29
Cơ chế sinh độc tố này nằm trong bí mật về trình tự di truyền của V. cholerae mới được giải mã vào năm 2000 khi người ta phát hiện vi khuẩn này
có 2 nhiễm sắc thể, 1 lớn (chr 1) và 1 bé (chr 2). Đây là điều thú vị bởi vì các vi khuẩn khác đều chỉ có 1 nhiễm sắc thể. Hai nhiễm sắc thể của V. cholerae đóng vai trò chuyển hóa và sao chép, tạo ra lợi thế tiến hóa cho vi
khuẩn trong môi trường khi khí hậu thay đổi. Nhiễm sắc thể lớn (chr 1) chứa hầu hết những gene cần thiết cho sự tăng trưởng và sinh bệnh giúp cho vi khuẩn thích ứng và phát triển với môi trường ở ruột, nhiễm sắc thể 2 phụ trách chu trình biến dưỡng và điều hòa cần thiết để vi khuẩn sống ngoài môi trường (Boyd và Waldor,. 2008).
Trên nhiễm sắc thể 1 có 2 cụm gene đặc biệt đó là CTXΦ và VPI. Nhiều nghiên cứu cũng chứng minh rằng VPI vốn là 1 bacteriophage gọi là VPIΦ mã hóa cho thụ thể TCP để cho 1 bacteriophage khác (CTXΦ ) gắn kết vào Chr1 và sản xuất ra CT. Như vậy, một chủng V. cholerae không sinh độc tố sẽ trở thành chủng sinh độc tố khi chủng này thu nhận được phage CTXΦ. Độc tố tả chỉ được sản xuất khi có sự chuyển gene của phage CTXΦ gắn vào 1 tiêm mao nhất định trên chủng V. choleare, nên giải thích được phần nào vì
sao có sự giới hạn loài về ký chủ đối với V. cholerae O1sinh độc tố (Boyd và Waldor,. 2008).
Hình 2.10: Trình tự di truyền V. cholerae (Blake, 1994)
2.4.3 Các yếu tố về độc lực
V. cholerae sử dụng hai yếu tố độc lực, độc lực từ tiên mao/roi (TCP)
và độc tố tả CTX. TCP, mã hóa cho các yếu tố gây bệnh, là một loại protein từ tiêm mao (Kirn et al, 2000), TCP cũng rất cần thiết cho sự hình thành khuẩn lạc của V. cholerae định vị trong ruột non của chuột sơ sinh (Taylor et al.,
30
trong ruột non thành công, V. cholerae sẽ tiết ra độc tố gây bệnh tả. Các độc tố kích thích các tế bào biểu mô ruột non tiết ra dịch lỏng trong lòng ruột non, từ đó có hiện tượng tiêu chảy mất nước. Do đó, sự đột biến ở roi của một số chủng V. cholerae sẽ ảnh hưởng đến yếu tố độc lực TCP, Hình sau biểu hiện
sự biến đổi về roi.
a. Chủng vi khuẩn hoang dại; b. Vi khuẩn đột biến gene; c. Vi khuẩn đột biến gene
Hình 2.11: Vi khuẩn đột biến roi (Ewen, 2008)
Nếu vi khuẩn mang gene đột biến sẽ dẫn đến khiếm khuyết trong việc lắp ráp roi (flagellum). Qua Hình 2.11, loài hoang dại (Hình 2.11a) không mang gene đột biến nên chiều dài roi dễ dàng nhìn thấy qua hiển vi điện tử; Hình (2.11b) vi khuẩn mang gene flgT đột biến nên không hình thành roi; Hình
(2.11c) vi khuẩn có roi ngắn hơn cũng do hiện diện gene đột biến roi fliA. Nhiều nghiên cứu trước đó đã cho thấy sự bùng phát dịch tả ở miền Bắc Việt Nam trong năm 2007 và đầu năm 2008 là do chủng V. cholerae O1 type sinh học El Tor đã biến thể từ type sinh học Cổ điển mang gene có độc tố CTXB. Chủng thuộc type sinh học El Tor này được lây lan vào miền Bắc Việt Nam trong năm 2007 và thường xuyên thay thế các chủng mang gene CTX của type cổ điển trên nhiễm sắc thể nhỏ, tương tự như phiên bản của các chủng phân lập ở Mozambique, và có liên quan đến sự bùng phát dịch tả tại Việt Nam năm 2007. Dữ liệu cho thấy kiểu gene của các chủng V. cholerae gây
bùng phát dịch tả ở miền Bắc Việt Nam từ năm 2007 và năm 2010 gây ra bởi một dòng duy nhất là type sinh học El Tor đã biến thể và đang chiếm ưu thế thay cho các type sinh học cổ điển trước đây (Nguyễn et al., 2009).
