Dựa trên kết quả nuôi cấy, đặc điểm sinh hoá, kết quả định danh bằng máy định danh tự động và qua phân tích PCR, nghiên cứu thu được 25 chủng thuộc 5 loài Vibrio spp. trên các mẫu thức ăn từ nghêu, tôm, nước biển, nước ao nuôi tôm, nước sông, huyết heo được trình bày qua Bảng 4.4 và Bảng 4.5.
72
Bảng 4.4: Tỉ lệ nhiễm Vibrio spp. trên các loại mẫu
Loại mẫu
(n = 500)
Loài Vibrios Số mẫu
kiểm tra Dương tính Số mẫu Tỉ lệ (%) Nghêu (n = 160) V. cholerae 160 03 1,9 V. paraheamolyticus 160 03 1,9 V. vulniticus 160 04 2,5 V. fluvialis 160 05 3,1 V. alginolyticus 160 01 0,63
Huyết heo (n = 100) V. cholerae 100 02 2,0
V. paraheamolyticus 100 02 2,0
Nước (n = 150)
+ Nước sông V. cholerae 50 01 2,0
+ Nước biển V. alginolyticus 50 01 2,0
+ Nước ao nuôi tôm V. paraheamolyticus 50 02 4,0
Tôm (n = 50) V. paraheamolyticus 50 01 2,0
Phân bệnh nhân (n = 40) 40 0 0,0
Tổng cộng 25
Trên mẫu nghêu, có sự hiện diện rất đa dạng các loài thuộc Vibrio
spp., vì đây là loài sinh vật sống ở vùng nước mặn, rất phù hợp cho vi khuẩn Vibrio spp. ký sinh, trong đó loài V. cholerae là 1,9 %. Trong huyết heo do có sử dụng nguồn nước từ sông để sử dụng trong quá trình giết mổ như rửa thịt, pha vào huyết (lúc chọc tiết), tỉ lệ dương tính 2% với V. cholerae tương ứng với tỉ lệ V. cholerae được phân lập từ nguồn nước
sông (Bảng 4.4).
Kết quả này cũng tương đương với kết quả phân lập tại thành phố Hồ Chí Minh với tỉ lệ 1,1% trên mẫu nước và 2,2% trong mẫu thực phẩm; tại Bến Tre trong mẫu nước là 5,7% (Nguyễn Hoàng Vũ, 2013), do Bến Tre là tỉnh có bệnh dịch tả xảy ra vào năm 2010.
Có nhiều nghiên cứu cho thấy nguồn nước là yếu tố lây lan mầm bệnh, là điều kiện để vi khuẩn tồn tại và phát tán. Nhiều quốc gia trên thế giới cũng có những nghiên cứu liên quan đến nguồn nước gây ô nhiễm, nước đóng vai trò quan trọng và lưu trữ mầm bệnh, hơn 50% người bị
73
nhiễm vi khuẩn V. cholerae đều do sử dụng nguồn nước bị ô nhiễm (Joao and Cabral,. 2010).
Riêng đối với mẫu phân trên người, chưa phát hiện nhiễm vibrio, có thể do bệnh nhân chưa có đầy đủ các triệu chứng của bệnh tả tại thời điểm khảo sát. Theo kết quả nghiên cứu ứng dụng một số kỹ thuật chẩn đoán nhanh V. cholerae gây tiêu chảy cấp tại tỉnh Thái Nguyên năm 2009, trên 270 mẫu phân
bệnh nhân tiêu chảy cấp có triệu chứng lâm sàng nghi mắc bệnh tả cũng chỉ phân lập được 5,93% bệnh nhân dương tính với bệnh tả (Phạm Thế Vũ, 2008).
Như vậy, môi trường nước sông, nước biển, các loại thức ăn có nguồn gốc hải sản có sự hiện diện của các chủng thuộc Vibrio spp. là nguy cơ lây
truyền bệnh cho con người.
