Nghiên cứu tác dụng chống suy giảm tiểu cầu của carpain và flavonoid từ lá đu đủ trên mô hình gây suy giảm tiểu cầu bằng cyclophosphamid

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ NINH NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG SUY GIẢM TIỂU CẦU CỦA CARPAIN VÀ FLAVONOID TỪ LÁ ĐU ĐỦ TRÊN MÔ HÌNH GÂY SUY GIẢM TIỂU CẦU BẰNG CYCLOPHOSPH

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ NINH

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG SUY GIẢM TIỂU CẦU CỦA CARPAIN

VÀ FLAVONOID TỪ LÁ ĐU ĐỦ TRÊN

MÔ HÌNH GÂY SUY GIẢM TIỂU CẦU

BẰNG CYCLOPHOSPHAMID

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2021

VÀ FLAVONOID TỪ LÁ ĐU ĐỦ TRÊN

MÔ HÌNH GÂY SUY GIẢM TIỂU CẦU

i

LỜI CẢM ƠN

Bằng tất cả sự chân thành và lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn tới TS Hà

Vân Oanh, TS Lê Thị Xoan những người thầy đã luôn tận tụy, hết lòng quan tâm,

hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Em xin chân thành cảm ơn DS Đinh Thị Minh, một người chị làm việc tại khoa

Dược lý-Sinh hóa Viện Dược Liệu đã trực tiếp tham gia và giúp đỡ em trong thời gian nghiên cứu

Em xin gửi lời cảm ơn Đảng ủy, Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo cùng các bộ môn, phòng ban khác của Trường đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện cho em trong thời gian học tập và nghiên cứu

Em xin cảm ơn các anh chị, bạn bè đã và đang nghiên cứu khoa học tại khoa Dược lý-Sinh hóa Viện Dược Liệu đã luôn đồng hành, hỗ trợ, động viên em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã luôn bên cạnh, ủng hộ, chia sẻ khó khăn và động viên em thực hiện khóa luận này

Hà Nội, tháng 5 năm 2021

Sinh viên

Trần Thị Ninh

ii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH VẼ v

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Giảm tiểu cầu 3

1.1.1 Định nghĩa 3

1.1.2 Chẩn đoán 3

1.1.3 Nguyên nhân 5

1.1.4 Một số bệnh lý gây giảm tiểu cầu thường gặp 5

1.2 Đu đủ 9

1.2.1 Đặc điểm thực vật 9

1.2.2 Thành phần hóa học của cây Đu đủ 10

1.2.3 Carpain trong lá Đu đủ 11

1.2.3 Flavonoid trong lá Đu đủ 12

1.2.4 Tác dụng dược lý của cây Đu đủ 15

1.3 Các mô hình gây giảm tiểu cầu đã biết 16

1.3.1 Gây giảm tiểu cầu bằng hóa trị liệu 16

1.3.2 Giảm tiểu cầu qua kháng thể kháng tiểu cầu 19

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.1.1 Nguyên liệu 20

2.1.2 Động vật thí nghiệm 22

2.1.3 Hóa chất thuốc thử, thiết bị nghiên cứu 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 22

2.2.2 Xác định các thông số nghiên cứu 26

2.3 Phương pháp xử lý số liệu 26

iii

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 28

3.1 Kết quả nghiên cứu 28

3.1.1 Kết quả đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của cao chiết toàn phần lá Đu đủ 28

3.1.2 Kết quả đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của các phân đoạn cao chiết lá Đu đủ khác nhau 32

3.1.3 Kết quả đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của carpain từ lá Đu đủ 34

3.1.4 Kết quả đánh giá được tác dụng chống giảm tiểu cầu của cao giàu flavonoid từ lá Đu đủ… 35

3.2 Bàn luận 37

3.2.1 Về đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của cao chiết toàn phần lá Đu đủ 37

3.2.2 Về tác dụng chống giảm tiểu cầu của các cao chiết phân đoạn lá đu đủ 39

3.2.3 Về tác dụng chống giảm tiểu cầu của carpain được phân lập và tinh chế từ lá Đu đủ 41

3.2.4 Về tác dụng chống giảm tiểu cầu của cao giàu flavonoid từ lá Đu đủ 42

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

iv

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2 1 Thành phần carpain và flavonoid của một số mẫu nghiên cứu 20

v

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Quy trình chẩn đoán bệnh nhân giảm tiểu cầu [37] 4

