90
Ở Việt Nam, sự bùng phát bệnh dịch tả vào những năm 1995, 2000 và 2002 bởi những gene khác nhau của V. cholerae O1 gây ra, chúng từng xuất hiện và biến mất. Nhiều giả thiết cho rằng những nhóm vi khuẩn này luôn hiện diện trong hệ vi khuẩn ngoài môi trường, chúng sinh sản rất nhanh; hoặc chúng có thể lan truyền từ các nước khác và từng nhóm sẽ tạo ra sự bùng phát dịch bệnh; mặt khác, trong một nhóm vi khuẩn sẽ trải qua quá trình trao đổi gene, chèn thêm hoặc xoá các gene kháng kháng sinh, từ đó xuất hiện một nhóm vi khuẩn kháng thuốc mới (Ehara et al., 2004).
4.4.4 Kết quả giải trình tự các đoạn gene kháng kháng sinh
Kết quả chuỗi trình tự chủng V. cholerae gene DKKS-T1- TraVinhVN-2014 có số nucleotide ban đầu là 1100 được trình bày qua Bảng 4.15
Bảng 4.15: Bảng trình tự nucleotide
Gene_DKKS_T1_TraVinhVN_2014
>Gene_DKKS_T1_TraVinhVN_2014 (1100 nucleotide)
1 GAA TTA CTT AGC GAT GCA GCA GCG AAG TCA AAA CCT ACG CTG AAA
46 CAT ATT TCT ACC TTC GTG CTT GGA GTG CTC CAG CCG CAC TCC TTA
91 ACT TTG TGC TAT TGG GCT GGT TAC TCG GTA CGC AAA ATG CCC GCG
136 CCC CGA TGT GGA TGG TGA TCA TCA CCA ACC TCA CCA ATA TTG TGC 181 TCG ATC TAC TAC TCG TAC TCG GAC TAG GGC TAA AAG TCG AAG GAG 226 CCG CCA TTG CGT CGG TTA TCG CCG ATT ATG CTG GTC TCT TGT TTG 271 GTC TGC TGT GCG TGG TGC GTT ACT GGC GGC AGC ATC AGC TCC CAG 316 CGC CCT TCT CTT TCA TCC CCT CTC TCA CCA AAG AGC TTT CCC GTT 361 TAG TGG CGC TCA ATC GTG ATA TCT TCC TGC GCT CAC TCT GTC TGC 406 AAG CCG TAT TTA GCT TTA TGA CCT TTC AAG GCG CAG CGT TGG GAG 451 ATG ACA TCG TCG CCG CTA ATG CGG TGC TGA TGA GCT TTT TGA TGA 496 TGA TTT CCT ACG GTA TGG ATG GAT TTG CCT ACG CGA TGG AAG CCA 541 TGG TCG GTA AAG CAA TGT TGT CCA GGC AGA CTT GCG ACG GAT TCA 586 CCG CAT CAT TTT CAC CTA TCT CCG GCT GGA AAG TGC CGG GGG CAA 631 GAT CTT CCA TAC TGG AGA CAC TCA CGG GAA GAA TCA CAT TCG ATT 676 TAA GAC ACC TCA CCT CCA GAT GGC GGT TGA TTG GGC GAA CCT CTT 721 GAC TAC GAT TCA TGT GGT AAA GCT GAC CAG GGG TAG ACG GAA CAA 766 CCA CCT GCG ATG TTT TGC TCA CTC ACA CAT CTG CAA GAT AGG CTA 811 TAG ACC TGG ATA GGA CTG GTC AGG GCT CTC TGG ACT TCA TAA ATG 856 GTG TGG GCG TTC AGC GAT ACA TCA GGC CAC ATT AGA CTC CCG CGC 901 TTC TGT ACT GCC GAG GGA GTA TAA AGC TGG TGC AAT TAA CCA GCC 946 TGA CGC ACC GTT TAG CAA AAT TCA CCC AAA ACT GTG CTT CCC CAC 991 AAA CGT CAA ACC GCT AAG GCT TCC GGC AGT CGG CCA TAG CCC GTA 1036 TTT CGA ATG CCA TTA CGG CCT TCC TCT GGA ACA ATA CTG AGT TCA 1081 AAG AAC TTT CCA AAA CCG GG- 1100