Trong một nghiên cứu của Trần et al. (2012) cho thấy chủng V. cholerae type sinh học El Tor có liên quan đến những chủng gây dịch tả tái
phát tại Việt Nam năm 2007-2010, đây là một biến thể của type sinh học El Tor có mang gene độc lực CTX của type sinh học cổ điển và mang gene kháng
31
kháng sinh của type sinh học El Tor có liên quan đến dịch tả tại Khon Kaen (Thái Lan). Theo thời gian, vi khuẩn có một quá trình biến đổi di truyền từ type sinh học El Tor biến thể gây bệnh ở Mozambique đã lan sang các nước châu Á, vì V. cholerae luôn hiện diện ngoài môi trường tự nhiên, từ đó vi
khuẩn phát triển tại Khon Kaen và sau đó xuất hiện ở khắp nước Thái Lan (Okada et al., 2012).
Trong lịch sử, bệnh tả đã được lưu hành trong nhiều thế kỷ trong khu vực sông Hằng, đồng bằng thuộc Vịnh Bengal. Bệnh dịch tả xảy ra ở Châu Phi và Châu Mỹ La Tinh và sau đó lan sang các nước châu Á (Blake, 1994). Năm 1991 V. cholerae O1 type sinh học El Tor lần đầu tiên gây bệnh bệnh dịch tả ở Châu Mỹ Latinh (Blake, 1994), và các chủng khác nhau được phát hiện sau đó vào năm 2009 (Beltra'n et al., 1999, Popovic et al., 1993, Nusrin et al., 2009). Tại Thái Lan, phần lớn các chủng V. cholerae O1 type sinh học El Tor có liên quan đến việc tái phát dịch tả từ năm 2003 đến 2011, những mẫu phân lập chủ yếu có nguồn gốc từ nước ngoài môi trường, điều đó phản ánh sự đa dạng di truyền trong quần thể V. cholerae (Alam et al., 2007), sau đó xuất hiện ở các nước Châu Á, Châu Phi (Ansaruzzaman et al., 2004) và các nước Châu Mỹ (Alam et al., 2006). Những bằng chứng có liên quan đến các chủng thuộc type sinh học El Tor đã biến thể và gây dịch bệnh ở Thái Lan, Việt Nam và Bangladesh thể hiện qua cây phát sinh loài, mặc dù những chủng này phát triển độc lập trong các hệ sinh thái khác nhau.
2.5 Cơ chế gây bệnh của V. cholerae
V. cholerae được chia thành các nhóm huyết thanh dựa trên các kháng
nguyên thân trên bề mặt. Các nhóm huyết thanh O1 và O139 bao gồm các chủng gây bệnh. Nhóm huyết thanh O1 có thể được chia thành ba type huyết thanh theo soma kháng nguyên và sau đó là hai biotypes theo kiểu hình cụ thể. Ogawa (soma kháng nguyên A và C), Inaba (A và B), và Hikojima (A, B và C) chỉ định type huyết thanh và chia thành các type sinh học (biotype) El Tor và cổ điển.
Type sinh học El Tor chiếm ưu thế trong hầu hết các bệnh nhiễm trùng (Lencer, 2001), hiện tại nhóm huyết thanh O1 và O139 chứng minh gây bệnh do sản xuất enterotoxin thúc đẩy sự tiết nước và chất điện giải vào ruột, dẫn đến tiêu chảy. Độc tố bệnh tả có chứa hai tiểu đơn vị A và năm tiểu đơn vị B. Các tiểu đơn vị B cho phép liên kết với thụ thể ganglioside (GM1) trên các tế bào biểu mô ruột. Màng cholesterol là rất quan trọng để các tương tác xâm nhập vào nội bào (endocytosis) của tiểu đơn vị A. Trong một thí nghiệm loại bỏ cholesterol từ màng biểu mô, nhà nghiên cứu nhận thấy rằng sự hiện diện
32
của nó tạo điều kiện cho CT-GM1 hình thành phức hợp xâm nhập vào nội bào.