Hình 1.2 Một số acid phenolic có trong lá Đu đủ 1: acid protocatechuic, 2: acid coumaric, 3: acid caffeic, 4: acid chlorogenic 10

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử β-caroten 10

Hình 1.4 Cấu trúc cơ bản của các flavonoid 13

Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 22

Hình 2.2 Quy trình nghiên cứu 26

Hình 3.1 Ảnh hưởng của cao chiết toàn phần lá Đu đủ đến số lượng tiểu cầu 28

Hình 3.2 Ảnh hưởng của cao chiết toàn phần lá Đu đủ đến số lượng bạch cầu 29

Hình 3.3 Ảnh hưởng của cao chiết toàn phần lá Đu đủ đến số lượng hồng cầu 30

Hình 3.4 Ảnh hưởng của cao chiết toàn phần lá Đu đủ đến thời gian chảy máu trên chuột 31

Hình 3.5 Ảnh hưởng của các phân đoạn cao chiết lá Đu đủ đến số lượng tiểu cầu 32

Hình 3.6 Ảnh hưởng của các cao chiết phân đoạn lá Đu đủ đến thời gian chảy máu trên chuột…… 33

Hình 3.7 Ảnh hưởng của carpain từ lá Đu đủ đến số lượng tiểu cầu qua các ngày 34

Hình 3.8 Ảnh hưởng của cao chiết giàu flavonoid từ lá Đu đủ đến số lượng tiểu cầu qua các ngày 35

Hình 3.9 Ảnh hưởng của cao chiết giàu flavonoid từ lá Đu đủ đến thời gian chảy máu trên động vật thí nghiệm 36

vi

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

(Neonatal alloimmune thrombocytopenia)

(Helicobacter pylori)

(Disseminated intravascular coagulation)

(Human immunodeficiency virus)

(Immune Thrombocytopenic Purpura)

(A high-performance liquid chromatography)

(A high-performance liquid chromatography in combination with inductively coupled plasma mass spectrometry)

cytokin và sự tồn tại của tế bào (Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B)

nhiều loại kích thích (Activator protein 1)

ĐẶT VẤN ĐỀ

Các bác sỹ lâm sàng thường xuyên phải đối mặt với một bệnh nhân giảm tiểu cầu trên các nền bệnh lý khác nhau, có thể xảy ra theo nhiều nguyên nhân như giảm sản xuất tiểu cầu, tăng phá hủy tiểu cầu ở máu ngoại vi hay tăng bắt giữ tiểu cầu tại lách Những nguyên nhân này rất khó để chẩn đoán xác định tại thời điểm phát hiện bệnh giảm tiểu cầu Nguyên tắc quản lý cơ bản trên bệnh nhân giảm tiểu cầu là theo dõi chặt chẽ tình trạng bệnh, tìm ra được yếu tố căn nguyên gây giảm tiểu cầu, duy trì số lượng tiểu cầu an toàn hoặc ngăn ngừa nguy cơ xuất huyết trên bệnh nhân bởi không phải lúc nào cũng tìm ra và can thiệp được nguyên nhân gây giảm tiểu cầu (giảm tiểu cầu tự phát) Các thuốc có thể sử dụng trong một số tình trạng giảm tiểu cầu như corticosteroid, thông thường là prednison hoặc methyl presnisolon Truyền tiểu cầu cũng là một biện pháp được cân nhắc trong tình trạng bệnh nhân giảm tiểu cầu đe dọa tính mạng hay giảm tiểu cầu do chấn thương nhưng chống chỉ định trong một số trường hợp khác (xuất huyết giảm tiểu cầu) vì có thể tăng nguy cơ huyết khối động mạch và tử vong [60] Một số thuốc kích thích sản xuất tiểu cầu thế hệ mới đã được phát triển, tuy nhiên tác dụng phụ dài hạn của thuốc vẫn đang được xem xét, đánh giá [45] Việc tiếp cận các thuốc như vậy vẫn còn hạn chế đối với những bệnh nhân ở trong nước nên việc nghiên cứu, đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của những hoạt chất mới là vô cùng cần thiết