91
Kết quả chuỗi trình tự chủng V. cholerae gene DKKS-T3-TraVinhVN- 2014 có số nucleotide ban đầu là 1077 được trình bày như sau:
Bảng 4.16: Bảng trình tự nucleotide
Gene_DKKS_T3_TraVinhVN_2014
>Gene_DKKS_T3_TraVinhVN_2014 (1077nucleotide)
1 TGC GTG TAT CTG CGT TTG AAC CTC GGA TAA ACC GCT GCC ACT GGA
46 GCA TAT CGA GCC CGC GAG CGA TCT CTA CAA ACG CTT TGA CTC CGC
91 CGC CAT GTC GAT TGG CGC GTT AAG CCC AGA AGC CCA TGA AGC GTT
136 AGC CAC CGC GAT GAA CCG CCT AGG CGG CTA TTC CAA CTC AGG TGA 181 AGG TGG TGA AGA TCC ACG CCG TTT TGG CAC TGA GCG TAA CTC ACG 226 TAT CAA GCA ATG TTG TCC AGG CAG ACA TGG CCA GCG CCC CAC CCT 271 TTG CCC GAC CGG CTG AGA TGC CGA AGC TTG ACG ACC TGT ACA ATC 316 GTA ATC AAT CTG GCT GGA TCT TGC TGA TAG AAC CAA GAG GGG GGG 361 GGC AAG ATG GTA AAA GGG ATG TGG GCC TCG TAG AGA CAC CAG ACG 406 TAA TCC ACC ACA TTG GTG TAA TTT GCA ATG GCC GCT TGT ACT TCT 451 TCC AAA GGG AAT GGG TAC AAC TGT TCG ATA CTA ACA ATC TCC ACG 496 TCT TGC TGT TCA TTG GCT CGG CGC TGT TCA AGG AGA TCG TAA TAA 541 ACC TTA CCA GAA CAG AAC ACA ACG CGT TTT ACT TGC GAC GGA TTC 586 AGC GCA TCA ATT TCA CCA ATC GCC GGC TGG AAA GTA CCG TGG GCA 631 AGA TCT TCC ATA CTG GAG ACA CAC AGT GGA TGA CGC AGC AGC GAT 676 TTA GGA GAC ATC ACC ACC AGA GGG CGG CGC ATT GGG CGA ACC ACT 721 TGA CGA CGA ATC ATG TGG TAA ACC TGA GCA GGG GTA GAC GGA ACA 766 ACC ACC TGC ATG TTT TGC TCA GCA CAC AGC TGC AAG TAA CGC TCT 811 AAA CGT GCA GAG GAG TGC TCA GGG CCT TGG CCT TCA TAA CCG TGT 856 GGC AGC AAC ATA GTC AGG CCA CAT AGA CGA CCC CAC TTC TGT TCA 901 CCA GAG GAG ATA AAC TGG TCA ATA ACC ACC TGC GCA CCG TTA GCA 946 AAA ATC ACC AAA ACT GTG CTT CCC ACA ACG TCA AAC CGC TAG GCT 991 CCG CTG TCG CAT AGC CCG GTA TTC GAA TGG CCA ATT ACG ACT TCC 1036 TTT CCT GAC CAA TAC CTG AGT CAA GAC TTT CAA AAC GGG GGC 1077
92
4.4.5 So sánh trình tự nucleotide của chủng V. cholerae T1, T3 với chủng V. cholerae hoang dại N16961 tìm các dạng đột biến
Trình tự nucleotide của chủng V. cholerae T1, T3 với chủng V. cholerae hoang dại N16961 được so sánh qua Hình sau:
93
Hình 4.10: So sánh các vị trí nucleotide được chèn vào và mất đi
Các vị trí nucleotide được chèn vào và mất đi sẽ tương ứng với các vị trí acid amin sẽ thay đổi trong chuỗi trình tự của các chủng V. cholerae, từ đó suy luận về kiểu đột biến của chủng V. cholerae phân lập (Bảng 4.17).
