2.7.1 Nguyên lý sử dụng vaccine
Sử dụng vaccine là đưa vào cơ thể kháng nguyên có nguồn gốc từ vi sinh vật gây bệnh hoặc vi sinh vật có cấu trúc kháng nguyên giống vi sinh vật gây bệnh, đã được bào chế đảm bảo độ an toàn cần thiết, làm cho cơ thể tự tạo ra tình trạng miễn dịch chống lại tác nhân gây bệnh, là loại miễn dịch chủ động nhân tạo.
Tình trạng miễn dịch mà cơ thể có được sau khi sử dụng vaccine là kết quả của sự đáp ứng miễn dịch đối với các thành phần kháng nguyên có trong vaccine. Cơ thể luôn luôn đáp ứng bằng cả miễn dịch dịch thể (miễn dịch qua trung gian kháng thể) và miễn dịch tế bào (miễn dịch qua trung gian tế bào),
46
nhưng tuỳ từng loại vaccine, hiệu lực bảo vệ có thể do miễn dịch dịch thể, miễn dịch tế bào hoặc phối hợp cả hai loại. Ngoài miễn dịch đặc hiệu, vaccine còn có khả năng tăng cường cả miễn dịch không đặc hiệu như làm tăng quá trình thực bào nhờ kháng thể đóng vai trò là yếu tố opsonin đặc hiệu, nhờ lymphokin hoạt hoá đại thực bào (vi.wikipedia.org/wiki/Vắc-xin).
2.7.2 Cơ chế hoạt động của vaccine
Hệ miễn dịch nhận diện vaccine là vật lạ nên hủy diệt chúng và "ghi nhớ" chúng. Về sau, khi tác nhân gây bệnh thực thụ xâm nhập cơ thể, hệ miễn dịch sẵn sàng tấn công tác nhân gây bệnh nhanh chóng hơn và hữu hiệu hơn (bằng cách huy động nhiều thành phần của hệ miễn dịch, đặc biệt là đánh thức các tế bào lympho nhớ). Đây là các ưu điểm của đáp ứng miễn dịch đặc hiệu
Vaccine phòng bệnh tả được dùng để thúc đẩ quá trình miễn dịch chủ động đối với bệnh tả ở người có nguy cơ cao tiếp khi xúc với bệnh này. Vi khuẩn tả V. cholerae bất hoạt có trong vaccine thúc đẩy sản sinh kháng thể
diệt khuẩn.
Vaccine dạng tiêm không có tác dụng miễn dịch chống lại nhiễm bệnh do các chủng V. cholerae khác, kể cả chủng V. cholerae nhóm O139. Nhưng
đối với vaccine dạng uống do Viện Vệ sinh dịch tễ Việt Nam sản xuất không những tạo miễn dịch đối với bệnh do vi khuẩn V. cholerae nhóm O1 type sinh học cổ điển hoặc type sinh học El tor mà còn đối với bệnh do vi khuẩn V. cholerae nhóm O139.
Vaccine phòng bệnh tả được dùng để thúc đẩy quá trình miễn dịch chủ động đối với những người sinh sống và làm việc trong vùng có bệnh tả lưu hành và điều kiện vệ sinh kém, đối với nhân viên y tế xét nghiệm viên thường xuyên tiếp xúc với người bệnh.
Vaccine tả còn được dùng để thúc đẩy quá trình miễn dịch chủ động đối với bệnh tả cho những người đi du lịch tới những vùng có bệnh tả đang lưu hành. (vi.wikipedia.org/wiki/Vắc-xin)
47
Chương 3: NỘI DUNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Nội dung nghiên cứu
- Phân lập, định danh, tỉ lệ nhiễm vi khuẩn Vibrio spp. trên các loại mẫu tại tỉnh Trà Vinh;
- Định type huyết thanh học vi khuẩn V. cholerae phân lập được. - Giải trình tự nucleotide gene 16S rDNA.
- Xác định gene kháng kháng sinh vi khuẩn V. cholerae được tuyển chọn. - Thử nghiệm chủng V. cholerae phân lập được trên thỏ nhằm đánh sự
đột biến của V. cholerae và khả năng đáp ứng miễn dịch đối với vaccine hiện hành.
