25
2.3.3.3 Nhiễm V. cholerae theo độ tuổi và giới tính
Tình hình nhiễm V. cholerae tại các bang của Mỹ do Trung tâm kiểm soát dịch bệnh đã báo cáo trong năm 2005 về độ tuổi và giới tính được trình bày trong Bảng 2.4:
Bảng 2.4: Tổng hợp về độ tuổi và giới tính của những người mắc bệnh do V. cholerae ở một số bang của Mỹ.
Bang Tuổi Giới tính Thời gian Nhóm huyết thanh Type huyết thanh
Hawaii 85 Nữ 4/2005 V. cholerae O1 Ogawa Hawaii 34 Nam 5/2005 V. cholerae O1 Ogawa Missouri 44 Nữ 8/2005 V. cholerae O1 Inaba New York 44 Nữ 7/2005 V. cholerae O1 Inaba Louisiana 43 Nam 10/2005 V. cholerae O1 Inaba Louisiana 46 Nữ 10/2005 V. cholerae O1 Inaba Guam 32 Nam 10/2005 V. cholerae O1 Ogawa Guam 29 Nam 10/2005 V. cholerae O1 Ogawa Michigan 53 Nam 11/2005 V. cholerae O1 Inaba Michigan 34 Nam 11/2005 V. cholerae O1 Ogawa California 46 Nam 12/2005 V. cholerae O1 Ogawa Guam 26 Nữ 12/2005 V. cholerae O1 Ogawa
Tổng 12
(CDC, 2005)
Người mắc bệnh thường là nam giới (7/12) và có độ tuổi trung bình từ 40-43 tuổi, đa số những người này đều sử dụng thức ăn có nguồn gốc hải sản, do V. cholerae thuộc nhóm huyết thanh O1 và type huyết thanh phổ biến là
Ogawa.
2.4 Đặc điểm di truyền của V. cholerae
Toàn bộ bộ gene của chủng V. cholerae type sinh học El Tor N16961
có độc lực đã được giải trình tự (Heidelberg et al., 2000) và có hai vòng nhiễm sắc thể 1 và nhiễm sắc thể 2 (Trucksis et al., 1998).
Nhiễm sắc thể 1 có 2.961.149 cặp base với 2.770 khung đọc mở (ORF) và nhiễm sắc thể 2 có 1.072.315 cặp base, với 1.115 khung đọc mở. Nhiễm
26
sắc thể thứ 1 chứa các gene quan trọng mã hóa cho các yếu tố độc lực và có chức năng của tế bào như sao chép và phiên mã (Heidelberg et al., 2000).
Nhiễm sắc thể thứ 2 được xác định là do một plasmid hoặc megaplasmid bao gồm gene housekeeping và các gene khác trong hệ gene, bao gồm các gene cần thiết cho sự trao đổi chất và gene 16S rRNA, đó là gene tiểu đơn vị ribosome sử dụng để theo dõi các mối liên hệ tiến hóa giữa các vi khuẩn. Nhiễm sắc thể 2 chiếm 40% kích thước của toàn bộ hệ gene. Không giống như plasmid, các nhiễm sắc thể không tự lan truyền trong cùng giống loài (Trucksis et al., 1988). Tuy nhiên, nhiễm sắc thể thứ hai có thể đã từng là một megaplasmid bởi vì nó có chứa một số gene thường được tìm thấy trên plasmid.
V. cholerae có một đảo quy định vùng sinh bệnh (VPI) trong bộ gene,
đó là gene của một loại virus đã tích hợp vào hệ gene của vi khuẩn làm vi khuẩn có tính gây bệnh cao (Schaechter et al., 2006).
Hình 2.7: Nhiễm sắc thể 1 (B) và nhiễm sắc 2 (A) của V. cholerae (Heidelberg et al., 2000)
2.4.1 Độc lực của V. cholerae
Tính gây bệnh của vi khuẩn V. cholerae gây bệnh tả là một quá trình
phức tạp và liên quan đến một số yếu tố độc lực.