Một thí nghiệm đã chứng minh rằng các mãng lipid giúp đính độc tố vào màng nội bào của các tiểu đơn vị A, giúp chuyên chở độc tố vào tế bào và bám vào bề mặt niêm mạc ruột (Lencer, 2001). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sau khi vào bên trong, các tiểu đơn vị A tách thành peptide A1 và A2. Peptide A1 ADP-ribosylates GTP-binding protein, do đó ngăn ngừa sự bất hoạt của nó. GTP-binding protein hoạt động bởi adenylate cyclase để hình thành cAMP. Sự gia tăng cAMP nội bào tạo sự hấp thu natri và clorua từ vi nhung mao và thúc đẩy sự tiết nước từ các tế bào crypt của ruột để bảo tồn sự cân bằng thẩm thấu (Torgersen et al., 2001).
Sự mất nước gây ra do tiêu chảy và nồng độ chất điện giải đẳng trương vào trong sinh chất. Mất nước xảy ra ở tá tràng, hồi tràng ít bị ảnh hưởng, ruột già là ít nhạy cảm với độc tố, và do đó vẫn có thể hấp thụ một số chất lỏng, tuy nhiên sẽ lấn át khả năng hấp thụ của kết tràng (Handa, 2003).
Hình 2.12: Cơ chế tạo độc tố ở ruột của V. cholerae (Basel, 2009) Theo Hình trên, phía bên trái V. cholerae di động có chứa protein ToxT Theo Hình trên, phía bên trái V. cholerae di động có chứa protein ToxT bị bất hoạt khi đi vào ruột non. Ở trung tâm, V. cholerae trong ruột tiếp xúc
với bicarbonate, ToxT trở nên hoạt động và bắt đầu sản xuất TCP. Ở bên phải, vi khuẩn xâm nhập vào lớp niêm mạc và tiếp xúc với bicarbonate, gene độc lực bắt đầu cảm ứng và bắt đầu sản xuất CT. Độ chênh lệch về nồng độ bicarbonate từ lòng ống với bề mặt niêm mạc được thể hiện bởi các tam giác bên phải, từ đó có hiện tượng tiêu chảy xảy ra.
33
2.6 Tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn
2.6.1 Khái niệm
Kháng sinh là tất cả những chất hóa học được chiết xuất từ môi trường nuôi cấy vi sinh vật, bán tổng hợp hay tổng hợp, chúng có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc tiêu diệt vi khuẩn bằng cách tác động chuyên biệt trên một giai đoạn chuyển hóa cần thiết của vi sinh vật. Với định nghĩa này, nhiều chất trước đây xếp vào nhóm chất kháng khuẩn tổng hợp như sulfonamide, quinolone, hiện nay cũng được xếp loại là kháng sinh. Những kháng sinh đầu tiên được mô tả và giới thiệu vào điều trị lâm sàng là những hợp chất được chiết xuất từ vi sinh vật như penicillin và aminoglycoside. Ngày nay, số lượng và chủng loại kháng sinh rất nhiều và đa dạng (Võ Thị Trà An và cs., 2010).
2.6.2 Cơ chế kháng kháng sinh
Sử dụng kháng sinh trong phòng và trị bệnh đem lại nhiều thành công và có hiệu quả kinh tế nhưng đồng thời đã tạo sự chọn lọc đối với vi khuẩn. Việc dùng kháng sinh đã tạo ra sự đề kháng với chính kháng sinh đó ở một mức độ nhất định trong quần thể vi khuẩn. Trước thập niên 1990, sự gia tăng về kháng kháng sinh chưa gây lo ngại trong điều trị các bệnh nhiễm trùng, nhưng ngày nay vấn đề này trở thành mối lo ngại rất lớn trên thế giới do hiệu quả của kháng sinh trong điều trị bệnh ngày càng giảm.