* Thời gian nghiên cứu: từ tháng 10/2012 – 4/2014 * Địa điểm nghiên cứu:
Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng Đại học Cần Thơ; Bệnh viện đa khoa Trung ương Cần Thơ; Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học Đại học Cần Thơ; Khoa Nông nghiệp – Thuỷ sản trường Đại học Trà Vinh; mẫu gửi giải trình tự tại công ty Macgrogen Hàn Quốc.
3.2 Phương tiện và phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Phương tiện nghiên cứu 3.2.1 Phương tiện nghiên cứu
3.2.1.1 Hoá chất, môi trường nuôi cấy vi khuẩn
Các môi trường và hóa chất dùng phân lập vi khuẩn gồm có: Nước cất, nước muối sinh lý (NaCl 0,9%), thuốc thử Kowacs, cồn 96o, cồn 70o, muối tinh khiết, alkaline saline peptone water (ASPW) với các nồng độ từ 0-10%. Môi trường chuyên chở mẫu bệnh phẩm: Cary- Blair (India); môi trường nuôi cấy: TCBS: Thạch Thiosunfat-Citrat-Bile-muối-Sacaroza (Merck); SNA: Saline Nutrient Agar (Merck); môi trường làm kháng sinh đồ: MHA (Muller Hinton Agar), đĩa giấy tẩm kháng sinh (Nam Khoa, Tp. HCM).
Môi trường thử sinh hóa vi khuẩn phân lập: đĩa giấy oxidase, đĩa giấy ONPG, TSI agar (Saline triple sugar iron agar), ADH (Arginine Dihydrolase), Tryptophan saline (Bộ định danh vi khuẩn Gram âm: IDS 14GNR, Nam Khoa, Tp.HCM).
Các kháng sinh sử dụng gồm: 8 loại đĩa kháng sinh thường dùng trong điều trị bệnh tả do vibrio: streptomycin (10μg), norfloxacin (10μg), ampicillin
48
(10μg), tetracycline (30μg), azithromycin (30μg), amoxicillin-clavulanic axit (30μg), trimethoprim-sulfamethoxazole (25μg) và vancomycin (30μg) (Công ty Nam Khoa).
Bộ thuốc nhuộm Gram: dung dịch crystal violet; lugol; cồn - aceton; safranin(Germany)
Kháng huyết thanh định type V. cholerae: Kháng huyết thanh tả đa giá kháng lại 3 chủng: Inaba, Ogawa và O139; kháng huyết thanh tả đơn giá Inaba; kháng huyết thanh tả đơn giá Ogawa, kháng huyết thanh tả đơn giá O139 (Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.2.1.2 Hoá chất, sinh phẩm dùng cho phản ứng PCR a) Xác định vi khuẩn dựa trên đoạn gene 16S rDNA
Hoá chất ly trích DNA: Tris-HCl, EDTA, H20; hoá chất PCR: Buffer, MgCl2 ,dNTPS , DMSO, Taq polymerase.
b) Xác định gene kháng kháng sinh
Hoá chất ly trích DNA: Tris-HCl, EDTA, H20; hoá chất PCR: Buffer, MgCl2, dNTPS , DMSO, Taq polymerase và các cặp mồi xác định gene kháng kháng sinh.
3.2.1.3 Vật liệu nghiên cứu Mẫu
160 mẫu nghêu thu từ huyện Duyên Hải, huyện Cầu Ngang; 100 mẫu huyết heo thu từ các cơ sở giết mổ heo tại Thành phố Trà Vinh, huyện Châu Thành, huyện Duyên Hải, huyện Cầu Ngang và huyện Càng Long; 40 mẫu phân lấy từ bệnh nhân tiêu chảy tại bệnh viện Đa khoa tỉnh Trà Vinh; 150 mẫu nước thu từ sông, nước biển và các địa điểm nuôi tôm; 50 mẫu tôm thu từ huyện Duyên Hải. Tất cả các mẫu được bảo quản trong thùng trữ lạnh và chuyển về phòng thí nghiệm để nuôi cấy, phân lập.
Vi khuẩn dùng thử nghiệm trên thỏ
- Vi khuẩn: Những chủng vi khuẩn thuộc V. cholerae đã phân lập được dùng thử nghiệm trên thỏ sau khi hoạt hoá trong 2 giờ và tăng sinh trong môi trường APW ở 350C từ 18-24 giờ để có nồng độ vi khuẩn trong 1 ml tương đương 1x105 đến 5 x 107 CFU (Richardson, 1991).
