Qua Hình trên, hầu hết cơ chế đề kháng được mã hóa bởi plasmid, có khả năng lây sang vi khuẩn khác. Chiều kim đồng hồ. 00:00: hệ thống bơm ra ngoài nhờ ái lực cao nằm ở màng giúp vận chuyển kháng sinh ra khỏi tế bào. Đây là cơ chế kháng với tetracycline. 04:00: Một enzyme làm thay đổi tính chất và làm mất tác dụng của kháng sinh. Trong trường hợp của streptomycin, kháng sinh bị biến đổi về tính chất hóa học để nó sẽ không còn kết hợp với ribosome và ngăn chặn sự tổng hợp protein. 09:00: là một loại enzyme được sản xuất nhằm làm bất hoạt kháng sinh. Ví dụ, penicillinases là một nhóm các enzym beta-lactamase tách vòng beta lactam của phân tử penicillin.
2.7 Tính miễn dịch đối với vaccine phòng bệnh tả trên người 2.7.1 Nguyên lý sử dụng vaccine 2.7.1 Nguyên lý sử dụng vaccine
Sử dụng vaccine là đưa vào cơ thể kháng nguyên có nguồn gốc từ vi sinh vật gây bệnh hoặc vi sinh vật có cấu trúc kháng nguyên giống vi sinh vật gây bệnh, đã được bào chế đảm bảo độ an toàn cần thiết, làm cho cơ thể tự tạo ra tình trạng miễn dịch chống lại tác nhân gây bệnh, là loại miễn dịch chủ động nhân tạo.
Tình trạng miễn dịch mà cơ thể có được sau khi sử dụng vaccine là kết quả của sự đáp ứng miễn dịch đối với các thành phần kháng nguyên có trong vaccine. Cơ thể luôn luôn đáp ứng bằng cả miễn dịch dịch thể (miễn dịch qua trung gian kháng thể) và miễn dịch tế bào (miễn dịch qua trung gian tế bào),
46
nhưng tuỳ từng loại vaccine, hiệu lực bảo vệ có thể do miễn dịch dịch thể, miễn dịch tế bào hoặc phối hợp cả hai loại. Ngoài miễn dịch đặc hiệu, vaccine còn có khả năng tăng cường cả miễn dịch không đặc hiệu như làm tăng quá trình thực bào nhờ kháng thể đóng vai trò là yếu tố opsonin đặc hiệu, nhờ lymphokin hoạt hoá đại thực bào (vi.wikipedia.org/wiki/Vắc-xin).
2.7.2 Cơ chế hoạt động của vaccine
Hệ miễn dịch nhận diện vaccine là vật lạ nên hủy diệt chúng và "ghi nhớ" chúng. Về sau, khi tác nhân gây bệnh thực thụ xâm nhập cơ thể, hệ miễn dịch sẵn sàng tấn công tác nhân gây bệnh nhanh chóng hơn và hữu hiệu hơn (bằng cách huy động nhiều thành phần của hệ miễn dịch, đặc biệt là đánh thức các tế bào lympho nhớ). Đây là các ưu điểm của đáp ứng miễn dịch đặc hiệu
Vaccine phòng bệnh tả được dùng để thúc đẩ quá trình miễn dịch chủ động đối với bệnh tả ở người có nguy cơ cao tiếp khi xúc với bệnh này. Vi khuẩn tả V. cholerae bất hoạt có trong vaccine thúc đẩy sản sinh kháng thể
diệt khuẩn.
Vaccine dạng tiêm không có tác dụng miễn dịch chống lại nhiễm bệnh do các chủng V. cholerae khác, kể cả chủng V. cholerae nhóm O139. Nhưng
đối với vaccine dạng uống do Viện Vệ sinh dịch tễ Việt Nam sản xuất không những tạo miễn dịch đối với bệnh do vi khuẩn V. cholerae nhóm O1 type sinh học cổ điển hoặc type sinh học El tor mà còn đối với bệnh do vi khuẩn V. cholerae nhóm O139.
Vaccine phòng bệnh tả được dùng để thúc đẩy quá trình miễn dịch chủ động đối với những người sinh sống và làm việc trong vùng có bệnh tả lưu hành và điều kiện vệ sinh kém, đối với nhân viên y tế xét nghiệm viên thường xuyên tiếp xúc với người bệnh.
Vaccine tả còn được dùng để thúc đẩy quá trình miễn dịch chủ động đối với bệnh tả cho những người đi du lịch tới những vùng có bệnh tả đang lưu hành. (vi.wikipedia.org/wiki/Vắc-xin)
47
Chương 3: NỘI DUNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Nội dung nghiên cứu
- Phân lập, định danh, tỉ lệ nhiễm vi khuẩn Vibrio spp. trên các loại mẫu tại tỉnh Trà Vinh;
- Định type huyết thanh học vi khuẩn V. cholerae phân lập được. - Giải trình tự nucleotide gene 16S rDNA.
- Xác định gene kháng kháng sinh vi khuẩn V. cholerae được tuyển chọn. - Thử nghiệm chủng V. cholerae phân lập được trên thỏ nhằm đánh sự
đột biến của V. cholerae và khả năng đáp ứng miễn dịch đối với vaccine hiện hành.
