phân lập và một số chủng tham khảo
Lịch sử tiến hóa được suy ra bằng cách sử dụng phương pháp Neighbor-Joining [1.Saitou, 1998]. với tổng chiều dài các nhánh = 29.77292208, khoảng cách tiến hóa sử dụng để suy ra cây phát sinh loài [2.Tamura, 2004]. Phân tích liên quan đến 31 trình tự nucleotide. Vị trí codon bao gồm là 1 + 2 + 3 + không mã hoá. Tất cả các mục có chứa khoảng trống và dữ liệu bị mất đã được loại bỏ. Có tổng cộng 436 vị trí trong số liệu cuối cùng. Phân tích tiến hóa được thực hiện tại MEGA5 [3.Tamura, 2011].
Trong nghiên cứu này, những chủng đại diện thuộc loài Vibrio spp. phân lập được gồm chủng Ng3, O3.2, O1.2, N8 và O9.1 có tỉ lệ tương đồng về trình tự nucleotide sản phẩm PCR của các chủng phân tích với các chủng khác thuộc loài V. cholerae là rất cao, ví dụ trình tự chủng Ng3 sẽ có tỉ lệ tương
đồng 100% với 56 chủng; tương đồng 99% với 32 chủng và tương đồng 99% với 12 chủng gần. Riêng loài có trình tự nucleotide thuộc loài V.
81
mối quan hệ họ hàng với những loài trên, cùng hình thành từ một tổ tiên chung.
Bảng 4.11: Mức tương đồng của V. cholerae (Ng3) với các chủng V. cholerae khác trên Genbank bằng công cụ BLAST
Số hiệu gene Chủng Tổng số điểm Tỉ lệ che phủ Mức ý nghĩa Độ tương đồng KM051434.1 V. cholerae strain V3 16S 1386 100% 0.0 100% KM051097.1 Vibrio sp. BAB-3748 16S 1386 100% 0.0 100% KJ725362.1 V. cholerae strain N2 16S 1386 100% 0.0 100% KJ734982.1 V. cholerae strain KNM4 1386 100% 0.0 100% AP014524.1 V. cholerae MS6 DNA, 1386 100% 0.0 100% KJ413142.1 V. cholerae strain
KY1143 16S
1386 100% 0.0 100%
KF661544.1 V. cholerae strain CA17 16S
1386 100% 0.0 100%
KF661543.1 V. cholerae strain CA6 16S
1386 100% 0.0 100%
KF661542.1 V. cholerae strain CA2 16S
1386 100% 0.0 100%
KF652073.1 V. cholerae strain CA1 16S
1386 100% 0.0 100%
……….. ……56 chủng…… ……… ………. ………… ………….
NR_119302.1 V. cholerae strain ATCC 14547 16S
1382 100% 0.0 99%
EU130474.1 V. cholerae strain ATCC 14547 16S
1382 100% 0.0 99%
AM989315.1 Vibrio sp. AKB-2008- HE50 partial 16S
1382 100% 0.0 99%
AM989313.1 Vibrio sp. AKB-2008- HE42 partial 16S 1382 100% 0.0 99% KC835134.1 V. cholerae strain MW-D 2306 16S 1380 100% 0.0 99% KC835133.1 V. cholerae strain MW-D 2305 16S 1380 100% 0.0 99% KF886647.1 V. cholerae strain NSTH36 16S 1380 100% 0.0 99%
KF652074.1 V. cholerae strain CA4 16S
1380 100% 0.0 99%
NR_074816.1 V. cholerae O395 1380 100% 0.0 99%
…………. ……..32 chủng …… ………. …….. ……….. 99%
82
Trình tự nucleotide của các đoạn gene có ký hiệu V.cholerae-Ng3, V.cholerae-O3.2, V.cholerae-O1.2, V.paraheamolyticus-O9.1 và V. cholerae-
N8 được so sánh với 26 chủng V. cholerae phân lập các nguồn từ lâm sàng và môi trường ở một số vùng có vị trí địa lý gần với Việt Nam.
Nghiên cứu này đã phân lập và phát hiện nhiều chủng thuộc Vibrio spp. Tuy nhiên, chỉ phân tích đa dạng di truyền và mối quan hệ chủng loài của các chủng V. cholerae từ mẫu hải sản như nghêu (Ng3), mẫu huyết heo từ cơ sở
giết mổ đã xử lý bằng nguồn nước từ sông rạch (O3.2 và O1.2), mẫu nước trực tiếp từ sông tại Thành phố Trà Vinh (N8) và đặc biệt mẫu nước từ ao nuôi tôm tại vùng nước mặn thuộc huyện Duyên Hải là loài V. paraheamolyticus
(O9.1), đây là loài được phân lập chiếm tỉ lệ cao nhất là 32% trong tổng số 5 loài được phát hiện.