Theo kinh nghiệm dân gian, lá Đu đủ từ lâu đã được dùng như một vị thuốc cổ truyền điều trị các bệnh nhiễm ký sinh trùng, nhiễm khuẩn, giảm đau [1], [9], [29] Các nghiên cứu hiện đại đã chứng minh dịch chiết lá Đu đủ có tác dụng điều trị nhiễm virus Dengue hay tác dụng chống giảm tiều cầu trên một số động vật [67], [61], [14] Trong nghiên cứu trước đây về lá Đu đủ thu hái tại Việt Nam [13], cao chiết nước lá

Đu đủ ở liều 1600 mg/kg đã được chứng minh là có tác dụng tăng tiểu cầu trên mô hình chuột gây giảm tiểu cầu bằng cyclophosphamid Nghiên cứu này đã gợi mở tiềm năng ứng dụng lá Đu đủ Việt Nam trong điều trị chứng giảm tiểu cầu Tuy nhiên, do liều dùng còn quá cao và chưa tìm ra được thành phần hoạt chất thể hiện tác dụng chống giảm tiểu cầu nên còn hạn chế về mặt tiêu chuẩn hóa cao chiết và ứng dụng trong thực tiễn Một vài nghiên cứu cho thấy, nhiều hoạt chất trong lá Đu đủ đã được phân lập và tinh chế cao gồm các flavonoid, carpain [17], [57] song nghiên cứu chứng minh vai trò của các chất này đối với tác dụng tăng tiểu cầu của lá Đu đủ còn hạn chế

Vì vậy cần thiết đƣa ra những bằng chứng khoa học chứng minh thành phần hoạt chất

của lá Đu đủ có tác dụng chống giảm tiểu cầu Do đó, đề tài “Nghiên cứu tác dụng

chống suy giảm tiểu cầu của carpain và flavonoid từ lá Đu đủ trên mô hình gây suy giảm tiểu cầu bằng cyclophosphamid” đƣợc tiến hành với mục tiêu chung là làm

sáng tỏ thành phần hoạt chất có tác dụng chống giảm tiểu cầu của lá đu đủ

Mục tiêu cụ thể:

1 Đánh giá đƣợc tác dụng chống giảm tiểu cầu trên chuột của cao chiết toàn phần

và các cao chiết phân đoạn đƣợc tinh chế từ lá Đu đủ trên mô hình chuột gây giảm tiểu cầu bằng cyclophosphamid

2 Đánh giá đƣợc tác dụng chống giảm tiểu cầu trên chuột của carpain và cao giàu flavonoid từ lá Đu đủ đủ trên mô hình chuột gây giảm tiểu cầu bằng cyclophosphamid

Giảm tiểu cầu ở người được định nghĩa là tình trạng số lượng tiểu cầu trong máu thấp hơn 150000/µL [60] Tuy nhiên, triệu chứng chảy máu chỉ xuất hiện khi tiểu cầu giảm dưới 50000/µL, và khi tiểu cẩu nhỏ hơn 10000/µL, sự chảy máu có thể gây ảnh hưởng tới tính mạng người bệnh [27] Người giảm tiểu cầu có nguy cơ chảy máu tương tự như ở những bệnh nhân máu khó đông nhưng ở những người giảm tiều cầu, việc chảy máu chủ yếu từ những tiểu tĩnh mạch và mao mạch, còn trên bệnh nhân máu khó đông, chảy máu chủ yếu từ các mạch máu lớn hơn [27]