- Vaccine tả uống (mORCVAX) điều chế từ các chủng vi khuẩn tả toàn tế bào chết, gồm type sinh học Cổ điển và type sinh học El Tor và chủng vi khuẩn tả O139, có chứa những phần bằng nhau của các chủng Ogawa và Inaba
49
của vi khuẩn tả V. cholerae nhóm O1 được tách chiết từ môi trường nuôi cấy có dung dịch đệm là natriclorid và làm bất hoạt vi khuẩn bằng phenol. Vaccine phòng bệnh tả chứa 8 đơn vị của mỗi chủng vi khuẩn V . cholerae (4 tỷ tế bào) trong 1 ml (Công ty TNHH MTV Vaccine và Sinh phẩm số 1, Hà Nội) (Phụ lục 15).
- Động vật thí nghiệm: 24 thỏ trắng giống New Zealand, trọng lượng 2- 2,5kg/con.
Hình 3.1: Thỏ thí nghiệm
3.2.1.4 Thiết bị - Dụng cụ
Các thiết bị và dụng cụ phục vụ nghiên cứu bao gồm: Tủ sấy, tủ ấm, tủ lạnh, autoclave, máy lắc, buồng cấy vô trùng và kính hiển vi, cân điện tử, ống nghiệm, đĩa petri, chai, ống đong, ống hút, lam, kẹp, kéo, tăm bông vô trùng, găng tay, đèn cồn, túi nilon và thùng trữ lạnh, giấy đo pH.
3.2.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.2.1 Phương pháp phân lập, định danh vi khuẩn * Phương pháp lấy mẫu
Mẫu nghêu: Nghêu được thu mua tại các chợ huyện Duyên Hải và Cầu Ngang, nghêu còn tươi (khoảng 25gram/con), rửa sạch chất bẩn bên ngoài, lấy 1gram phần thịt cắt nhuyễn và tăng sinh trong 9 ml môi trường ASPW.
Mẫu huyết heo: Mẫu được thu từ các cơ sở giết mổ thuộc Thành phố Trà Vinh, huyện Châu Thành, huyện Duyên Hải, huyện Cầu Ngang và huyện Càng Long. Ở mỗi cơ sở lấy 25 ml mẫu/lần có pha nước muối với tỉ lệ 0,5%, mẫu được chuyển về phòng thí nghiệm, và l ml mẫu được tăng sinh trong 9 ml môi trường ASPW .
50
Mẫu nước: Các mẫu nước được thu trên bề mặt nước tại các ao nuôi tôm, nước sông, nước biển (mỗi loại 25 ml mẫu), tại phòng thí nghiệm 1ml nước được tăng sinh trong 9ml môi trường ASPW.
Mẫu tôm: Các mẫu tôm được thu từ huyện Duyên Hải, tôm còn tươi (khoảng 150gram/con) tôm được rửa sạch, lấy phần đầu, cắt nhuyễn 1gram mẫu, lọc lấy dịch trong và tăng sinh trong 9 ml môi trường ASPW.
Mẫu phân bệnh nhân tiêu chảy: Phân của bệnh nhân tiêu chảy được lấy bằng tăm bông từ trực tràng, bảo quản ở môi trường vận chuyển Carry- Blair, và chuyển về phòng thí nghiệm để nuôi cấy, phân lập.
* Phương pháp nuôi cấy
Các loại mẫu đều được nuôi tích lũy 2 lần trong môi trường ASPW. 1 ml mẫu được tăng sinh trong 9 ml môi trường ASPW ủ lần 1 ở 370C từ 6-8 giờ. Sau đó lấy 1 ml từ môi trường trên cho vào 10 ml môi trường ASPW ủ lần 2 ở 41,50C từ 16-18 giờ nhằm ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn cạnh tranh.
- Phân lập trên môi trường chuyên biệt TCBS ở 370C trong 24 giờ: khuẩn lạc có thể có màu vàng hoặc xanh tùy loài vi khuẩn.