Qua Bảng 4.11 các chủng vi khuẩn V. cholerae sử dụng so sánh và
phân tích di truyền và quan sát từ cây phát sinh loài, các chủng V. cholerae
được phân lập đa dạng từ nhiều nguồn, thời gian và các vùng địa lý khác nhau: nguồn nước biển từ Phần Lan (AM989317.1, 2008); cá ngừ ở China (JF939043.1, 2011 và KJ725362.1, 2014); tôm ở China KF307775.1, 2013 và India (JN645057.1, 2013); nước từ kênh rạch và môi trường ở Brazil (CP002555.1, 2011) và Malaysia (HM590224.1, 2010); nước từ rừng ngập mặn ở India (KJ734982.1, 2014); mẫu từ phân bệnh nhân ở Haiti (CP003069.1, 2010), ở China (JX290082.1, 2012) và ở Thái Lan-Myanma (CP003069.1, 2013) và một số chủng khác.
Đối với chủng N16961 phân lập từ mẫu phân bệnh nhân ở Bangladesh năm 1971, thuộc type O1, type huyết thanh Inaba, type sinh học El Tor (mã số Genbank: AE003852.1), đây là chủng vi khuẩn hoang dại, nhiều nghiên cứu đã chứng minh những chủng có liên hệ gần với chủng N16961 đều có khả năng phát triển thành tác nhân gây bệnh cho con người, thông qua việc thu nhận gene TCP và CTX. Ngoài ra cũng có nhiều thử nghiệm cho rằng những chủng V. cholerae phân lập ngoài môi trường không có khả năng gây bệnh như non-O1 hoặc non-O139 không mang gene độc lực thường kết hợp với các chủng có độc lực và gây bệnh. Những nghiên cứu này sẽ cung cấp một lịch sử tiến hóa gần như hoàn toàn đối với các sinh vật bên ngoài môi trường như loài
V. cholerae (Binh Minh Nguyen, 2009).
MS6 được phân lập từ mẫu phân người ở Myanmar giáp với Thái Lan, các yếu tố độc lực chính của V. cholerae bao gồm độc tố gây tiêu chảy (CTX) và độc tố tiêm mao (TCP) liên quan đến sự bám dính vào đường ruột. Các gene liên quan đến các độc lực trên của chủng MS6 có trình tự tương đồng với chủng V. cholerae O1 N16961 phân lập từ các mẫu ở đại dịch thứ bảy từ năm
83
1961 đến 1975 (Dziejman et al., 2002). Điều đó chứng tỏ các chủng V. cholerae phân lập từ môi trường nước và thức ăn hải sản có tiềm năng mang
các gene có yếu tố độc lực khi có cơ hội xâm nhập vào cơ thể người.
Điều này có thể chứng minh qua các giai đoạn xảy ra dịch bệnh tại Việt Nam từ năm 1995 đến 2004, 12 chủng phân lập ở Miền Bắc được xác định là type O1, type huyết thanh Inaba, type sinh học El Tor, có chứa gene độc lực CTX trên nhiễm sắc thể nhỏ, tương tự như chủng được phân lập ở Mozambique (Châu Phi) (O’Shea et al., 2004) nhiều nghiên cứu chứng minh những chủng này đã gây ra đại dịch vào năm 2007 đến năm 2008 ở Việt Nam.
Ở Việt Nam, trong năm 2007, sự bùng phát dịch tả ở miền Bắc, nơi chỉ có một vài trường hợp bệnh tả trước đây đã được báo cáo (Dalsgaard et al.,
1999). Các chủng V. cholerae gây nên dịch bệnh này là biến thể thuộc type
sinh học El Tor kết hợp với type sinh học cổ điển (Nguyen et al., 2009).