Bảng 4.5: Tỉ lệ nhiễm vi khuẩn Vibrio spp. theo chủng (n=25)
Tên loài vi khuẩn Số mẫu dương tính Mẫu Tỉ lệ
(%) V. cholerae 06 Nghêu: 03 24 Huyết heo: 02 Nước sông: 01 V. paraheamolyticus 08 Nghêu: 03 32 Huyết heo: 02
Nước ao nuôi tôm: 02 Tôm: 01 V. vulniticus 04 Nghêu: 04 16 V. fluvialis 05 Nghêu: 05 20 V. alginolyticus 02 Nghêu: 01 8 Nước biển: 01
Trong 25 chủng phân lập được bao gồm 6 chủng thuộc loài V. cholerae (24%); 8 chủng thuộc loài V. paraheamolyticus (32%); 4 chủng thuộc loài V. vulnificus (16%); 5 chủng thuộc loài V. fluvialis (20%) và 2 chủng thuộc loài V. alginolyticus (8%).
Kết quả từ Bảng 4.3 cho thấy tỉ lệ phân lập V. paraheamolyticus là
cao nhất (32%), chúng xuất hiện trên nghêu, trong nước sông, đặc biệt ở nước ao nuôi tôm có độ mặn từ 6 - 8% và trên tôm, phù hợp với môi trường sống của chúng. Nghêu cũng là ký chủ thường xuyên của V.
74
vulniticus; V. fluvialis và V. alginolyticus. Riêng đối với môi trường nước
biến cũng rất thích hợp cho V. alginolyticus phát triển, và chúng cũng liên quan đến nhiễm trùng vết thương ở người, chiếm 71% các trường hợp nhiễm trùng (Hlady and Klontz,. 1996).
Nhiều nghiên cứu trong nước cũng cho thấy V. P araheamolyticus
được phân lập 40% từ hải sản, 20,1% từ môi trường nước biển và cửa sông tại thành phố Hồ Chí Minh, Cần Thơ và các tỉnh Cà Mau, Bến Tre, An Giang, Bạc Liêu (Nguyễn Hoàng Vũ, 2011).
Ngoài những chủng gây bệnh qua đường tiêu hoá thuộc loài V. cholerae, các loài khác thuộc Vibrios thường gây nhiễm trùng vết thương
như V. paraheamolyticus; V. vulnificus; V. fluvialis, 28% trường hợp người bị nhiễm V. parahaemolyticus do tiếp xúc với nước biển hoặc nước
lợ, V. vulnificus thường gặp nhất là nhiễm trùng vết thương là 64%, nhiễm trùng huyết là 30,1% và viêm dạ dày ruột là 5,9% (Desmarchelier, 1997).
4.1.6 Tỉ lệ nhiễm Vibrio spp. trên nghêu ở huyện Cầu Ngang và Duyên Hải
Tỉ lệ nhiễm Vibrio spp. trên nghêu của huyện Cầu Ngang và huyện
Duyên Hải được thể hiện trong Bảng 4.6:
Bảng 4.6: Tỉ lệ nhiễm Vibrio spp. trên nghêu tại 2 huyện
Huyện Số mẫu kiểm tra Dương tính
Số mẫu Tỉ lệ %)
Duyên Hải 80 05 6,25a Cầu Ngang 80 11 13,75a Tổng 160 16
Ghi chú: Tỉ lệ các mẫu dương tính khác biệt không có ý nghĩa thống kê Qua Bảng trên cho thấy tỉ lệ dương tính với Vibrio spp. trên nghêu của
huyện Cầu Ngang là 13.75% cao hơn so với tỉ lệ dương tính với Vibrio spp.