Đề kháng kháng sinh có thể chia làm 2 loại: đề kháng tự nhiên và đề kháng thu được. Đề kháng tự nhiên là tình trạng giống hoặc loài vi khuẩn nào đó không nhạy cảm với tác nhân diệt khuẩn là kháng sinh. Điều này có thể do vi khuẩn thiếu cấu trúc đích cho tác động của kháng sinh. Chẳng hạn, vi khuẩn không có thành tế bào như Mycoplasma thì đề kháng tự nhiên với kháng sinh nhóm β-lactam. Ngoài ra, đề kháng tự nhiên còn có thể do thành tế bào không cho kháng sinh thấm qua. Vi khuẩn Gram âm đề kháng tự nhiên với glycopeptide vì phân tử thuốc quá lớn, không qua màng vi khuẩn. Đề kháng thu được là kết quả của sự thay đổi trong hệ thống gene bởi đột biến hoặc sự truyền ngang thông tin di truyền từ vi khuẩn khác (Guardabbasi et al., 2004). Vi khuẩn phát triển nhiều cơ chế đề kháng để tạo nên sự kháng kháng sinh.
Sự đề kháng này đã được nghiên cứu và ghi nhận với các cơ chế chủ yếu sau: (1) sản xuất enzyme làm bất hoạt kháng sinh; (2) thay đổi điểm tiếp nhận làm giảm gắn kết của kháng sinh với điểm tiếp nhận; (3) giảm hấp thu kháng sinh vào tế bào vi khuẩn; (4) đẩy kháng sinh ra ngoài bằng bơm thoát dòng, làm giảm nồng độ kháng sinh trong tế bào vi khuẩn khuẩn (Guardabbasi
34
Kháng sinh nhóm β-lactam có đặc điểm để nhận biết là vòng β-lactam (penicillin, cephalosporin, carbapenem, oxapenam và cephamycin). Vòng β- lactam quan trọng cho hoạt động của nhóm kháng sinh này vì nó làm bất hoạt enzyme transpeptidase- chất xúc tác của giai đoạn cuối trong quá trình tổng hợp peptidoglycan của vi khuẩn. Hoạt động của nhóm này dựa vào khả năng tiếp cận và phong bế PBP (penicillin binding protein). Đề kháng với kháng sinh nhóm β-lactam chủ yếu do: (1) Enzyme khử hoạt tính thuốc: Sự hiện diện của enzyme β-lactamase phá hủy vòng lactam hoặc (2) Thay đổi điểm đích của thuốc: Sự hiện diện của các PBP biến đổi, thay thế PBP (penicillin binding protein) của vi khuẩn làm penicillin không thể gắn kết được hoặc (3) Bơm thuốc ra: Thuốc được bơm ra ngoài với bơm được mã hóa bởi gene MexAB- OprM.
2.6.2.1 Cơ chế enzyme khử hoạt tính thuốc:
Vi khuẩn sản xuất enzyme có thể thay đổi hoặc làm giảm tác dụng của kháng sinh, bằng cách này chúng phá hủy hoạt tính của kháng sinh. Cơ chế này được biết đến nhiều nhất và sớm nhất với penicillinasephá hủy vòng β- lactam, biến penicillin thành penicilloic acid, làm mất tác dụng của thuốc (Võ Thị Trà An và cs, 2010).
2.6.2.2 Cơ chế thay đổi điểm đích của thuốc:
Mỗi chất kháng sinh có đích tác động, điểm gắn kết khác nhau ở vi khuẩn. Các đích cho kháng sinh có thể bị thay đổi hoặc được bảo vệ bởi sự gắn kết của một protein, do đó thuốc không thể gắn vào và tác động đến vi khuẩn. Cơ chế đề kháng này xảy ra với hầu hết kháng sinh. Kháng sinh nhóm β-lactam tác động bằng cách gắn vào cấu trúc trên thành tế bào vi khuẩn gọi là penicillin binding protein (PBP). Các chủng Staphylococcus aureus kháng methicillin có một yếu tố di truyền gọi là SCCmec (Staphylococcal cassette chromosome mec) chứa gene meA mã hóa cho sự sản xuất một PBP biến đổi (PBP2a), không bị tác động bởi sự gắn kết của kháng sinh nhóm β-lactam. Những vi khuẩn có gene này có khả năng đề kháng nhiều kháng sinh nhóm β- lactam, ngay cả carbapenem (Võ Thị Trà An và cs, 2010).