Trường hợp dịch tả mới tiếp tục được phát hiện ở một số tỉnh phía Bắc đến năm 2010, đặc biệt là tại Hà Nội. Các chủng V. cholerae liên quan tới sự bùng phát dịch tả từ năm 2007 đến năm 2010 ở phía Bắc chưa đặc trưng. Hơn nữa, vẫn còn thiếu thông tin về sự đa dạng di truyền giữa chủng V. cholerae phân lập từ các bệnh nhân năm 2007 đến 2010. So sánh với các nghiên cứu trước đây ở các tỉnh phía Nam, các chủng gây dịch năm 2010 biểu hiện mối liên hệ di truyền gần với đa số các chủng phân lập trước đó trong khu vực. Trong đó có những chủng giống nhau hoàn toàn với các chủng từ Campuchia và phía Bắc, chủng vi khuẩn gây bệnh tại phía Nam năm 2010 có thể bắt nguồn từ Ấn Độ năm 1993 (Nguyễn Hoàng Vũ et al., 2011).
Nhiều nghiên cứu về độc lực của V. cholerae cũng cho rằng kết quả để trở thành chủng có độc lực là sự chuyển gene theo chiều ngang từ một vi khuẩn lành tính có thể nhanh chóng phát triển thành một tác nhân gây bệnh nguy hiểm cho con người. Sự chuyển đổi này có thể được thực hiện bằng việc nhận hai yếu tố truyền nhiễm quan trọng là VPI và TCP, trong đó TCP mã hoá độc tố ở roi cần thiết cho việc hình thành khuẩn lạc trong đường ruột, và thể thực khuẩn CTXP mã hóa cho độc tố CT dẫn đến các triệu chứng đặc trưng của bệnh tả là gây tiêu chảy. Các VPI, được tìm thấy trong các chủng gây bệnh và rải rác trong các chủng bên ngoài môi trường (Karaolis et al., 1998). Các
yếu tố này có thể di truyền từ chủng này đến chủng khác trong cùng một loài, sau khi V. cholerae nhận VPI và mang gene mã hoá TCPA, từ đó tiếp nhận
CTXP, vì đây là thể thực khuẩn gắn TCPA như thụ thể của nó (Waldor et al., 1996).
Sự tiến hoá của các nhóm huyết thanh V. cholerae O1 và một số loài
84
chúng xuất phát từ một tổ tiên chung. Các đặc điểm di truyền của MS6 tương tự những chủng mang gene 2740-80 được phân lập từ Bờ Vịnh ở Mỹ (Kazuhisa, 2014). Những nghiên cứu phân tích bộ gene hoàn chỉnh của chủng MS6 cho thấy chúng có mối liên quan xa với chủng gây bệnh V. cholerae O1 biotype El Tor, nghiên cứu này cũng chứng minh nhiễm sắc thể 1 và 2 của MS6 đã thường xuyên được sửa đổi bởi sự chuyển gene ngang từ các loài vi khuẩn Vibrios khác sau khi phân kỳ từ một tổ tiên chung. Các tính năng di
truyền của chủng MS6 tương tự hầu hết với chủng 2740-80.
Từ đó, suy diễn các trình tự nucleotide của các chủng vi khuẩn trong nghiên cứu này có những đặc điểm tương tự như MS6 và đều có nguồn gốc từ môi trường, chứng tỏ những chủng thuộc Vibrio spp. luôn có nguy cơ tiềm ẩn và sẽ dễ dàng gây thành dịch bệnh do tiếp nhận các gene từ các chủng có độc lực CTX.
4.4 Sự kháng kháng sinh của V. cholerae
4.4.1 Kết quả khảo sát sự kháng kháng sinh của V. cholerae bằng phương pháp Kirby Bauer (CLSI, 2010) phương pháp Kirby Bauer (CLSI, 2010)
Kết quả khảo sát sự kháng kháng sinh của 6 chủng thuộc V. cholerae được trình bày qua Bảng 4.12:
Bảng 4.12: Sự nhạy cảm và kháng kháng sinh của V. cholera phân lập.
Kháng sinh Ký
hiệu
Số mẫu kiểm
tra
Nhạy cảm Trung gian Kháng
Số
mẫu % Số mẫu % Số mẫu %
Streptomycin Sm 6 3 50 0 0 3 50 Norlfoxacin Nr 6 6 100 0 0 0 0 Ampicillin Am 6 5 83 0 0 1 17 Tetracyclin Te 6 4 67 0 0 2 33 Azithromycin Az 6 4 67 0 0 2 33 Amoxicillin- clavulanic axit Ac 6 5 83 0 0 1 17 Trimethoprim- sulfamethoxazole SXT/ Bt 6 4 67 0 0 2 33 Vancomycin Van 6 2 33 0 0 4 67
85
Hình 4.7: Kết quả thực hiện kháng sinh đồ
Ghi chú: Sm (streptomycin), Nr (norfloxacin), Am (ampicillin), Te (tetracycline) Az(azithromycin), Ac (amoxicillin-clavulanic axit), Bt (trimethoprim- sulfamethoxazole), và Van (vancomycin).
