệu bị mất đã được loạibỏ. Có tổng cộng 846 vị trí trong số liệu cuối cùng. Phân tích tiến hóa được thực hiện tại MEGA5 (Tamura K., Peterson D, 2011).
99
Một nghiên cứu khác cho thấy nhiễm sắc thể 1 và 2 của chủng MS6 đã thường xuyên được sửa đổi bởi sự truyền gene từ các loài thuộc Vibrios sau
khi phân kỳ từ một tổ tiên chung, do đó những chủng có mối liên hệ gần sẽ có những đặc điểm tương tự về gene kháng kháng sinh (Kazuhisa et al., 2014).
Trong khi đó chủng V. cholerae N16961 có nhiều nghiên cứu đã chứng minh chủng này có sự di truyền gene đa kháng thuốc mã hóa cho gene EmrD- 3 với cơ chế như máy bơm thuốc ra ngoài (Smith, 2009, Floyd, 2013). Các chủng phân lập ở Thái Lan từ năm 2003 đến năm 2004 cũng cho thấy 100% acid amin tương đồng với các acid amin chủng N16961. Tuy nhiên, gene TCPA của V. cholerae O1 chủng El Tor trong năm 2007 và sau đó đã có một
đột biến ở vị trí amino acid 64 và điều này cũng được tìm thấy ở chủng V. cholerae 2010EL1786 (GenBank: CP003069) chủng này đã từng gây ra dịch
bệnh ở Haiti (Reimer et al., 2011).
Ở Việt Nam, năm 2000 những chủng V. cholerae O1 kháng tetracycline là do gene tetA, tuy nhiên, gene kháng trimethoprim cũng không được tìm thấy trong thời điểm này. Các chủng vào năm 2002 thì lại được nhạy cảm với tất cả các loại thuốc kiểm tra. Từ năm 2010 – 2011, những chủng V. cholerae phân
lập tại Việt Nam mang gene kháng kháng sinh tương tự như chủng phân lập Ấn Độ và Thái Lan., đã tạo ra một biến thể mới của V. cholerae O1 (Jain et
al., 2011; Okada et al, 2010).
Những chủng V. cholerae lần đầu tiên được phân lập từ các nguồn khác nhau giữa năm 2007 và 2009 tại Hà Nội Việt Nam xác định có mang gene
TetA (lớp D) mã hóa kháng với tetracycline (mã số: AB450045.1). Điều này
cho thấy về mặt dịch tễ học có sự tồn tại của các chủng mang gene kháng TetA (lớp D), ở ngoài môi trường tại miền Bắc Việt Nam. Nhiều dữ liệu cho thấy những chủng gây dịch bệnh tại Lào, Việt Nam và Thái Lan từ năm 2007 và 2009 phân lập từ mẫu phân bệnh nhân, mẫu phân vật nuôi như chó nhập từ Thái Lan và mẫu nước từ môi trường đều giống nhau về mặt di truyền (Tuan Cuong Ngo et al, 2011). Hơn nữa, hiện nay dịch bệnh xảy ra ở Thái Lan, Lào, và Việt Nam đều do chủng thuộc type sinh học El Tor, có mang độc tố CTX đã biến thể (Nguyen et al., 2009). Những chủng này cũng đang được lan
truyền rộng rãi trong các nước Đông Nam Á (Okada et al., 2010 và Sithivong
et al., 2010).
Như vậy, cho thấy 2 chủng trong nghiên cứu này có cơ chế kháng kháng sinh tương tự với các chủng so sánh và nguy cơ về sự di truyền gene kháng kháng sinh là rất cao trong những chùng thuộc loài V. cholerae
100
4.5 Thử nghiệm độc lực chủng V. cholerae và đánh giá đáp ứng miễn dịch trên thỏ.
4.5.1 Kết quả đánh giá chủng V. cholerae đối với thỏ không uống vaccine phòng bệnh tả.
4.5.1.1 Lượng dịch lỏng FA (Fluid accumulation): Sau khi đưa huyền dịch vi khuẩn vào ruột non thỏ với liều 105 – 107, lượng dịch lỏng tiết ra sẽ được thu hồi qua Bảng 4.20.