- Chọn khuẩn lạc điển hình cấy chuyển sang môi trường thạch dinh dưỡng có muối (SNA): môi trường không có tính chọn lọc, việc nuôi cấy trên môi trường này chỉ nhằm làm tăng số lượng khuẩn lạc của vi khuẩn. Trên SNA khuẩn lạc Vibrio spp. tròn, trơn, láng, bóng, màu trắng sữa.
a. Xác định V. cholerae bằng phản ứng sinh hóa (quy trình ISO/TS 21872-1:2007)
Các thử nghiệm sinh hoá quan trọng để phát hiện hay phân biệt các loài vibrio được thực hiện theo quy trình ISO/TS 21872-1:2007 (E). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chọn khuẩn lạc trên môi trường SNA để thử các đặc tính: phản ứng sinh oxidase; kiểm tra tính lên men đường glucose hoặc lactose; khả năng sinh hơi và sinh H2S; thử phản ứng sinh Indole và sự di động của vi khuẩn. Thử tính ưa mặn của Vibrio spp. ở các nồng độ NaCl khác nhau (0%, 2%, 6%, 8% và 10%), V. cholerae mọc tốt trên môi trường có muối từ 0 – 2%; V. parahaemolyticus và V. aginolyticus từ 2 – 8 %, V. vulnificus và V. fluvialis từ
2 – 6%.
* Thử nghiệm oxidase: Nhỏ nước muối sinh lý lên lam sạch và đặt đĩa giấy tẩm oxidase, dùng que cấy đầu tròn lấy một ít sinh khối vi khuẩn từ đĩa môi trường SNA lên đĩa giấy tẩm oxidase đã được làm ướt và quan sát.
51
Đọc kết quả trong vòng 10 giây đến 1 phút, nếu đĩa giấy chuyển màu xám, tím hoặc xanh tím là kết quả dương tính, không đổi màu là kết quả âm tính.
* Thử nghiệm trên TSI: Mục đích của việc cấy trên môi trường này là kiểm tra tính lên men đường glucose, lactose, tính sinh gas và tính sinh H2S của vi khuẩn.
Môi trường TSI được pha chế có màu đỏ cam, hấp khử trùng sau khi đổ vào ống nghiệm, môi trường đặt nghiêng, phần nghiêng cao tương đương phần đứng và chiều dài môi trường đạt không qua 2/3 chiều cao ống nghiệm, tuyệt đối không để thạch chạm nắp ống nghiệm.
Cách cấy vi khuẩn
Trong điều kiện vô trùng, chọn lấy một khuẩn lạc Vibrios riêng rẽ trên môi trường SNA cấy vào môi trường TSI saline. Dùng que cấy thẳng cấy vi khuẩn Vibrio nghi ngờ thẳng xuống phần thạch đứng, phần thạch nghiêng ria
cấy ngang đem ủ ở 37 0C trong 24 giờ. Đọc kết quả dựa vào sự thay đổi đặc trưng của môi trường:
Nếu vi khuẩn có sinh H2S thì giữa vùng thạch đứng và thạch nghiêng sẽ có màu đen.
Nếu vi khuẩn có sinh hơi thì sẽ xuất hiện bọt trên mặt thạch hoặc cột thạch có những đường nứt.
Nếu vi khuẩn lên men đường glucose, không lên men đường lactose thì phần thạch nghiêng có màu đỏ hồng còn phần thạch đứng có màu vàng.
* Thử khả năng sinh indole
+ Nguyên tắc: là thử khả năng oxy hóa acid amine tryptophane của vi khuẩn thành những sản phẩm biến dưỡng có gốc indole gồm indole, sketole. Việc phát hiện indole được thực hiện bằng phản ứng của phân tử này với thuốc thử Kovacs (para dimethylaminobenzaldehyde, p-DMABA) tạo nên một phức chất dạng quinone có màu đỏ.
+ Phương pháp tiến hành: nhỏ 2 – 3 giọt thuốc thử Kovacs vào ống nghiệm vi khuẩn có Trypton và DL-trytophan đã được ủ ở 37oC trong 24 giờ:
Phản ứng dương tính (+): có vòng đỏ hồng xuất hiện sau 2 – 3 phút. Phản ứng âm tính (-): khi không có vòng đỏ hồng trên mặt môi trường sau khi nhỏ thuốc thử. Do vi khuẩn Vibrios có khả năng sinh indole nên phản ứng indole dương tính (+) và có một vòng đỏ trên môi trường ống nghiệm.
52
* Thử tính ưa mặn: V. cholerae phát triển tốt ở môi trường có nồng độ muối từ 2 – 3%, do đó để xác định sự hiện diện của vi khuẩn cần cấy vi khuẩn ở các nồng độ muối (NaCl) khác nhau (0%, 2%, 6%, 8% và 10%).