94
Bảng 4.17: So sánh vị trí các acid amin của chủng V. cholerae hoang
dại N16961 với chủng V. cholerae T1
Codon Thay đổi
Nucleotide
Thay đổi acid amin
Số nucleotide
T1 mất
Kiểu đột biến
14 AGT→CTG Ser→Leu 1 Sai nghĩa
23 GAT→GGA Asp→Gly 2 Sai nghĩa
24 TCA→GTG Ser→Val 1 Sai nghĩa
31 ATC→ACT Ile→Thr 2 Sai nghĩa
32 AAC→TTG Asn→Leu 1 Sai nghĩa
41 GGG→CGC Gly→Arg 2 Sai nghĩa
44 AAC→CCC Asn→Pro 2 Sai nghĩa
45 CTA→GCG Leu→Ala 1 Sai nghĩa
48 ACA→TGT Thr→Cys 1 Sai nghĩa
50 CCA→TGG Pro→Trp 1 Sai nghĩa
51 CCT→TGA Pro →End Dịch khung
52 TGG→TCA Trp→Ser 1 Sai nghĩa
53 GAT→TCA Asp→Ser 3 Sai nghĩa
54 CTA→CCA Leu→Pro 3 Sai nghĩa
55 AAA→ACC Lys→Thr 2 Sai nghĩa
56 CTT→TCA Leu→Ser 1 Sai nghĩa
57 GTT→CAA Val→Pro 2 Sai nghĩa
59 TGG→TTG Trp→Leu 1 Sai nghĩa
69 CGT→TAG Arg→End Dịch khung
71 GTT→TAA Val→End Dịch khung
74 A-T→TCA → Ser Thêm đoạn Vô nghĩa
105 CA - →CG - → 1 Vô nghĩa
106 - TG→-TG - → 2 Vô nghĩa
121 GCT→TAG Ala→End Dịch khung
142 GGT→TGA Gly →End Dịch khung
160 AAA→TGA Gly →End Dịch khung
161 GTA→TGA Val →End Dịch khung
164 CTT→TGA Leu →End Dịch khung
165 GAA→TGA Glu→End Dịch khung
166 TCA→TGA Ser→End Dịch khung
Khi so sánh các vị trí nucleotide chủng V. cholerae hoang dại N16961
với các vị trí nucleotide chủng V. choleraeT1phân lập được, nhận thấy chủng
V. cholerae T1 có hiện tượng đột biến là thêm hoặc mất từ 1- 3 nucleotide ở nhiều codon, dẫn đến hiện tượng thay đổi vị trí các acid amin và thay đổi cấu trúc protein (Bảng 4.17 và Phụ lục 11). Chủng V. cholerae T1 có codon kết thúc ở 10 vị trí, tương ứng với 10 vị trí acid amin, đây là một đột biến dịch khung do thêm vào hoặc bớt đi một đến hai nucleotide, dẫn tới 1 stop codon (end) điều đó sẽ làm ngừng tổng hợp chuỗi polypeptid và các enzyme này sẽ bị ngừng hoạt tính (Nguyễn Hoàng Lộc et al,. 2007). Năm 2012, Naha et al đã có báo cáo về đột biến dịch khung trong chuỗi trình tự chủng V. cholerae
95
hoang dại N16961 và O395. Chủng V. cholerae N16961, O395 đều có codon
dừng lại sớm tại vị trí 68, 79 và axid amin tương ứng 119. Trong nghiên cứu của Naha, (2012) cũng cho thấy trình tự acid amin thuộc protein roi sinh độc tố (TCP) của V.cholerae O1 type sinh học El Tor có liên quan đến sự bùng
phát dịch tả ở Nepal (2012) khác với chủng tham khảo El Tor N16961 do một đột biến ở vị trí amino acid 64 (asparagin → Serine), sự thay đổi này có liên quan đến sự chuyển đổi di truyền gene TCP và là nguyên nhân của bệnh dịch tả lưu hành ở Nepal (Grim et al., 2010), sau đó là những báo cáo từ Haiti, cho thấy rằng kiểu gene này đang lan rộng trên toàn cầu (Reimer et al., 2011).