- Yếu tố độc lực thứ nhất: Vi khuẩn V. cholerae khi bám vào bề mặt
của ruột non sẽ sinh sôi nẩy nở và tiết ra độc tố ở ruột non CTX (Kaper et al., 1995). Chất độc này làm lớp tế bào ruột non bài tiết ra chất lỏng và chất điện giải, do đó có hiện tượng tiêu chảy xảy ra.
(A)
27
Độc tố của V. cholerae có 2 đơn vị phụ: đơn vị phụ A có 2 nhánh; đơn vị phụ B gồm 5 nhánh. Đơn vị phụ B bám vào một nơi tiếp nhận đặc biệt, ganglioside (GM1) ở trên bề mặt của tế bào lót của màng nhầy ruột non của con người và vài loài có vú. Hiệu quả của độc tố vi khuẩn tả trên nồng độ của prostaglandin trong ruột cũng có thể tạo ra sự tiêu chảy. Nhân di truyền mã hóa độc tố được gọi là ctxAB được xắp xếp trên một mảng nhân di truyền (operon) và được mã hóa bởi một bacteriophage được gọi là CTXφ (Faruque, 1998).
- Yếu tố độc lực thứ 2 của vi khuẩn V. cholerae: giúp chúng sinh sôi
nẩy nở trong ruột là độc tố được tiết ra từ tiêm mao (pili) hay TCP. TCP có chứa yếu tố di truyền, gồm TCPA là yếu tố di truyền có liên quan đến cấu tạo tiêm mao. TCP không những liên quan tới khả năng giúp cho V. cholerae sinh
sôi nảy nở trong ruột, nó cũng là nơi tiếp nhận CTXφ (Faruque, 1998).
2.4.2 Đặc tính di truyền về độc lực của V. cholerae
Sự xuất hiện của TCP và độc tố vi khuẩn tả được điều khiển bởi các yếu tố di truyền bao gồm toxR, tcpH, tcpP, và toxT. Tất cả những yếu tố di truyền này hợp lại thành đặc tính có độc lực của V. cholerae, đặc tính này có
liên quan đến tính di động, khả năng định vị trong ruột, và sự sản xuất độc tố. Khi V. cholerae được tìm thấy trong phân của bệnh nhân, điều đó cho thấy có sự sao chép di truyền của V. cholerae rất độc và rất dễ lây lan (Feldman,
Schiller, 1997).
Vi khuẩn V. cholerae type sinh học Eltor có những yếu tố di truyền
CTXA và CTXB (cholera toxin A&B) để tạo ra độc tố bao gồm đơn vị phụ A và B. Ngoài ra chúng còn có yếu tố di truyền để tạo ra nhánh phụ TCPA (toxin corregulate pilus A). Mới gần đây người ta nhận thấy rằng ánh sáng mặt trời và những yếu tố trong môi trường thiên nhiên có thể ảnh hưởng lên nhân di truyền của vi khuẩn tạo ra độc tố. Vi khuẩn tả có khả năng thích ứng tùy theo chất bài tiết trong ruột con người và ngoài thiên nhiên nên nó có khả năng lây nhiễm và gây bệnh rất cao. Yếu tố di truyền của V. cholerae thuộc nhóm O1
type sinh học Eltor gây ra trận đại dịch thứ 7, đó là VSP-I & VSP-II giúp cho
V. cholerae thuộc nhóm này có khả năng tồn tại trong thiên nhiên tốt hơn và
gây bệnh nặng hơn. (Feldman, Schiller, 1997).
Quá trình tiến hóa của V. cholerae gây bệnh lý có 2 giai đoạn quan
trọng: trước hết, các chủng V. cholerae tiếp nhận phage TCP và biến thành V. cholerae TCP +. Sau khi trở thành TCP+, tức là vi khuẩn có tua, tua sẽ
28
DNA của nó vào nhiễm sắc thể của V. cholerae theo cơ chế phage tiềm tan
(lysogenic).
Bản chất của các gene CTX và TCP đều là bacteriophage từ bên ngoài được gắn vào trong nhiễm sắc thể của V. cholerae. Có người cho rằng V. cholerae vốn là vi khuẩn “hiền” nhưng khi bị các bacteriophage gây nhiễm
chúng mới trở thành chủng sinh độc tố và gây bệnh lý. V. cholerae trở thành
chủng sinh độc tố (toxicogenic V. cholerae) và gây bệnh khi chúng có tiêm mao giúp vi khuẩn bám vào niêm mạc ruột non.