2.6.2.3 Cơ chế bơm thuốc ra (efflux pumps):
Hệ thống bơm thoát dòng có tác dụng chuyển kháng sinh ra ngoài, làm giảm nồng độ thuốc trong tế bào của vi khuẩn. Trước đây, cơ chế này được biết đến như là một trong những cơ chế chính của vi khuẩn kháng với kháng sinh nhóm tetracycline (tetracycline, minocycline, doxycyc-line) mã hóa bởi gene Tet (Tet-pump). Hiện nay, cơ chế này được đề cập đến như là một cơ chế đề kháng nhiều nhóm kháng sinh (đa đề kháng) với các bơm được mã hóa bởi
35
các gene MefA/E (đề kháng nhóm macrolides), AmrAB-OprA, MexXY- OprM và AcrD (đề kháng nhóm aminoglycosides), MexAB-OprM (đề kháng nhóm β-lactam), AcrAB-TolC và Mex (đề kháng nhóm flouroquinolones) (Võ Thị Trà An và cs, 2010).
2.6.2.4 Cơ chế lan truyền gene kháng kháng sinh:
Vi khuẩn mang gene kháng kháng sinh sẽ được truyền dọc từ thế hệ này sang thế hệ khác qua sự nhân lên của tế bào hoặc có thể được truyền ngang từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác. Cơ chế lan truyền gene đề kháng có thể xãy ra ngay trong tế bào và có thể truyền từ phân tử ADN này sang phân tử ADN khác nhờ cơ chế của gene nhảy; hoặc lan truyền giữa các tế bào thông qua các hình thức vận chuyển di truyền như tiếp hợp, biến nạp, tải nạp, gene đề kháng chuyển từ tế bào này sang tế bào khác trong cùng một loài hoặc khác loài; hoặc lan truyền trong quần thể vi sinh vật thông qua sự chọn lọc dưới tác dụng của kháng sinh, những vi khuẩn đề kháng được chọn lọc và phát triển sẽ thay thế những vi khuẩn nhạy cảm; sự lan truyền cũng xãy ra trong quần thể đại sinh vật, vi khuẩn đề kháng sẽ được lây lan từ người này sang người khác qua con đường trực tiếp hoặc gián tiếp (Guardabbasi et al., 2004).
2.6.3 Sự kháng kháng sinh do V. cholerae ở các nước trên thế giới
Năm 1979, một đợt bùng phát dịch tả do đa kháng thuốc của V. cholerae xảy ra ở Matlab thuộc Bangladesh cho thấy có 16,7% các chủng
kháng với các kháng sinh như tetracycline, ampicillin, kanamycin, streptomycin, và trimethoprim-sulfamethoxazole và 10% các chủng khác kháng với bốn loại trong số những kháng sinh bao gồm cả tetracycline. Một plasmid kháng kháng sinh cũng được xác định trong các mẫu phân lập và đã được kết hợp với Escherichia coli K-12 do sự di truyền gene. Một nghiên cứu về dịch tễ cũng chứng minh rằng các chủng V. cholerae kháng nhiều loại
thuốc, trong đó đặc biệt là tetracycline (Glass et al., 1980). Đến năm 1986, vi khuẩn kháng kháng sinh đã có sự thay đổi, và các chủng V. cholerae phân lập từ bệnh nhân mắc bệnh tả năm 1986 tại Dhaka không còn kháng với tetracycline, streptomycin, chloramphenicol, amoxicillin, hoặc acid nalidixic (Nakasone et al., 1987). Tuy nhiên, trong năm 1988 và năm 1989, gần như tất cả các chủng V. cholerae type sinh học cổ điển ở Bangladesh đều kháng với
tetracycline trong khi các chủng thuộc type sinh học El Tor là nhạy cảm với tetracycline (Siddique et al., 1989). Đến năm 1991, chủng V. cholerae type
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});