Bảng 4.18: So sánh vị trí các acid amin của chủng V. cholerae hoang
dại N16961 với chủng V. cholerae T3
Codon Thay đổi
Nucleotide
Thay đổi acid amin Số nucleotide T3 mất Kiểu đột biến
6 TAA→TGA End →End Thêm đoạn Dịch khung
14 AGT→CTG Ser→Leu 1 Sai nghĩa
17 TGA→ATC End→Ile 1 Vô nghĩa
19 ACA→CCC Thr→Pro 1 Sai nghĩa
23 GAT→CTC Asp→Leu 3 Sai nghĩa
24 TCA→TAC Ser→Tyr 3 Sai nghĩa
32 AAC→ATC Asn→Met 1 Sai nghĩa
48 ACA→CGC Thr→Ala 1 Sai nghĩa
52 TGG→CTA Trp→Leu 1 Sai nghĩa
53 GAT→GCG Asp→Gly 3 Sai nghĩa
54 CTA→GCG Leu→Gly 3 Sai nghĩa
55 AAA→TAT Lys→Tyr 2 Sai nghĩa
63 GGA→GAA Gly→Glu 1 Sai nghĩa
71 GTT→GAG Val→Glu 2 Sai nghĩa
74 A-T→G- - → 2 Vô nghĩa
95 AAA →TGA Lys →End Dịch khung
100 ATT→TGA Ile→End Dịch khung
106 GAA → TAA Glu→End Dịch khung
124 GCA→TAA Ala→End Dịch khung
161 GTA→TAA Val→End Dịch khung
Tương tự với T1, khi so sánh các vị trí nucleotide chủng V. cholerae
hoang dại N16961 với các vị trí nucleotide chủng V. cholerae T3 phân lập được, nhận thấy chủng V. cholerae T3 cũng có hiện tượng đột biến là thêm hoặc mất từ 1- 3 nucleotide ở mỗi codon, dẫn đến hiện tượng thay đổi vị trí các acid amin và thay đổi cấu trúc protein (Bảng 4.18 và Phụ lục 12). Chủng
V. cholerae T3 có codon kết thúc ở 6 vị trí, tương ứng với 6 vị trí acid amin, đây là một đột biến dịch khung do thêm vào hoặc bớt đi một đến hai nucleotide, dẫn tới 1 stop codon (end) điều đó sẽ làm ngừng tổng hợp chuỗi
96
polypeptid và các enzyme này sẽ bị ngừng hoạt tính (Nguyễn Hoàng Lộc, 2007)
Ở Thái Lan từ năm 2003 và năm 2004, các chủng phân lập có trình tự acid amin tương đồng 100% với trình tự acid amin của chủng tham khảo N16961. Tuy nhiên, trong năm 2007 và sau đó các chủng phân lập ở Thái Lan đã có một đột biến ở vị trí 64 của acid amin (Faruque et al., 2007), sự thay đổi tương tự ở vị trí 64 cũng được tìm thấy đối với chủng V. cholerae O1(ZJ65)
phân lập ở Trung Quốc năm 2006 (GenBank, EU622532) và đối với chủng V.
cholerae 2010 EL-1786 (GenBank CP003069) đã gây ra dịch bệnh gây tử
vong ở Haiti (Reimer et al., 2011).
Điều đó cho thấy, những đột biến với nhiều hình thức đều là nguyên nhân cho những thay đổi về độc lực gây bệnh cũng như sự kháng kháng sinh của vi khuẩn V. cholerae. Trong nghiên cứu này, 2 chủng V. cholerae T1, T3 mang gene kháng kháng sinh đều có các trình tự acid amin tương đồng với chủng tham khảo N16961, 2 chủng trên có những vị trí đột biến như sai nghĩa, đột biến dịch khung hoặc đột biến vô nghĩa, và như vậy sự biến đổi gene về đề kháng kháng sinh sẽ tiếp tục được truyền gene ngang giữa các loài với nhau và nguy cơ về bùng phát dịch có thể sẽ xảy ra.