Hình 2.8: Sự hình thành chủng V. cholerae có độc tố (Blake, 1994)Giữa các bacteriophage CTX và TCP có một sự cộng tác như sau: Giữa các bacteriophage CTX và TCP có một sự cộng tác như sau: phage CTX Φ chui vào tế bào V. cholerae thông qua các tua (tiêm mao) vốn do 1 phage khác là TCP Φ mã hóa. Khi DNA của CTX Φ gắn vào nhiễm sắc thể thành 1 gene, gene này chịu sự kiểm soát của 1 gene khác là ToxR, vốn là gene cũng mã hóa gene TCP, để sản xuất ra độc tố tả (Cholerae toxin).
29
Cơ chế sinh độc tố này nằm trong bí mật về trình tự di truyền của V. cholerae mới được giải mã vào năm 2000 khi người ta phát hiện vi khuẩn này
có 2 nhiễm sắc thể, 1 lớn (chr 1) và 1 bé (chr 2). Đây là điều thú vị bởi vì các vi khuẩn khác đều chỉ có 1 nhiễm sắc thể. Hai nhiễm sắc thể của V. cholerae đóng vai trò chuyển hóa và sao chép, tạo ra lợi thế tiến hóa cho vi
khuẩn trong môi trường khi khí hậu thay đổi. Nhiễm sắc thể lớn (chr 1) chứa hầu hết những gene cần thiết cho sự tăng trưởng và sinh bệnh giúp cho vi khuẩn thích ứng và phát triển với môi trường ở ruột, nhiễm sắc thể 2 phụ trách chu trình biến dưỡng và điều hòa cần thiết để vi khuẩn sống ngoài môi trường (Boyd và Waldor,. 2008).
Trên nhiễm sắc thể 1 có 2 cụm gene đặc biệt đó là CTXΦ và VPI. Nhiều nghiên cứu cũng chứng minh rằng VPI vốn là 1 bacteriophage gọi là VPIΦ mã hóa cho thụ thể TCP để cho 1 bacteriophage khác (CTXΦ ) gắn kết vào Chr1 và sản xuất ra CT. Như vậy, một chủng V. cholerae không sinh độc tố sẽ trở thành chủng sinh độc tố khi chủng này thu nhận được phage CTXΦ. Độc tố tả chỉ được sản xuất khi có sự chuyển gene của phage CTXΦ gắn vào 1 tiêm mao nhất định trên chủng V. choleare, nên giải thích được phần nào vì
sao có sự giới hạn loài về ký chủ đối với V. cholerae O1sinh độc tố (Boyd và Waldor,. 2008).
Hình 2.10: Trình tự di truyền V. cholerae (Blake, 1994)
2.4.3 Các yếu tố về độc lực
V. cholerae sử dụng hai yếu tố độc lực, độc lực từ tiên mao/roi (TCP)
và độc tố tả CTX. TCP, mã hóa cho các yếu tố gây bệnh, là một loại protein từ tiêm mao (Kirn et al, 2000), TCP cũng rất cần thiết cho sự hình thành khuẩn lạc của V. cholerae định vị trong ruột non của chuột sơ sinh (Taylor et al.,
30
trong ruột non thành công, V. cholerae sẽ tiết ra độc tố gây bệnh tả. Các độc tố kích thích các tế bào biểu mô ruột non tiết ra dịch lỏng trong lòng ruột non, từ đó có hiện tượng tiêu chảy mất nước. Do đó, sự đột biến ở roi của một số chủng V. cholerae sẽ ảnh hưởng đến yếu tố độc lực TCP, Hình sau biểu hiện
sự biến đổi về roi.