Bảng 4.20: Lượng dịch lỏng (ml/cm) thu hồi trong ruột non của thỏ sau khi tiêm vi khuẩn theo thời gian.
TT Chủng
VK
3 giờ 6 giờ 9 giờ 16 giờ Số thỏ
1 N16961 - - 1,45 2,3a 3 2 N8 (T1) 0,88 0,9 0,3 0,2b 2 3 O3.2 (T3) 0,7 0,8 0,4 0,2b 2 4 O1.2 0,5 0,7 1,2 1,5 2 5 Ng3 0,5 0,6 0,8 1,7 2 6 85V1 0,7 0,8 1 1,6 2 7 81V1 0,7 0,9 1,2 1,8 2 CV% 65,7 55,6 53,4 37,4
Ghi chú: Các giá trị trung bình theo sau có các mẫu tự giống nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở 5% (theo phép thử Duncan).
N16961: chủng V. cholerae hoang dại tham khảo (Sameer et al., 2014) N8: T1; O3.2: T3 ký hiệu chủng mang gen kháng tetracycline
[
Hình 4.12: Biểu đồ dịch lỏng sau khi tiêm vi khuẩn vào ruột non thỏ
Dịch lỏng (ml)
101
Qua kết quả trên, nhận thấy chủng V. cholerae hoang dại N16961 bắt đầu tích luỹ dịch lỏng tại thời điểm 9 giờ và 16 giờ sau khi tiêm vi khuẩn là 1.45 ml – 2.3 ml/cm cao hơn so với 2 chủng V. cholerae T1 và V. cholerae T3 trong nghiên cứu này là có mang gene kháng tetracycline khi tiêm vào ruột non thỏ không kích thích niêm mạc ruột non thỏ tiết ra dịch lỏng, chỉ tiết ra từ 0.8 – 0.9 ml/cm tại thời điểm 6 giờ, sau đó giảm dần chỉ còn 0.15 - 0.2 ml/cm ở thời điểm 16 giờ. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p<0,05) vì chủng
V.cholerae hoang dại N16961 có roi, di động mạnh, dễ dàng bám dính vào nhung mao ruột và kích thích niêm mạc ruột sản xuất một lượng độc tố CT, gây ra hiện tượng tiêu chảy (Sameer et al., 2014; Taylor et al., 1987). Điều đó cho thấy những chủng đột biến, đặc biệt nếu vi khuẩn có sự biến đổi về cấu trúc roi sẽ không kích thích niêm mạc ruột tiết ra dịch lỏng. V. cholerae T1, T3có hiện tượng đột biến là thêm hoặc mất từ 1- 3 nucleotid ở mỗi codon, dẫn đến hiện tượng thay đổi vị trí các acid amin và thay đổi cấu trúc protein. Ví dụ đối với chủng V. cholerae T1 có codon kết thúc ở vị trí 51, tương ứng với vị trí acid amin 51 (Phụ lục 8), dẫn tới 1 codon vô nghĩa và điều đó sẽ làm cho vi khuẩn ngừng tổng hợp chuỗi polypeptide ở vị trí acid amin này, kết quả này cũng xảy ra tương tự với chủng V. cholerae T3. Trong khi đó 4 chủng V. cholerae O1.2, Ng3, 85V1 và 81V1 không mang gene kháng tetracycline, khi
tiêm vào ruột non thỏ không uống vaccine đều tích luỹ dịch lỏng cao tại thời điểm 9 giờ và 16 giờ, so sánh với chủng V. cholerae T1 và T3 có mang gene kháng tetracycline, sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p<0,05).
Như vậy, đối với những chủng vi khuẩn trong nghiên cứu này đã bị đột biến làm ảnh hưởng đến sự tổng hợp protein và dẫn đến sự thay đổi về thành phần cấu tạo của roi vi khuẩn, chúng di động ít hơn, không thể bám dính vào niêm mạc ruột nên không kích thích niêm mạc ruột tiết ra độc tố tiết và dịch lỏng bên trong lòng ruột, từ đó không có hiện tượng tiêu chảy.
