- Các chỉ tiêu theo dõ
a. Xét nghiệm hai bệnh Greening và Tristeza
Bệnh Greening: mỗi lồi sinh vật cĩ cấu trúc DNA khác nhau và trong cùng một giống giữa các lồi cũng cĩ sự khác nhau, vì vậy cấu trúc đặc trưng cho lồi này mà những lồi khác khơng cĩ. Đây là cơ sở di truyền để phân biệt giữa lồi này và lồi khác. Phương pháp PCR chính là nhằm nhân lên gấp bội số lượng các đoạn DNA đặc trưng từ đĩ cĩ thể chẩn đốn chính xác được các lồi. Đối với các phương pháp giám định bệnh, việc đầu tiên phải thu thập mẫu, tách gân và cân 0,5g/mẫu. Nghiền mẫu cùng với dịch nghiền đặc hiệuvà thu lấy dịch chiết. Quy trình giám định bệnh Greening bằng kỹ thuật PCR đã được giáo sư Hong Ji Su- trường Đại học Tổng Hợp Đài Loan nghiên cứu.
+ Bước một: tách chiết và tinh sạch DNA: dịch chiết sau khi thu được gạn cho vào tuýp, ủ trong bể định ơn ở 55oC trong 60 phút, ly tâm trong 5 phút, gạn lấy dịch trong phía trên sang tuýt khác rồi thêm lần lượt vào mỗi tuýp các dung dịch cần thiết, lắc nhẹ và tiếp tục ủ trong bể định ổn. Sau khi cho các dung dịch và ly tâm để lấy phần dịch trong, đổ tồn bộ phần dịch, viên
DNA gắn chặt ở đáy tuýp được rữa bằng cồn 70oC, làm khơ và lại được làm tan bằng dung mơi.
+ Bước hai: Khuyếch đại DNA của vi khuẩn Greening bằng kỹ thuật PCR: cho dung mơi cũng như mồi của phản ứng và thực hiện chu trình nhiệt chạy máy.
+ Bước ba: Chạy điện di sản phẩm PCR: hút vào mỗi giếng trên agarose gel 1,4% µl sản phẩm PCR và 2 µl loading dye rồi chạy máy điện di với hiệu điện thế 100V trong 45 phút. Sau đĩ xác định kết quả bằng việc nhuộm DNA bằng Ethidium Bromide, soi trên đèn cực tím, chụp ảnh. Sau khi cĩ kết quả, căn cứ vào sự xuất hiện một vạch trắng trên miếng thạch của mẫu đối chứng bệnh và mẫu đối chứng khoẻ khơng cĩ vạch trắng. Mẫu thử nào cĩ xuất hiện vạch trắng sáng ngang với vạch trắng sáng của đối chứng bệnh là những mẫu nhiễm bệnh Greening và ngược lại đối với những mẫu khơng nhiễm bệnh. ( Viện nghiên Cứu Cây Aên Quả miền Nam, 2003).
Trong xét nghiệm bệnh Greening viện NCCAQ miền Nam đã sử dụng phương pháp PCR, dùng đoạn mồi 16SA2-Rorev5.
Bệnh Tristeza: trong xét nghiệm đã sử dụng phương pháp Elisa (enzyme – linked immunoSorbent assay) cũng cĩ thể indexing bằng phương pháp ghép trên cây chỉ thị, chanh qủa nhỏ Mexique (Citrus aurantifolia) được dùng.
Kết qủa xét nghiệm được trình bày ở Bảng 1.13
Bảng 1.13: Kết qủa xét nghiệm hai bệnh Greening và Tristeza TT Mã số Tên giống Kết qủa giám
định PCR Kết qủa giám định Elisa Ghi chú
ĐC + + - Bệnh VLG
ĐC + - + Trisreza
ĐC - - - Khơng bệnh
1 13/9 Cam sành - + Tristeza nịi nhẹ
2 8/9 Cam Phi mĩn - + Tristeza nịi nhẹ
3 1/7 Cam sọc - -
4 10/7 Cam sồn - -
5 15 Cam Taiwan
TN1 - -
6 9/6 Quýt đường - + Tristeza nịi nhẹ
8 7/5 Quýt Chu Khun - -
9 11/3 Quýt Orlando - -
10 6/2 Bưởi Khao Nam Phung
- -
11 5/2 Bưởi Khao Paen - -
12 4/4 Bưởi da xanh - -
13 3/2 Bưởi 5 roi - -
14 2/4 Bưởi đường lá
cam - -
Phân tích tại phịng lab viện CAQMN. Cam Thái do bị chai nên khơng xét nghiệm.
Kết quả cho thấy tất cả các giống khơng nhiễm bệnh Greening, cịn bệnh Tristeza thì cam Sành, quýt đường và cam Phimon bị nhiễm nịi nhẹ, khơng đáng ngại (Lê Thị Thu Hồng). Ở nước ta bệnh Greening và Tristeza đang gây hại nghiêm trọng cho các giống cây trong họ cam quýt, hiện nay chưa cĩ biện pháp phịng trừ hữu hiệu hai dịch bệnh này. Mới đây viện NCCAQ miền Nam đã phát hiện việc xen canh ổi trong vườn cam làm hạn chế sự xuất hiện của rầy chổng cánh. Như vậy nếu dùng cây ghép sạch bệnh và dùng biện pháp trồng xen cam quýt với ổi (giữ cây ổi cao gần tương đương với cây cam quýt) thì cĩ thể làm cây sạch bệnh kéo dài thời gian hơn, làm chậm lại sự tái nhiễm.