trên nghêu của huyện Duyên Hải là 6,25%, sự chênh lệch này không có ý nghĩa thống kê (p = 0,111), vì cả 2 huyện Duyên Hải và Cầu Ngang đều là những huyện giáp với biển và sông Cổ Chiên thuộc tỉnh Bến Tre, nơi đã từng xảy ra bệnh dịch tả năm 2010 (http://travinh.gov.vn), đặc biệt, nghêu là loài nhuyễn thể được nuôi phổ biến ở 2 huyện vùng ven biển. Những nhà khoa học cũng đã xác định nguyên nhân gây ra sự bùng phát dịch, và cảnh báo người dân về sự nguy hiểm liên quan đến việc tiêu thụ cá sống và các loài thủy sản nhất là nhuyễn thể (CDC, 2001-2009). Kết quả trong nghiên cứu này cũng
75
tương đương với kết quả khảo sát trên nhuyễn thể ở Đồng Nai và Thành phố Hồ Chí Minh, tỉ lệ dương tính với V. cholerae là 10,7% (Nguyễn Thị Xuân Trang và Nguyễn Ngọc Tuân,. 2012).
Đặc tính của vi khuẩn Vibrio spp. là thích nghi và tồn tại được ở môi
trường nước có nồng độ muối thích hợp 2%, 3% và 4%, 6% và 8%, vi khuẩn hiện diện phổ biến ở biển, ở sông và các loài hải sản như tôm, cua, sò, nghêu, hàu (Colwell, 2004).Người có thể bị nhiễm Vibrio spp. khi ăn sống hoặc chưa nấu chín các loại hải sản trên hoặc uống hay tiếp xúc các loại nước có nhiễm vi khuẩn Vibrio spp.. Ở Khánh Hòa (Việt Nam), từ năm 1997 đến 1999 có
nhiều ca nhiễm V. cholerae, và Khánh Hòa cũng là vùng ven biển, thức ăn sử dụng đa số là hải sản. Theo báo cáo thường niên của Trung tâm kiểm soát dịch bệnh thế giới năm 2011(CDC), thức ăn hải sản cũng được chứng minh về tỉ lệ nhiễm V.cholerae ở nhiều nước trên thế giới: hàu 65%, tôm 52%, cua 29%, nghêu 11% .
4.1.7 Tỉ lệ nhiễmVibrio spp. trên huyết heo tại một số huyện
Bảng 4.7: Tỉ lệ nhiễm Vibrio spp. trên huyết heo tại một số huyện
Huyện Số mẫu kiểm tra Dương tính
Số mẫu Tỉ lệ (%) Duyên Hải 20 0 0 Cầu Ngang 20 0 0 Châu Thành 20 04 20 Càng Long 20 0 0 T.Phố Trà Vinh 20 0 0
Kết quả cho thấy tại cơ sở giết mổ heo sử dụng nguồn nước từ môi trường nước sông thuộc huyện Châu Thành có 20% số mẫu được phân lập nhiễm vi khuẩn Vibrio spp. Tỉ lệ này cũng khá cao so với tỉ lệ nhiễm đã được phân lập trên nghêu của các huyện Cầu Ngang và Duyên Hải (từ 6,25 – 13,75%).
Tóm lại, nguồn nước vẫn là môi trường luôn luôn tồn tại vi khuẩn
Vibrio spp., khi nhiệt độ tại môi trường nước thay đổi từ 37 0C – 40 0C, hoặc nồng độ muối từ 2% - 8% sẽ là điều kiện thích hợp cho vi khuẩn thuộc Vibrio spp. phát triển và gây bệnh.
76
4.2 Kết quả định type huyết thanh
Kết quả định type huyết thanh học được thực hiện sau khi có kết quả định danh các loài thuộc Vibrio spp..
Bảng 4.8: Kết quả định type huyết thanh (n= 25)
Type huyết thanh Dương tính Tỉ lệ (%)
Inaba + Ogawa + O139 (đa giá) 6 24
(1) Ogawa: đơn giá 3 12
(2) Inaba: đơn giá 3 12
Chủng chưa xác định 19 76
Trong 25 chủng phân lập được có 6 (24%) chủng dương tính với kháng huyết thanh đa giá (O139, Ogawa, Inaba), trong đó có 3 (12%) chủng dương tính với kháng huyết thanh đơn giá Ogawa và 3 (12%) chủng dương tính với kháng huyết thanh đơn giá Inaba. Ngoài ra, có 19 (76%) chủng chưa xác định được type huyết thanh học. Kết quả bảng trên cũng phù hợp với kết quả PCR trong nghiên cứu này là chưa phát hiện chủng vi khuẩn mang gene O139rfb.