* Thời gian nghiên cứu: từ tháng 10/2012 – 4/2014 * Địa điểm nghiên cứu:
Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng Đại học Cần Thơ; Bệnh viện đa khoa Trung ương Cần Thơ; Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học Đại học Cần Thơ; Khoa Nông nghiệp – Thuỷ sản trường Đại học Trà Vinh; mẫu gửi giải trình tự tại công ty Macgrogen Hàn Quốc.
3.2 Phương tiện và phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Phương tiện nghiên cứu 3.2.1 Phương tiện nghiên cứu
3.2.1.1 Hoá chất, môi trường nuôi cấy vi khuẩn
Các môi trường và hóa chất dùng phân lập vi khuẩn gồm có: Nước cất, nước muối sinh lý (NaCl 0,9%), thuốc thử Kowacs, cồn 96o, cồn 70o, muối tinh khiết, alkaline saline peptone water (ASPW) với các nồng độ từ 0-10%. Môi trường chuyên chở mẫu bệnh phẩm: Cary- Blair (India); môi trường nuôi cấy: TCBS: Thạch Thiosunfat-Citrat-Bile-muối-Sacaroza (Merck); SNA: Saline Nutrient Agar (Merck); môi trường làm kháng sinh đồ: MHA (Muller Hinton Agar), đĩa giấy tẩm kháng sinh (Nam Khoa, Tp. HCM).
Môi trường thử sinh hóa vi khuẩn phân lập: đĩa giấy oxidase, đĩa giấy ONPG, TSI agar (Saline triple sugar iron agar), ADH (Arginine Dihydrolase), Tryptophan saline (Bộ định danh vi khuẩn Gram âm: IDS 14GNR, Nam Khoa, Tp.HCM).
Các kháng sinh sử dụng gồm: 8 loại đĩa kháng sinh thường dùng trong điều trị bệnh tả do vibrio: streptomycin (10μg), norfloxacin (10μg), ampicillin
48
(10μg), tetracycline (30μg), azithromycin (30μg), amoxicillin-clavulanic axit (30μg), trimethoprim-sulfamethoxazole (25μg) và vancomycin (30μg) (Công ty Nam Khoa).
Bộ thuốc nhuộm Gram: dung dịch crystal violet; lugol; cồn - aceton; safranin(Germany)
Kháng huyết thanh định type V. cholerae: Kháng huyết thanh tả đa giá kháng lại 3 chủng: Inaba, Ogawa và O139; kháng huyết thanh tả đơn giá Inaba; kháng huyết thanh tả đơn giá Ogawa, kháng huyết thanh tả đơn giá O139 (Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh).
3.2.1.2 Hoá chất, sinh phẩm dùng cho phản ứng PCR a) Xác định vi khuẩn dựa trên đoạn gene 16S rDNA
Hoá chất ly trích DNA: Tris-HCl, EDTA, H20; hoá chất PCR: Buffer, MgCl2 ,dNTPS , DMSO, Taq polymerase.
b) Xác định gene kháng kháng sinh
Hoá chất ly trích DNA: Tris-HCl, EDTA, H20; hoá chất PCR: Buffer, MgCl2, dNTPS , DMSO, Taq polymerase và các cặp mồi xác định gene kháng kháng sinh.
3.2.1.3 Vật liệu nghiên cứu Mẫu
160 mẫu nghêu thu từ huyện Duyên Hải, huyện Cầu Ngang; 100 mẫu huyết heo thu từ các cơ sở giết mổ heo tại Thành phố Trà Vinh, huyện Châu Thành, huyện Duyên Hải, huyện Cầu Ngang và huyện Càng Long; 40 mẫu phân lấy từ bệnh nhân tiêu chảy tại bệnh viện Đa khoa tỉnh Trà Vinh; 150 mẫu nước thu từ sông, nước biển và các địa điểm nuôi tôm; 50 mẫu tôm thu từ huyện Duyên Hải. Tất cả các mẫu được bảo quản trong thùng trữ lạnh và chuyển về phòng thí nghiệm để nuôi cấy, phân lập.
Vi khuẩn dùng thử nghiệm trên thỏ
- Vi khuẩn: Những chủng vi khuẩn thuộc V. cholerae đã phân lập được dùng thử nghiệm trên thỏ sau khi hoạt hoá trong 2 giờ và tăng sinh trong môi trường APW ở 350C từ 18-24 giờ để có nồng độ vi khuẩn trong 1 ml tương đương 1x105 đến 5 x 107 CFU (Richardson, 1991).
- Vaccine tả uống (mORCVAX) điều chế từ các chủng vi khuẩn tả toàn tế bào chết, gồm type sinh học Cổ điển và type sinh học El Tor và chủng vi khuẩn tả O139, có chứa những phần bằng nhau của các chủng Ogawa và Inaba
49
của vi khuẩn tả V. cholerae nhóm O1 được tách chiết từ môi trường nuôi cấy có dung dịch đệm là natriclorid và làm bất hoạt vi khuẩn bằng phenol. Vaccine phòng bệnh tả chứa 8 đơn vị của mỗi chủng vi khuẩn V . cholerae (4 tỷ tế bào) trong 1 ml (Công ty TNHH MTV Vaccine và Sinh phẩm số 1, Hà Nội) (Phụ lục 15).
- Động vật thí nghiệm: 24 thỏ trắng giống New Zealand, trọng lượng 2- 2,5kg/con.