Các kết quả trên cho thấy, các chủng V. cholerae trong nghiên cứu này còn nhạy cảm cao với nhiều loại kháng sinh được sử dụng trên lâm sàng như norfloxacin (100%), ampicillin (83%) và amoxicillin-clavulanic axit (83%). Ngoài ra, V. cholerae kháng với vancomycin (67%), streptomycin 50%,
tetracycline 33%, azithromycin 33%, trimethoprim-sulfamethoxazole 33% và vancomycin 67%. Kết quả trong nghiên cứu này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Xuân Trang và Nguyễn Ngọc Tuân (2012), cho thấy V. cholerae nhạy cảm hoàn toàn với norfloxacin (100%), những chủng V.
cholerae phân lập ở miền Bắc Việt Nam từ năm 2007 đến 2010 cũng luôn
nhạy với các loại kháng sinh như norfloxacin (100%) và kháng với tetracycline (29%) (Huu Dat Tran et al., 2012).
Hầu hết những chủng V. cholerae O1 phân lập ở Việt Nam từ năm
2000 kháng với tetracycline, chloramphenicol và đề kháng cao với sulfamethoxazol-trimethoprim, sự đề kháng của những chủng này rất khác với những chủng phân lập vào năm 1995 nhưng lại có cùng đặc điểm với các chủng phân lập ở đại dịch thứ bảy và đã phân bố rộng rãi ở các nước Đông Nam Á (Nguyen Binh Minh, 2002; Jain et al., 2011).
Nhìn chung, những chủng V. cholerae phân lập trong nghiên cứu này
có những đặc điểm về kháng kháng sinh tương tự như những chủng phân lập trong nước là nhạy cảm cao với norfloxacin (100%), ampicillin (83%); đặc biệt kháng với tetracycline 33% và trimethoprim-sulfamethoxazole 33%.
86 0 20 40 60 80 100 Sm Nr Am Te Az Ac Bt Van Nhạy Trung gian Kháng
Hình 4.8: Tỉ lệ nhạy cảm và kháng kháng sinh đối với V. cholerae
Trong các chủng V. cholerae đã phân lập, cho thấy có nhiều chủng đa kháng kháng sinh, chủng O3.2 (T1) kháng với 3 loại kháng sinh tetracycline, vancomycin, azithromycin; chủng O1.2 kháng với 3 loại kháng sinh ampicillin, vancomycin, trimethoprim-sulfamethoxazole; chủng N8 (T3) kháng với 2 loại kháng sinh tetracyclin, vancomycin; chủng 81V1 kháng với 2 loại kháng sinh là azithromycin và amoxicillin-clavulanic axit; chủng Ng3 kháng với 2 loại kháng sinh streptomycin và vancomycin.
Bảng 4.13: Sự đa kháng kháng sinh của V. cholerae
Mã code (n=6)
Kháng sinh Tỉ lệ (%)
O3.2 (T1) Te,Va, Az 37,5 O1.2(T2) Am, Va, Bt 37,5
N8 (T3) Te, Va 25,0
85V1(T4) SXT/Bt 12,5
81V1(T5) Az, Ac 25,0
Ng3(T6) Sm, Va 25,0
Ghi chú: Sm (streptomycin), Nr (norfloxacin), Am (ampicillin), Te (tetracycline) Az(azithromycin), Ac (amoxicillin-clavulanic axit), Bt (trimethoprim- sulfamethoxazole), và Van (vancomycin).
Hầu hết những chủng thuộc Vibrio phân lập từ Việt Nam đều đa kháng thuốc phổ biến nhất là nalidixic acid, co-trimoxazole và tetracycline. Tetracycline là kháng sinh dùng phổ biến trong điều trị bệnh tả, ở miền Bắc Việt Nam từ năm 2007 đến 2010, tất cả chủng V. cholerae đều kháng với
Tỉ lệ
87
tetracycline là 29% (Hưu Dat Tran et al., 2012). Cả hai kháng sinh
tetracycline và doxycycline thuộc nhóm kháng sinh tetracycline và sẽ có sự đề kháng chéo giữa các nhóm vi khuẩn thuộc Vibrios. Nếu sử dụng doxycycline
để điều trị bệnh do V. cholerae thì vi khuẩn này có thể sẽ kháng với
tetracycline, do đó cần phải được theo dõi thường xuyên nhóm kháng sinh này (Fluit et al., 2005).