Kết quả huyết thanh học suy ra các gốc phân lập là nhóm huyết thanh O1, do đó chỉ ngưng kết với kháng huyết thanh Ogawa, Inaba và kháng huyết thanh đa giá, đây là cơ sở để phân biệt các chủng V. cholerae O1 và V. cholerae non-O1 (Trần Linh Thước, 2009). Những chủng vi khuẩn còn lại (19
chủng) không ngưng kết với kháng huyết thanh trên có thể thuộc chủng non- O1 và non-O139. Theo Garg et al., (2003) V. cholerae nằm trong nhóm các vi sinh vật thuộc hệ sinh thái là môi trường nước, các chủng thuộc O1 và O139 được phân lập ít so với các chủng non-O1 và non-O139 là những nhóm kháng huyết thanh không ngưng kết (NAG: nonagglutinable). Những chủng V.
cholerae không ngưng kết với kháng huyết thanh O1 nhưng vẫn gây bệnh và
có triệu chứng tiêu chảy trên người (Nicholas et al., 2000).
Ở Việt Nam, từ năm 1979 đến 1981 các ca bệnh tả chủ yếu là do type sinh học El Tor, type huyết thanh Ogawa; từ năm 1982 đến 1990 các ca bệnh tả đều nhiễm type huyết thanh Inaba, những năm sau 1990 các ca bệnh đều do type huyết thanh Ogawa. Ở miền Bắc Việt Nam, trong ba đợt bùng phát dịch tả giữa tháng 11 năm 2007 và tháng 2 năm 2008, tất cả 70 mẫu phân lập từ mẫu phân bệnh nhân và nước sông được xác định thuộc V. cholerae O1 type huyết thanh Ogawa với các phương pháp kiểm tra đặc tính sinh hoá và phản ứng ngưng kết huyết thanh học (Binh Minh Nguyen et al., 2009).
77
Nguyen et al. (2009) cũng chứng minh rằng các type huyết thanh Ogawa và Inaba từ những chủng phân lập tại Việt Nam cũng bắt nguồn từ các nước lân cận có đại dịch xảy ra như Lào (2007 – 2008) và Campuchia (2010). Những chủng phân lập ngoài môi trường cũng như từ triệu chứng lâm sàng chỉ dương tính với kháng huyết thanh O1, chưa phát hiện chủng O139. Tất cả những chủng phân lập ngoài môi trường và phân bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng từ năm 2003 đến 2004 đều thuộc type huyết thanh Inaba, nhưng từ năm 2007 đến 2011 những chủng phân lập từ triệu chứng lâm sàng đều thuộc type huyết thanh Ogawa, và ngược lại những chủng phân lập từ môi trường nước năm 2010 đều thuộc type huyết thanh Inaba.
Như vậy, các type huyết thanh trong nghiên cứu này là Ogawa và Inaba đều là những type đang phổ biến và hiện diện cả trong môi trường nước và trong thức ăn có nguồn gốc thủy hải sản.
4.3 Kết quả tính tương đồng giữa các loài thuộc Vibrio trên Genbank bằng công cụ BLAST Genbank bằng công cụ BLAST
Để so sánh tính tương đồng về trình tự nucleotide giữa các chủng V. cholerae phân lập được với các chủng khác ở các nước trên thế giới, nghiên
cứu tiến hành so sánh dựa theo trình tự nucleotide trên Genbank bằng công cụ BLAST.
Chuỗi trình tự chủng V. cholerae (Ng3), đại diện cho các mẫu phân lập từ thức ăn hải sản là nghêu có số nucleotide ban đầu là 1127.