4.5.1.2 Số lượng vi khuẩn V. choleraebám dính trên niêm mạc ruột nonđối với thỏ không uống vaccine phòng bệnh tả.
Số lượng vi khuẩn đếm được tại các thời điểm: 3 giờ, 6 giờ, 9 giờ và 16 giờ sau nuôi cấy được tổng hợp qua Bảng 4.21:
102
Bảng 4.21: Số lượng vi khuẩn V. cholerae bám dính trên niêm mạc ruột non thỏ không uống vaccine.
TT Chủng VK
3 giờ
6 giờ 9 giờ 16 giờ % bám dính Số thỏ 9 giờ 16 giờ 1 N8 (T1) 0 6.5 x 105 4 x 105 0 55,7±13,9 0 2 2 O3.2 (T3) 0 5 x 105 35 x 104 0 59,3±4,2 0 2 3 O1.2 0 12 x 105 15,.5 x 104 10 x 105 81,2±6,5 52,6±5,3 2 4 Ng3 0 13 x 105 16,5 x 105 9,8 x 105 89,9±3,8 76,2±4,8 2 5 85V1 0 15,6 x 105 16 x 105 12 x 105 77,5±2,4 79,9±8,9 2 6 81V1 0 16,5 x 105 18,2 x 105 2 x 106 75,4±1,7 79,1±7,2 2
Hình 4.13: Số lượng V. cholerae bám dính trên niêm mạc ruột non thỏ
Qua Biểu đồ trên, số vi khuẩn bám dính trong niêm mạc ruột non cao nhất tại thời điểm 6 giờ và sau đó giảm dần tại các thời điểm 9 giờ và 16 giờ ở tất cả các chủng vi khuẩn. Riêng 2 chủng T1, T3 số lượng vi khuẩn chỉ bám dính tạm thời ở thời điểm 6 giờ từ 5,105 đến 65,104, sau đó cũng giảm xuống đáng kể ở thời điểm 9 giờ chỉ còn 4,105 đến 35,104 và đến thời điểm 16 giờ không còn V. cholerae bám dính.
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh đối với những chủng V. cholerae có
đột biến, các sản phẩm như độc tố đường ruột (CT) và độc tố từ tiên mao (TCP) được hệ thống bơm ra ngoài với số lượng ít hơn, do khuẩn lạc không được hình thành ở ruột non. Giảm độc tố đường ruột (CT) và độc tố từ tiên mao (TCP) là do rối loạn trong quá trình phiên mã của tcpPH và toxT (Wu and Walker., 1976).
Thời gian (giờ) CFU V.cholerae
103
Tóm lại, thí nghiệm trên thỏ đã chứng minh vi khuẩn có hiện tượng đột biến chỉ bám dính tạm thời tại thời điểm 6 giờ, sau đó giảm dần và mất hẳn ở thời điểm 16 giờ.
4.5.2 Kết quả đánh giá tính đáp ứng miễn dịch trên thỏ đã uống vaccine phòng bệnh tả vaccine phòng bệnh tả
4.5.2.1 Lượng dịch lỏng FA (Fluid accumulation): Sau khi đưa huyền dịch vi khuẩn vào ruột non thỏ với liều 105 – 107, lượng dịch lỏng tiết ra sẽ được thu hồi qua Bảng sau.
Bảng 4.22: Lượng dịch lỏng (FA: Fluid accumulation) thu hồi từ ruột non của thỏ qua các giai đoạn thời gian (ml).
TT Chủng VK 3 giờ 6 giờ 9 giờ 16 giờ Số thỏ
1 N8 (T1) 0,30 0,35 0,25 0,00 2 2 O3.2 (T3) 0,40 0,25 0,20 0,00 2 3 O1.2 0,50 0,60 0,30 0,20 2 4 Ng3 0,50 0,60 0,40 0,25 2 5 85V1 0,40 0,50 0,30 0,15 2 6 81V1 0,40 0,40 0,30 0,20 2 CV% 24,50 22,70 35,00 76,50 12
Hình 4.14: Biểu đồ dịch lỏng sau khi tiêm vi khuẩn vào ruột non thỏ
Qua kết quả trên, nhận thấy tất cả các chủng V. cholerae T1, T3, O1.2 Ng3, 85V1, và 81V1 khi tiêm vào ruột non đối với thỏ đã uống vaccine
Thời gian (giờ) Dịch lỏng (ml/cm)
104
(mORCVAX) có tích luỹ dịch lỏng tại thời điểm 3 giờ nhưng sau đó giảm dần đến thời điểm 6 giờ, 9 giờ và đến 16 giờ số lượng dịch lỏng không đáng kể, do niêm mạc ruột có tiết kháng thể đã gắn với thụ thể trên bề mặt vi khuẩn, cản trở vi khuẩn bám vào niêm mạc ruột của vật chủ, từ đó niêm mạc ruột không thể tiết ra độc tố và tế bào biểu mô ruột non không thể tiết ra chất lỏng (Taylor
et al., 1987). Sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).