a. Chủng vi khuẩn hoang dại; b. Vi khuẩn đột biến gene; c. Vi khuẩn đột biến gene
Hình 2.11: Vi khuẩn đột biến roi (Ewen, 2008)
Nếu vi khuẩn mang gene đột biến sẽ dẫn đến khiếm khuyết trong việc lắp ráp roi (flagellum). Qua Hình 2.11, loài hoang dại (Hình 2.11a) không mang gene đột biến nên chiều dài roi dễ dàng nhìn thấy qua hiển vi điện tử; Hình (2.11b) vi khuẩn mang gene flgT đột biến nên không hình thành roi; Hình
(2.11c) vi khuẩn có roi ngắn hơn cũng do hiện diện gene đột biến roi fliA. Nhiều nghiên cứu trước đó đã cho thấy sự bùng phát dịch tả ở miền Bắc Việt Nam trong năm 2007 và đầu năm 2008 là do chủng V. cholerae O1 type sinh học El Tor đã biến thể từ type sinh học Cổ điển mang gene có độc tố CTXB. Chủng thuộc type sinh học El Tor này được lây lan vào miền Bắc Việt Nam trong năm 2007 và thường xuyên thay thế các chủng mang gene CTX của type cổ điển trên nhiễm sắc thể nhỏ, tương tự như phiên bản của các chủng phân lập ở Mozambique, và có liên quan đến sự bùng phát dịch tả tại Việt Nam năm 2007. Dữ liệu cho thấy kiểu gene của các chủng V. cholerae gây
bùng phát dịch tả ở miền Bắc Việt Nam từ năm 2007 và năm 2010 gây ra bởi một dòng duy nhất là type sinh học El Tor đã biến thể và đang chiếm ưu thế thay cho các type sinh học cổ điển trước đây (Nguyễn et al., 2009).
Trong một nghiên cứu của Trần et al. (2012) cho thấy chủng V. cholerae type sinh học El Tor có liên quan đến những chủng gây dịch tả tái
phát tại Việt Nam năm 2007-2010, đây là một biến thể của type sinh học El Tor có mang gene độc lực CTX của type sinh học cổ điển và mang gene kháng
31
kháng sinh của type sinh học El Tor có liên quan đến dịch tả tại Khon Kaen (Thái Lan). Theo thời gian, vi khuẩn có một quá trình biến đổi di truyền từ type sinh học El Tor biến thể gây bệnh ở Mozambique đã lan sang các nước châu Á, vì V. cholerae luôn hiện diện ngoài môi trường tự nhiên, từ đó vi
khuẩn phát triển tại Khon Kaen và sau đó xuất hiện ở khắp nước Thái Lan (Okada et al., 2012).
Trong lịch sử, bệnh tả đã được lưu hành trong nhiều thế kỷ trong khu vực sông Hằng, đồng bằng thuộc Vịnh Bengal. Bệnh dịch tả xảy ra ở Châu Phi và Châu Mỹ La Tinh và sau đó lan sang các nước châu Á (Blake, 1994). Năm 1991 V. cholerae O1 type sinh học El Tor lần đầu tiên gây bệnh bệnh dịch tả ở Châu Mỹ Latinh (Blake, 1994), và các chủng khác nhau được phát hiện sau đó vào năm 2009 (Beltra'n et al., 1999, Popovic et al., 1993, Nusrin et al., 2009). Tại Thái Lan, phần lớn các chủng V. cholerae O1 type sinh học El Tor có liên quan đến việc tái phát dịch tả từ năm 2003 đến 2011, những mẫu phân lập chủ yếu có nguồn gốc từ nước ngoài môi trường, điều đó phản ánh sự đa dạng di truyền trong quần thể V. cholerae (Alam et al., 2007), sau đó xuất hiện ở các nước Châu Á, Châu Phi (Ansaruzzaman et al., 2004) và các nước Châu Mỹ (Alam et al., 2006). Những bằng chứng có liên quan đến các chủng thuộc type sinh học El Tor đã biến thể và gây dịch bệnh ở Thái Lan, Việt Nam và Bangladesh thể hiện qua cây phát sinh loài, mặc dù những chủng này phát triển độc lập trong các hệ sinh thái khác nhau.