1.1.2 Chẩn đoán

Để chẩn đoán giảm tiểu cầu, bác sỹ cần kiểm tra tiền sử gia đình, tình trạng sức khỏe, công thức máu toàn phần và tiêu bản máu ngoại vi của người bệnh Sức khỏe tổng thể và thuốc dùng kèm của bệnh nhân có thể ảnh hưởng tới chẩn đoán phân biệt [37]

Hình 1.1 Quy trình chẩn đoán bệnh nhân giảm tiểu cầu [37]

Số lượng tiểu cầu < 150 000/mm3

Hemoglobin và số lượng bạch cầu

Xem xét tủy xương

Tiêu bản máu ngoại vi Tiểu cầu: Xác định lại trong natri

citrat hoặc heparin

Thiếu máu tan máu vi mạch (DIC,

TTP)

Xem xét:

Giảm tiểu cầu do thuốc

Giảm tiểu cầu do nhiễm trùng

Giảm tiểu cầu miễn dịch tự phát

Giảm tiểu cầu bẩm sinh

1.1.3 Nguyên nhân

Sự giảm tiểu cầu ở người thường do tủy xương giảm sản xuất tiểu cầu, tăng bắt giữ tiểu cầu ở lách (thường do lách to) hay tăng phá hủy tiểu cầu Cần chú ý hiện tượng giảm tiểu cầu giả do sự kết dính tiểu cầu thông qua các kháng thể hay do chất chống đông EDTA [37]

- Nguyên nhân giảm sản xuất tiểu cầu tại tủy xương có thể do bẩm sinh hoặc mắc phải Những tác nhân ức chế chức năng của tủy xương bao gồm u ác tính dòng tủy, tác nhân hóa học hay nhiễm trùng Để chẩn đoán giảm tiều cầu do tủy xương, cần đánh giá số lượng và hình thái của tế bào megakaryocytic Giảm tiểu cầu do di truyền thường hiếm gặp, nhưng cần cân nhắc chẩn đoán khi bệnh nhân có tiền sử gia đình liên quan đến giảm tiểu cầu, chảy máu kéo dài hay giảm tiểu cầu không thể giải thích được

1.1.4 Một số bệnh lý gây giảm tiểu cầu thường gặp

Rất nhiều bệnh lý có thể dẫn tới giảm tiểu cầu nhưng tại đây, ta xem xét một số bệnh lý thường gặp và điển hình như xuất huyết giảm tiểu cầu miễn dịch, giảm tiểu cầu do bệnh gan mạn và sốt xuất huyết Dengue

Xuất huyết giảm tiểu cầu miễn dịch:

Bệnh xuất huyết giảm tiểu cầu miễn dịch (Immune Thrombocytopenic Purpura - ITP) là tình trạng tiểu cầu trong máu ngoại vi bị phá huỷ ở hệ liên võng nội mô do sự

có mặt của tự kháng thể kháng tiểu cầu [2] Ở trẻ em, bệnh thường xảy ra cấp tính, rầm

rộ, thường là sau một nhiễm trùng Bệnh được đặc trưng bởi số lượng tiểu cẩu ở mức thấp tới rất thấp và tình trạng xuất huyết niêm mạc như xuất huyết niêm mạc miệng, đường tiêu hóa, kinh nguyệt kéo dài, xuất huyết võng mạc Tình trạng xuất huyết có thể đe dọa tính mạng người bệnh [37]

Căn nguyên của ITP chưa được biết đến rõ ràng, nhưng được cho là do các yếu

tố virus hoặc mắc phải Một số trường hợp ITP có liên quan tới nhiễm virus trước đó Sau đó, kháng thể kháng virus liên kết chéo với glycoprotein của tiểu cầu Nhiễm HIV, HCV, CMV và VZV có thể liên quan tới những kháng thể như vậy dẫn đến bệnh nhân mắc ITP thứ phát Những thay đổi trong phản ứng miễn dịch có thể làm mất khả năng dung nạp ngoại vi và thúc đẩy sự phát triển của các tự kháng thể, ví dụ như trong các bệnh hội chứng kháng phospholipid, lupus ban đỏ hệ thống, hội chứng evans, ITP sau ghép

tế bào tạo máu, bệnh bạch cầu lympho mạn tính và các rối loạn tăng sinh bạch huyết cấp thấp khác [20], [39], [21]