Như vậy, đối với tất cả thỏ có uống vaccine phòng bệnh tả đã có kháng thể nên dịch lỏng không tiết ra ở ruột non.
4.5.2.2 Số lượng V. cholerae bám dính trên niêm mạc ruột non đối với thỏ đã uống vaccine phòng bệnh tả
Số lượng khuẩn lạc thu được qua các giai đoạn thời gian: 3 giờ, 6 giờ, 9 giờ và 16 giờ được tổng hợp qua Bảng sau:
Bảng 4.23: Số lượng V. cholerae bám dính trên niêm mạc ruột non thỏ đã uống vaccine
TT Chủng VK
3 giờ
6 giờ 9 giờ 16 giờ % bám dính Số thỏ 9 giờ 16 giờ 1 N8 (T1) 0 105 12 x 103 0 12,4±0,6 0 2 2 O3.2 (T3) 0 8 x 104 20 x 103 0 7,41±1,9 0 2 3 O1.2 0 13,8 x 104 4,3 x 104 0 15,19±6,54 0 2 4 Ng3 0 14,1 x 104 8,2 x 104 0 14,77±3,12 0 2 5 85V1 0 15,6 x 104 6,5 x 104 0 14,64±4,18 0 2 6 81V1 0 14 x 104 4,6 x 104 0 19±2,9 0 2
Hình 4.15: Biểu đồ V. choleraebám dính trên niêm mạc ruột non Kết quả Bảng 4.23 cho thấy số đơn vị vi khuẩn bám dính trong niêm mạc ruột non cao nhất tại thời điểm 6 giờ và sau đó giảm dần tại các thời điểm 9 giờ và 16 giờ ở tất cả các chủng vi khuẩn, riêng 2 chủng T1, T3 số lượng vi
Thời gian (giờ) CFU V.cholerae
105
khuẩn chỉ bám dính tạm thời ở thời điểm 6 giờ từ 8x104 đến 105, sau đó cũng giảm xuống đáng kể ở thời điểm 9 giờ chỉ còn 12x103 đến 20x103, đến thời điểm 16 giờ hầu như tất cả các chủng đều không còn bám dính vào niêm mạc ruột non, chứng tỏ V. cholerae bị ức chế bởi các kháng thể được tiết ra từ niêm mạc ruột non.
Việc hình thành đáp ứng miễn dịch trên thỏ có thể giải thích theo 2 cơ chế:
- Thứ nhất, khi kháng thể tiết ra sẽ ngăn chặn vi khuẩn bám vào niêm mạc bằng cách gắn vào bề mặt kháng nguyên (vi khuẩn) (Finkelstein et al.,
1982); làm bất động vi khuẩn hoặc kết dính với vi khuẩn, làm chúng không thể di chuyển trên bề mặt biểu mô ruột (Schrank et al., 1976). Trong trường
hợp này, tác nhân gây bệnh sẽ bám dính kém và dễ dàng bị cuốn trôi khi nhu động ruột trở lại bình thường;
- Thứ hai, đáp ứng miễn dịch dịch thể trong bệnh tả làm xuất hiện IgG trong máu và IgA được tiết ra ở niêm mạc ruột, các kháng thể này tiết ra có tác dụng diệt khuẩn, ngăn cản vi khuẩn bám dính vào niêm mạc ruột, hoặc vi khuẩn bị ức chế và không nhân lên để bám vào niêm mạc ruột (William et al.,