Các đặc tính chung của V. cholerae O1 ở Việt Nam đã được làm sáng tỏ trong nghiên cứu đối với những mẫu phân lập vào năm 2000. Tính nhạy cảm kháng sinh của V. cholerae O1 ở Việt Nam phân lập vào năm 2000 vừa kháng tetracycline và chloramphenicol và vừa kháng Sulfamethoxazol-trimethoprim, nhạy với các kháng sinh ampicillin, erythromycin, acid nalidixic và ofloxacin, rất khác với những chủng phân lập vào năm 1995, nhưng lại rất tương tự với những chủng phân lập tại Lào sau năm 1998 (Phantouamath et al., 2001), và
những chủng phân lập ở Thái Lan. Những chủng phân lập ở Việt Nam có kiểu hình rất tương tự như chủng phân lập tại Lào, điều này chứng tỏ có gene trung gian nằm trên nhiễm sắc thể gọi là plasmid kháng lại tetracycline và một số kháng sinh khác (Glass et al., 1980).
Từ năm 2008 – 2010, V. cholerae phân lập tại Việt Nam đa đề kháng với các loại kháng sinh: ampicillin, tetracycline và trimethoprim- sulfamethoxazole (Huu Dat Tran et al., 2012), tương tự sự đề kháng này cũng xảy ra ở Khon Kaen, (Thái Lan) năm 2007. Điều đó cho thấy các chủng kháng thuốc xuất hiện ở 2 nước láng giềng và sẽ lan truyền đến các nước lân cận khác. Hầu hết các V. cholerae O1 phân lập ở Thái Lan từ năm 2003 đến năm 2011 đều có khả năng kháng lại trimethoprim-sulfamethoxazole, tetracycline một loại thuốc thường xuyên được sử dụng để điều trị bệnh tiêu chảy cấp và bệnh tả (Supawat et al., 2009).
Kết quả của các nghiên cứu về đa kháng kháng sinh đều phù hợp với kết quả trong nghiên cứu này là ampicillin, tetracycline và trimethoprim- sulfamethoxazole.
4.4.2 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của một số kháng sinh đối với
V. cholerae
Kết quả nghiên cứu xác định nồng độ ức chế tối thiểu trên một số loại kháng sinh như amoxicillin, tetracycline, norfloxacine và azithromycin đang được sử dụng trong điều trị bệnh tả ở nhiều nước thể hiện qua Bảng 4.14.
88
Bảng 4.14: Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu của kháng sinh đối với V. cholerae
Kháng sinh Ký hiệu Lượng kháng
sinh (μg) Nồng độ MIC (μg/μl) Amoxillin Ax 10 4 Tetracycline Te 30 < 1 Norfloxacine Nr 10 0.25 Azithromycin Az 30 < 1
Từ kết quả, nhận thấy giá trị xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với các loại kháng sinh lần lượt là 4μg/μl, <1μg/μl, 0.25 μg/μl và < 1μg/μl. So sánh kết quả trong nghiên cứu này với các kết quả của các nghiên cứu khác cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu của tetracycline đối với vi khuẩn
V. cholerae luôn có sự thay đổi tuỳ theo lịch sử điều trị và từng vùng địa lý khác nhau, theo Nguyen et al (2002) nồng độ ức chế tối thiểu của tetracycline là 3.13μg/μl. Nhiều nghiên cứu tại Lào đã xác định nồng độ ức chế tối thiểu của tetracycline đối với vi khuẩn V. cholerae liên tục từ năm 1994 đến năm 1996 từ 0,2-0,4 μg/μl. Tuy nhiên đến năm 1998-1999 tất cả các chủng phân lập được kháng với tetracycline có giá trị MIC từ 3,13-6,25μg/μl (cao hơn 16 lần so với năm 1996) (Phantouamath et al., 2001).
Năm 1997, ở Pondicherry Ấn Độ, giá trị MIC của những chủng V. cholerae phân lập được đối với tetracycline là 0,5μg/μl, với norfloxacin là
0,004-1μg/μl, giá trị này cũng sấp xỉ kết quả MIC đối với tetracycline và norfloxacin trong nghiên cứu này là nhỏ hơn 1μg/μl và 0,25 μg/μl.
Ở Bangladesh giá trị MIC đối với kháng sinh azithromycin cũng dao động trong khoảng 0,7-3μg/μl (Faruque et al., 2007) gần với giá trị MIC trong nghiên cứu là nhỏ hơn 1μg/μl.