Bệnh được chẩn đoán qua các triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng như hội chứng thiếu máu, hội chứng xuất huyết, gan, lách, hạch ngoại vi không to, số lượng tiểu cầu giảm dưới 100 g/l, mật độ tế bào tủy bình thường hoặc có thể tăng, thời gian chảy máu kéo dài Kháng thể đặc hiệu kháng GPIIb-IIIa (hoặc GPIb) trên bề mặt tiểu cầu (hoặc trong huyết thanh) dương tính Hiện nay, chẩn đoán xuất huyết giảm tiểu cầu miễn dịch vẫn phải dựa trên chẩn đoán loại trừ các nguyên nhân gây giảm tiểu cầu khác [2]

Giảm tiểu cầu do thuốc (Drug-induced thrombocytopenia- DITP) là nguyên nhân phổ biến gây giảm tiểu cầu cấp qua trung gian miễn dịch ở người lớn Giảm tiểu cầu

do thuốc (bao gồm cả thức ăn, đồ uống, thảo dược) là một vấn đề lâm sàng quan trọng đối với các chuyên gia huyết học DITP thường xuất hiện đột ngột, thường trở nặng, gây chảy máu lớn và có nguy cơ tử vong ở người bệnh Ở nhiều bệnh nhân, giảm tiều cầu do thuốc không được chẩn đoán ngay từ lần đầu tiên Những bệnh nhân DITP không triệu chứng thời gian đầu, thường bị chẩn đoán nhầm thành ITP nguyên phát dẫn đến điều trị thất bại Ngay cả khi chẩn đoán DIPT được cân nhắc, tác nhân gây DITP cũng có thể không tìm được rõ ràng do bệnh nhân thường không nghĩ rằng

thuốc, thức ăn, đồ uống hay thực phẩm chức năng họ sử dụng có liên quan đến các triệu chứng xuất huyết của họ, và không thông báo với bác sỹ điều trị [25]

DITP là một phản ứng qua trung gian miễn dịch đặc trưng Các kháng thể liên quan tới thuốc là loại kháng thể bất thường, liên kết chặt chẽ với các epitop cụ thể trên glycoprotein của tiểu cầu khi có mặt của thuốc gây mẫn cảm [25] Những kháng thể này rất đặc hiệu với cấu trúc thuốc, chúng có nguồn gốc từ một nhóm các globulin miễn dịch tự nhiên, mà ở trong điều kiện bình thường, chúng không đủ ái lực để liên kết với glycoprotein trên màng tiểu cầu Có giả thuyết cho rằng, những thuốc gây giảm tiểu cầu đều có cấu trúc tích điện, hay kỵ nước cho phép chúng vừa có thể liên kết với kháng thể, vừa có thể liên kết với protein trên bề mặt tiểu cầu, tạo ra một sự liên kết chặt chẽ giữa kháng thể và các epitop của tiểu cầu Những kháng thể này thường xuất hiện sau khi phơi nhiễm thuốc từ 1 dến 2 tuần, cũng có khi chúng xuất hiện sau khi sử dụng không liên tục một loại thuốc trong một thời gian dài Chưa rõ lý do tại sao, tiểu cầu thường là mục tiêu của những kháng thể này hơn là bạch cầu trung tính hay hồng cầu Giảm tiểu cầu do thuốc thường trở nặng đột ngột và phục hồi nhanh chóng