4.4.6 Quan hệ di truyền của các chủng V. cholerae dựa vào gene kháng kháng sinh tetA kháng kháng sinh tetA
Dựa vào kết quả giải trình tự các đoạn gene DKKS-T1-TraVinhVN- 2014 và DKKS-T3-TraVinhVN-2014 thuộc vi khuẩn V. cholerae, so sánh
với các trình tự tương đồng trên Genbank (BLAST), trong nghiên cứu này đã chọn ra những trình tự tương đồng cao với trình tự đoạn gene DKKS-T1- TraVinhVN-2014 với các số hiệu: AB213657.1, EU263362.1, EU263363.1, EU263361.1, EU263360.1 và các trình tự tương đồng cao với trình tự đoạn gene DKKS-T3-TraVinhVN-2014 với các số hiệu: CP001235.1,
AP014524.1, CP001233.1, CP003330.1, CP003069.1, CP001485.1,
DQ772843.1, CP002555.1.
Trong nghiên cứu này, 2 chủng V. cholerae phân lập tại Trà Vinh có
mang gene mã hoá gene kháng kháng sinh tetracycline phân lập trên mẫu nước và mẫu nghêu có tỉ lệ tương đồng về trình tự nucleotide với các chủng khác ở Thái Lan, Nhật Bản, Trung quốc, Indonesia, Brazil và Ấn Độ, tương đồng 97% với 10 chủng; tương đồng 96% với 01 chủng và tương đồng 94% với 04 chủng qua Bảng 4.19.
97
Bảng 4.19: Mức độ tương đồng đoạn gene kháng kháng sinh TetA của V. cholerae (T1 và T3) với các trình tự trên Genbank bằng công cụ BLAST.
Số hiệu gene Chủng Tổng số điểm Tỉ lệ che phủ Mức ý nghĩa Độ tương đồng
AB213657.1 Vibrio cholerae non-O1 vcmD 909 95% 0.0 97% CP001235.1 Vibrio cholerae O395 (I) 1534 84% 0.0 97% AP014524.1 Vibrio cholerae MS6 DNA, (I) 1534 84% 0.0 97% CP001233.1 Vibrio cholerae M66-2 (I) 1534 84% 0.0 97% CP003330.1 Vibrio cholerae IEC224 (I) 1534 84% 0.0 97% CP003069.1 Vibrio cholerae O1 str. 2010EL-1786 1534 84% 0.0 97% CP001485.1 Vibrio cholerae MJ-1236 (I) 1534 84% 0.0 97% DQ772843.1 Vibrio cholerae clone FLH214558-
USA-2006
1134 83% 0.0 97% CP002555.1 Vibrio cholerae LMA3894-4
chromosome I
1516 85% 0.0 96% EU263362.1 Vibrio cholerae strain N16961 MATE-
AshVCD43
832 95% 0.0 94% EU263363.1 Vibrio cholerae strain N16961 MATE-
AshVCD44
826 95% 0.0 94% EU263361.1 Vibrio fluvialis MATE-AshVFD69 837 95% 0.0 94% EU263360.1 Vibrio fluvialis MATE -AshVFD53 837 95% 0.0 94%
98
Từ cây phát sinh loài đã thể hiện rõ về cơ chế tiến hóa liên quan đến các chủng kháng kháng sinh phân lập ngoài môi trường và từ thức ăn hải sản.
Kết quả cây phát sinh loài cũng chỉ ra rằng 2 chủng V. cholerae T1 và T3 phân lập từ nước sông tại Trà Vinh mang gene kháng kháng sinh có mối liên hệ gần về trình tự nucleotide (97%) với nhiều chủng V. cholerae khác như
V. cholerae M66 phân lập tại Indonesia năm 2008; chủng V. cholerae IEC224
phân lập tại Brazil năm 2012; V. cholerae 2010EL-1786 phân lập tại Haiti
năm 2010; V. cholerae O395 phân lập tại Trung Quốc năm 2008; V. cholerae MJ-1236 phân lập tại Bangladesh năm 2009; V. cholerae MS6 phân lập tại
Thái Lan năm 2014; V. cholerae non-O1 vcmD phân lập tại Nhật Bản năm
2005. Ngoài ra, các chủng có mối liên hệ gần về trình tự nucleotide (96%) như chủng LMA3894 phân lập tại Brazil năm 2011; 2 chủng V. cholerae N16961
phân lập tại Ấn Độ năm 2007, V. cholerae clone FLH214558 phân lập tại Mỹ năm 2006, và có mối liên hệ xa nhất với loài V. fluvialis phân lập tại Ấn Độ
năm 2007.