2.5 Cơ chế gây bệnh của V. cholerae
V. cholerae được chia thành các nhóm huyết thanh dựa trên các kháng
nguyên thân trên bề mặt. Các nhóm huyết thanh O1 và O139 bao gồm các chủng gây bệnh. Nhóm huyết thanh O1 có thể được chia thành ba type huyết thanh theo soma kháng nguyên và sau đó là hai biotypes theo kiểu hình cụ thể. Ogawa (soma kháng nguyên A và C), Inaba (A và B), và Hikojima (A, B và C) chỉ định type huyết thanh và chia thành các type sinh học (biotype) El Tor và cổ điển.
Type sinh học El Tor chiếm ưu thế trong hầu hết các bệnh nhiễm trùng (Lencer, 2001), hiện tại nhóm huyết thanh O1 và O139 chứng minh gây bệnh do sản xuất enterotoxin thúc đẩy sự tiết nước và chất điện giải vào ruột, dẫn đến tiêu chảy. Độc tố bệnh tả có chứa hai tiểu đơn vị A và năm tiểu đơn vị B. Các tiểu đơn vị B cho phép liên kết với thụ thể ganglioside (GM1) trên các tế bào biểu mô ruột. Màng cholesterol là rất quan trọng để các tương tác xâm nhập vào nội bào (endocytosis) của tiểu đơn vị A. Trong một thí nghiệm loại bỏ cholesterol từ màng biểu mô, nhà nghiên cứu nhận thấy rằng sự hiện diện
32
của nó tạo điều kiện cho CT-GM1 hình thành phức hợp xâm nhập vào nội bào.
Một thí nghiệm đã chứng minh rằng các mãng lipid giúp đính độc tố vào màng nội bào của các tiểu đơn vị A, giúp chuyên chở độc tố vào tế bào và bám vào bề mặt niêm mạc ruột (Lencer, 2001).
Sau khi vào bên trong, các tiểu đơn vị A tách thành peptide A1 và A2. Peptide A1 ADP-ribosylates GTP-binding protein, do đó ngăn ngừa sự bất hoạt của nó. GTP-binding protein hoạt động bởi adenylate cyclase để hình thành cAMP. Sự gia tăng cAMP nội bào tạo sự hấp thu natri và clorua từ vi nhung mao và thúc đẩy sự tiết nước từ các tế bào crypt của ruột để bảo tồn sự cân bằng thẩm thấu (Torgersen et al., 2001).
Sự mất nước gây ra do tiêu chảy và nồng độ chất điện giải đẳng trương vào trong sinh chất. Mất nước xảy ra ở tá tràng, hồi tràng ít bị ảnh hưởng, ruột già là ít nhạy cảm với độc tố, và do đó vẫn có thể hấp thụ một số chất lỏng, tuy nhiên sẽ lấn át khả năng hấp thụ của kết tràng (Handa, 2003).
Hình 2.12: Cơ chế tạo độc tố ở ruột của V. cholerae (Basel, 2009) Theo Hình trên, phía bên trái V. cholerae di động có chứa protein ToxT Theo Hình trên, phía bên trái V. cholerae di động có chứa protein ToxT bị bất hoạt khi đi vào ruột non. Ở trung tâm, V. cholerae trong ruột tiếp xúc
với bicarbonate, ToxT trở nên hoạt động và bắt đầu sản xuất TCP. Ở bên phải, vi khuẩn xâm nhập vào lớp niêm mạc và tiếp xúc với bicarbonate, gene độc lực bắt đầu cảm ứng và bắt đầu sản xuất CT. Độ chênh lệch về nồng độ bicarbonate từ lòng ống với bề mặt niêm mạc được thể hiện bởi các tam giác bên phải, từ đó có hiện tượng tiêu chảy xảy ra.
33
2.6 Tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn
2.6.1 Khái niệm
Kháng sinh là tất cả những chất hóa học được chiết xuất từ môi trường nuôi cấy vi sinh vật, bán tổng hợp hay tổng hợp, chúng có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc tiêu diệt vi khuẩn bằng cách tác động chuyên biệt trên một giai đoạn chuyển hóa cần thiết của vi sinh vật. Với định nghĩa này, nhiều chất trước đây xếp vào nhóm chất kháng khuẩn tổng hợp như sulfonamide,