Giảm tiểu cầu do bệnh gan mạn tính

Giảm tiểu cầu là biến chứng huyết học thường thấy ở bệnh nhân mắc các bệnh gan mạn tính, và được xác định khi số lượng tiểu cầu giảm dưới 15000/µL Tỷ lệ giảm tiểu cầu trên bệnh nhân viêm gan mạn tính chỉ khoảng 6 % nhưng lên tới 78 % trên các bệnh nhân xơ gan Nguy cơ giảm tiểu cầu trên các bệnh nhân xơ gan phải thực hiện thủ thuật là khá cao Tình trạng giảm tiểu cầu ảnh hưởng lớn tới việc điều trị bệnh Các hướng dẫn điều trị viêm gan C khuyến cáo, không sử dụng interferon trên bệnh nhân giảm tiểu cầu nặng hoặc phải ngừng điều trị nếu số lượng tiểu cầu <25000/µL [48] Giảm tiểu cầu trên bệnh gan mạn luôn liên quan đến tình trạng xơ gan ngoại trừ một số ít trường hợp nhiễm HCV Có nhiều cơ chế bệnh sinh giải thích cho việc giảm tiểu cầu, giảm mức độ hoạt động của các yếu tố kích thích tạo máu thrombopoietin (TPO), ung thư biểu mô gan, ức chế tủy xương do uống quá nhiều rượu, cường lách thứ phát do tăng áp lực tĩnh mạch cửa, kháng thể kháng tiểu cầu hay suy tủy do thuốc

ức chế virus viêm gan đều có thể góp phần vào sự phát triển giảm tiểu cầu ở bệnh gan mạn Nhưng, cơ chế chính gây giảm tiểu cầu trên bệnh nhân xơ gan là giảm sản xuất TPO ở gan và sự bắt giữ tiểu cầu ở lách Xơ gan được đặc trưng bởi mất chức năng tế bào gan, làm giảm đường kính của các mạch máu qua gan dẫn tới tăng áp lực tĩnh

mạch cửa, máu qua lách bị giữ lại lâu hơn, lượng tiểu cầu bị bắt giữ nhiều hơn, gây cường lách thứ phát và giảm tiểu cầu Thế tích lách có thể lên tới 1000 ml trong khi bình thường là 50 - 200 ml Cắt lách và thuyên tắc động mạch lách đã được sử dụng thành công để giảm thiểu tình trạng giảm tiểu cầu ở bệnh nhân cường lách, với một số báo cáo số lượng tiểu cầu tăng lên đáng kể nhưng chỉ là tạm thời Thuyên tắc động mạch lách có thể cải thiện tình trạng giảm tiểu cầu trên những bệnh nhân xơ gan do HCV kèm cường lách, do đó tạo điều kiện thuận lợi để điều trị bằng interferon Truyền tiểu cầu là phương pháp điều trị chính đối với bệnh nhân giảm tiểu cầu nặng, trải qua các thủ thuật xâm lấn Tuy nhiên, thời gian hiệu quả ngắn, nguy cơ phản ứng khi truyền và sự phát triển các kháng thể kháng tiểu cầu khiến phương pháp này cần cân nhắc thật kỹ trước khi thực hiện [48]

Sốt xuất huyết Dengue:

Sốt xuất huyết Dengue là bệnh truyền nhiễm do virus Dengue- virus phổ biến nhất lây truyền qua đường muỗi đốt gây nên Bệnh lưu hành ở hơn 100 quốc gia thuộc các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới, ước tính có khoảng năm mươi triệu ca mắc mỗi năm trên toàn cầu [35], [26]

Biểu hiện sốt trên bệnh nhân kéo dài khoảng 5 đến 7 ngày [54], [56] Kể từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 7, tiểu cầu bệnh nhân giảm dưới 100 g/l, lúc này có thể xuất hiện xuất huyết dưới da, xuất huyết niêm mạc và xuất huyết nội tạng [3]

Cơ chế giảm tiểu cầu trong sốt xuất huyết Dengue

Giảm tiểu cầu trong sốt xuất huyết Dengue thường theo hai cơ chế chính, giảm sản xuất tiểu cầu và tăng phá hủy tiểu cầu ở máu ngoại vi