78
Bảng 4.9: Bảng trình tự nucleotide V. cholerae_Ng3-TraVinhVN-2014
>V. cholerae_Ng3-TraVinhVN-2014 (1127 nucleotide)
1 TTA GCA GCG GGG CGA CGA GAT AGC AAG AGT CGA GCG GCA GCA CAG
46 AGG AAC TTG TTC CTT GGG TGG CGA GCG GCG GAC GGG TGA GTA ATG
91 CCT GGG AAA TTG CCC GGT AGA GGG GGA TAA CCA TTG GAA ACG ATG
136 GCT AAT ACC GCA TAA CCT CGC AAG AGC AAA GCA GGG GAC CTT CGG
181 GCC TTG CGC TAC CGG ATA TGC CCA GGT GGG ATT AGC TAG TTG GTG
226 AGG TAA GGG CTC ACC AAG GCG ACG ATC CCT AGC TGG TCT GAG AGG
271 ATG ATC AGC CAC ACT GGA ACT GAG ACA CGG TCC AGA CTC CTA CGG
316 GAG GCA GCA GTG GGG AAT ATT GCA CAA TGG GCG CAA GCC TGA TGC
361 AGC CAT GCC GCG TGT ATG AAG AAG GCC TTC GGG TTG TAA AGT ACT
406 TTC AGT AGG GAG GAA GGT GGT TAA GTT AAT ACC TTA ATC ATT TGA
451 CGT TAC CTA CAG AAG AAG CAC CGG CTA ACT CCG TGC CAG CAG CCG
496 CGG TAA TAC GGA GGG TGC AAG CGT TAA TCG GAA TTA CTG GGC GTA
541 AAG CGC ATG CAG GTG GTT TGT TAA GTC AGA TGT GAA AGC CCT GGG
586 CTC AAC CTA GGA ATC GCA TTT GAA ACT GAC AAG CTA GAG TAC TGT
631 AGA GGG GGG TAG AAT TTC AGG TGT AGC GGT GAA ATG CGT AGA GAT
676 CTG AAG GAA TAC CGG TGG CGA AGG CGG CCC CCT GGA CAG ATA CTG
721 ACA CTC AGA TGC GAA AGC GTG GGG AGC AAA CAG GAT TAG ATA CCC
766 TGG TAG TCC ACG CCG TAA ACG ATG TCT ACT TGG AGG TTG TGC CCT
811 AGA GGC GTG GCT TTC GGA GCT AAC GCG TTA AGT AGA CCG CCT GGG
856 GAG TAC GGT CGC AAG ATT AAA ACT CAA ATG AAT TGA CGG GGG CCC
901 GCA CAA GCG GTG GAG CAT GTG GTT TAA TTC GAT GCA ACG CGA AGA
946 ACC TTA CCT ACT CTT GAC ATC CAG AGA ATC TAG CGG AGA CGC TGG
991 AGT GCC TTC GGG AGC TCT GAG ACA GGT GCT GCA TGG CTG TCG TCA
1036 GCT CGT GTT GTG AAA TGT TGG GTT AAG TCC CGC AAC GAG CGC AAC
1081 CCT TAT CCT TGT TTG CCA GCA CGT AAT GGT GGG GAA CTC CAG GGA
79
Chuỗi trình tự chủng V. cholerae (N8), đại diện cho những chủng phân lập từ môi trường nước ở sông có số nucleotide ban đầu là 1145.