Dùng que cấy thẳng cấy vi khuẩn Vibrios nghi ngờvào ống nghiệm có chứa môi trường peptone có muối ở các nồng độ trên, đem ủ ở 370C trong 24 giờ. Đọc kết quả dựa vào sự thay đổi độ đục của môi trường: ống nghiệm đục cho kết quả dương tính, ống nghiệm trong suốt cho kết quả âm tính. Vi khuẩn mọc tốt ở môi trường có nồng độ muối 2%.
* Nhuộm Gram: vi khuẩn sau khi phân lập từ các khuẩn lạc điển hình sẽ tiến hành nhuộm Gram giúp phân biệt 2 nhóm vi khuẩn: vi khuẩn Gram dương bắt màu tím và vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng. Ngoài ra còn giúp quan sát và phân biệt về hình dáng, cấu tạo, cách phân bố của các loại vi khuẩn khác nhau.
Kết luận: Vi khuẩn Vibrio spp. thuộc nhóm Gram âm nên sau khi
nhuộm và quan sát dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 100X, vi khuẩn sẽ bắt màu hồng nhạt và có hình que ngắn. Các gốc vi khuẩn trên tiếp tục làm tiêu bản và chụp dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM-JSM 5550) tại phòng thí nghiệm chuyên sâu Đại học Cần Thơ.
b. Xác định chủng V. cholerae bằng máy định danh tự động
28 gốc vi khuẩn nghi ngờ Vibrio sau khi thử sinh hóa, được gửi định
danh bằng máy định danh tự động (Vitex 2 compact- Biomerieux) tại Bệnh viện Đa khoa Trung ương Cần Thơ.
Nguyên lý định danh vi sinh vật là dùng phương pháp đo màu để nhận biết các tính chất sinh hoá của vi sinh vật thông qua sự thay đổi màu của các giếng môi trường có sẵn trong thẻ (card). Các thẻ định danh được phủ hoá chất tối đa 64 giếng, các giếng có hoá chất đặc biệt phù hợp với tính chất sinh hoá của vi sinh vật khác nhau.
Máy sẽ tự động báo cáo kết quả khi xét nghiệm hoàn tất từ 5 – 7 giờ, bao gồm tỉ lệ dương tính của từng loài thuộc Vibrio và kết quả chi tiết về sinh hoá thông qua nguyên lý đo cường độ ánh sáng bị chặn lại (hay sự suy giảm cường độ ánh sáng) khi ánh sáng đi qua giếng với các bước sóng 660 nm, 568 nm, 428 nm.
53
Quy trình phân lập Vibrio spp. theo tiêu chuẩn ISO/TS 21872-2:2007 được tóm tắt trong Hình 3.2: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.2: Quy trình phân lập và định danh Vibrio spp.
O1
Thực hiện phản ứng ngưng kết với kháng huyết thanh
O139
Ogawa Inaba
1ml vào ống chứa 10ml ASPW Ủ 410C/18h
Cấy chuyển sang môi trường TCBS Ủ 24h ở 37oC
Cấy chuyển sang môi trường TCBS Ủ 24h ở 37oC
Chọn ít nhất 5 khuẩn lạc điển hình, cấy chuyển sang môi trường TCBS
Ủ 24h ở 37oC
Cấy sang môi trường NA saline (SNA) Ủ 24h ở 37oC
Cấy sang môi trường NA saline (SNA) Ủ 24h ở 37oC
Kiểm tra các đặc tính sinh hóa
[Xác định vi khuẩn Vibrio spp. và cấy thuần lại trên SNA
Giữ giống
Cho 1ml mẫu vào ống nghiệm chứa 9m nước Peptone kiềm (ASPW); ủ 37 0C/6 giờ
Cho 1ml mẫu vào ống nghiệm chứa 9m nước Peptone kiềm (ASPW)
54
c. Phương pháp định type huyết thanh học
Việc định type huyết thanh của V. cholerae được thực hiện bằng phản ứng ngưng kết với 4 loại kháng huyết thanh qua bảng tóm tắt sau:
Bảng 3.1: Tóm tắt thử nghiệm kháng huyết thanh V. cholerae
Kháng nguyên Kháng huyết thanh Inaba Kháng huyết thanh Ogawa Kháng huyết thanh O139 Dung dịch muối sinh lý Kết luận V. cholerae + - - - Chủng Inaba V. cholerae - + - - Chủng Ogawa V. cholerae - - + - Chủng O139