Hình 4.11: Quan hệ di truyền của các chủng V. cholerae dựa vào gene kháng kháng sinh tetA. Lịch sử tiến hóa được suy ra bằng cách sử dụng phương pháp UPGMA (Sneath P.H.A, 1973). Cây tiến Lịch sử tiến hóa được suy ra bằng cách sử dụng phương pháp UPGMA (Sneath P.H.A, 1973). Cây tiến hoá với tổng chiều dài các nhánh = 130.99560252 được hiển thị. Cây được vẽ theo tỉ lệ, với độ dài nhánh tại các vị trí tương tự như những khoảng cách tiến hóa sử dụng để suy ra cây phát sinh loài. Khoảng cách tiến hóa đã được tính toán bằng cách sử dụng phương pháp tổng hợp (Tamura K., 2004) và trong các đơn vị của số lượng base thay thế cho mỗi vị trí. Các phân tích liên quan đến 15 trình tự nucleotide. Vị trí codon bao gồm là 1 + 2 + 3 + không mã hoá. Tất cả các mục có chứa khoảng trống và dữ liệu bị mất đã được loạibỏ. Có tổng cộng 846 vị trí trong số liệu cuối cùng. Phân tích tiến hóa được thực hiện tại MEGA5 (Tamura K., Peterson D, 2011).
99
Một nghiên cứu khác cho thấy nhiễm sắc thể 1 và 2 của chủng MS6 đã thường xuyên được sửa đổi bởi sự truyền gene từ các loài thuộc Vibrios sau
khi phân kỳ từ một tổ tiên chung, do đó những chủng có mối liên hệ gần sẽ có những đặc điểm tương tự về gene kháng kháng sinh (Kazuhisa et al., 2014).
Trong khi đó chủng V. cholerae N16961 có nhiều nghiên cứu đã chứng minh chủng này có sự di truyền gene đa kháng thuốc mã hóa cho gene EmrD- 3 với cơ chế như máy bơm thuốc ra ngoài (Smith, 2009, Floyd, 2013). Các chủng phân lập ở Thái Lan từ năm 2003 đến năm 2004 cũng cho thấy 100% acid amin tương đồng với các acid amin chủng N16961. Tuy nhiên, gene TCPA của V. cholerae O1 chủng El Tor trong năm 2007 và sau đó đã có một
đột biến ở vị trí amino acid 64 và điều này cũng được tìm thấy ở chủng V. cholerae 2010EL1786 (GenBank: CP003069) chủng này đã từng gây ra dịch
bệnh ở Haiti (Reimer et al., 2011).
Ở Việt Nam, năm 2000 những chủng V. cholerae O1 kháng tetracycline là do gene tetA, tuy nhiên, gene kháng trimethoprim cũng không được tìm thấy trong thời điểm này. Các chủng vào năm 2002 thì lại được nhạy cảm với tất cả các loại thuốc kiểm tra. Từ năm 2010 – 2011, những chủng V. cholerae phân
lập tại Việt Nam mang gene kháng kháng sinh tương tự như chủng phân lập Ấn Độ và Thái Lan., đã tạo ra một biến thể mới của V. cholerae O1 (Jain et
al., 2011; Okada et al, 2010).
Những chủng V. cholerae lần đầu tiên được phân lập từ các nguồn khác nhau giữa năm 2007 và 2009 tại Hà Nội Việt Nam xác định có mang gene
TetA (lớp D) mã hóa kháng với tetracycline (mã số: AB450045.1). Điều này
cho thấy về mặt dịch tễ học có sự tồn tại của các chủng mang gene kháng TetA (lớp D), ở ngoài môi trường tại miền Bắc Việt Nam. Nhiều dữ liệu cho thấy những chủng gây dịch bệnh tại Lào, Việt Nam và Thái Lan từ năm 2007 và 2009 phân lập từ mẫu phân bệnh nhân, mẫu phân vật nuôi như chó nhập từ Thái Lan và mẫu nước từ môi trường đều giống nhau về mặt di truyền (Tuan