Bảng 4.10: Bảng trình tự nucleotide V. cholerae_N8-TraVinhVN-2014
>Vibrio_cholerae_N8_TravinhVN_2014 (1145 nucleotide)
1 GCA TGT GGG CGG CCT ATA CAT GCA AGT CGA GCG GCA GCA CAG AGG
46 AAC TTG TTC CTT GGG TGG CGA GCG GCG GAC GGG TGA GTA ATG CCT
91 GGG AAA TTG CCC GGT AGA GGG GGA TAA CCA TTG GAA ACG ATG GCT
136 AAT ACC GCA TAA CCT CGC AAG AGC AAA GCA GGG GAC CTT CGG GCC 181 TTG CGC TAC CGG ATA TGC CCA GGT GGG ATT AGC TAG TTG GTG AGG 226 TAA GGG CTC ACC AAG GCG ACG ATC CCT AGC TGG TCT GAG AGG ATG 271 ATC AGC CAC ACT GGA ACT GAG ACA CGG TCC AGA CTC CTA CGG GAG 316 GCA GCA GTG GGG AAT ATT GCA CAA TGG GCG CAA GCC TGA TGC AGC 361 CAT GCC GCG TGT ATG AAG AAG GCC TTC GGG TTG TAA AGT ACT TTC 406 AGT AGG GAG GAA GGT GGT TAA GTT AAT ACC TTA ATC ATT TGA CGT 451 TAC CTA CAG AAG AAG CAC CGG CTA ACT CCG TGC CAG CAG CCG CGG 496 TAA TAC GGA GGG TGC AAG CGT TAA TCG GAA TTA CTG GGC GTA AAG 541 CGC ATG CAG GTG GTT TGT TAA GTC AGA TGT GAA AGC CCT GGG CTC 586 AAC CTA GGA ATC GCA TTT GAA ACT GAC AAG CTA GAG TAC TGT AGA 631 GGG GGG TAG AAT TTC AGG TGT AGC GGT GAA ATG CGT AAA GAT CTG 676 AAG GAA TAC CGG TGG CGA AGG CGG CCC CCT GGA CAG ATA CTG ACA 721 CTC AGA TGC CAA AGC GTG GGG AGC AAA CAG GAT TAG ATA CCC TGG 766 TAG TCC ACG CCG TAA ACG ATG TCT ACT TGG AGG TTG TGC CCT AAA 811 GGG CGT GGC TTT CGG AGC TAA CGC GTT AAG TAG ACC CGC CCT GGG 856 GGA GGT ACG GGT CGC AAG ATT TAA AAC TCA AAA TTG AAT TTT ACC 901 GGG GGG GCC CGG CAC AAA GCC GGG TGG GAG CAT GTG GGT GTT ATA 946 TTC GAA TGG CAA CGC CGA AAG AAA CCC TTT ACC CTT ACT CCT TTG 991 ACA TTC CAG AGA ATC TTA GCG GAA AAC GCG TTG GAG GTG GCC TTT 1036 CGG GGG AGC TTC TTG AGA CAG GAT GCT GGC ATG GGC TGT TCG TTA 1081 CGC TCG TGT TGT GCA AAT GTT AGG GGT TAG GTT CCC GGC AAC CGA 1126 GGA CGG CGA AAC GCA CGA CA- 1145
Dựa vào kết quả giải trình tự các sản phẩm PCR của các chủng phân lập chọn 5 trình tự của 5 chủng thuộc Vibrios: V. cholerae-Ng3, V. cholerae-
O3.2, V. cholerae-O1.2, V. cholerae-N8 và V. paraheamolyticus-O9.1 so sánh với các trình tự tương đồng trên Genbank (BLAST) được thể hiện qua cây di truyền để hiểu rõ về cơ chế tiến hóa liên quan đến chủng phân lập ngoài môi trường và chủng phân lập từ bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng:
80
Hình 4.6: Cây biễu diễn mối quan hệ di truyền dựa trên 16srDNA của các Vibrio spp. phân lập và một số chủng tham khảo phân lập và một số chủng tham khảo
Lịch sử tiến hóa được suy ra bằng cách sử dụng phương pháp Neighbor-Joining [1.Saitou, 1998]. với tổng chiều dài các nhánh = 29.77292208, khoảng cách tiến hóa sử dụng để suy ra cây phát sinh loài [2.Tamura, 2004]. Phân tích liên quan đến 31 trình tự nucleotide. Vị trí codon bao gồm là 1 + 2 + 3 + không mã hoá. Tất cả các mục có chứa khoảng trống và dữ liệu bị mất đã được loại bỏ. Có tổng cộng 436 vị trí trong số liệu cuối cùng. Phân tích tiến hóa được thực hiện tại MEGA5