Tủy xương giảm sản xuất tiểu cầu: trong vòng từ 2 đến 4 ngày kể từ khi nhiễm virus Dengue, tủy xương bị ức chế dẫn tới giảm sản xuất tiểu cầu Virus Dengue gây

ức chế quá trình sản sinh tiểu cầu trực tiếp bằng cách gây nhiễm và ức chế tế bào tiền thân tạo máu, hoặc gián tiếp thông qua ức chế tế bào đệm, là tế bào có chức năng biến đổi tính đặc hiệu của cytokin trong tủy xương DEN-4 lan truyền trong các tế bào tủy xương và thay đổi khả năng tăng sinh của chúng Ngoài ra, virus Dengue còn có thể xâm nhập vào tế bào đệm và gây ức chế quá trình tạo máu [30]

Tăng phá hủy tiểu cầu diễn ra theo nhiều cơ chế:

- Theo cơ chế tự miễn dịch, cơ thể sản xuất ra các tự kháng thể kháng lại virus Dengue phản ứng chéo với tiểu cầu và loại bỏ chúng [30]

- Sự tương tác giữa tiểu cầu - bạch cầu và tiểu cầu với tế bào nội mô: các kháng thể kháng virus phản ứng chéo và kích hoạt tế bào nội mô, ngoài ra các tế bào nội mô bị nhiễm virus cũng khiến chúng trong trạng thái kích hoạt, liên kết với tiểu cầu Đồng thời, tiểu cầu cũng kết tập với bạch cầu gây giảm tiểu cầu [30]

- Rối loạn chức năng tiểu cầu: kháng thể kháng tiểu cầu có tên là NS1 ức chế hoạt động của protein disulfid isomerase trên bề mặt tiểu cầu làm ức chết kết tập tiểu cầu [30]

- Tác động trực tiếp của virus Dengue: virus Dengue gây ra thay đổi hình thái của tiều cầu trong quá trình hoạt hóa, gây rối loạn chức năng tiểu cầu [30]

- Các hợp chất trung gian: các chất trung gian kích hoạt tiểu cầu và gây giảm tiểu cầu thường xuất hiện trong bệnh sốt xuất huyết Các sản phẩm phân hủy fibrin

và các phức hợp thrombin/antithrombin thường tăng sau sốt xuất huyết Yếu tố Von Willebrand cũng tăng lên, làm tăng hoạt hóa tiểu cầu Một loạt các

cytokin, như yếu tố hoại tử khối u (TNF-α) và interleukin-1β (IL-1β) cũng được

tạo ra trong quá trình nhiễm bệnh Các cytokin này có liên quan đến khởi phát

và điều hòa huyết khối, cầm máu Mức tăng TNF-α và IL-1β ở bệnh nhân sốt

xuất huyết có mối tương quan với giảm tiểu cầu [30]

1.2.1 Đặc điểm thực vật

Đu đủ có tên khoa học là Carica papaya, thuộc họ Đu đủ Papayaceae, có nguồn

gốc từ vùng nhiệt đới châu Mỹ, sau được phổ biến đi khắp nơi Tại Việt Nam, Đu đủ được trồng ở khắp nơi nhưng việc trồng cây trên quy mô lớn chưa được đặt ra Đu đủ được biết đến như một loại cây ăn quả trên khắp thể giới [1]

Đặc điểm hình thái: cây nhỏ hoặc nhỡ, cao từ 2 đến 4 mét, thân thẳng, không phân nhánh, mang nhiều nốt sẹo do cuống lá rụng để lại Lá to, mọc so le, tập trung ở ngọn, cuống lá rất dài, xẻ 5 - 7 thùy sâu, gốc hình tim, đầu nhọn, mỗi thùy lại chia tiếp thành những thùy nhỏ không đều, gân hình chân vịt, hai mặt nhẵn Hoa màu vàng lục nhạt, mọc ở kẽ lá, hoa đực và hoa cái cùng gốc hoặc khác gốc, cụm hoa đực dài, phân nhánh thùy xim Tràng 5 cánh hàn liền hình phễu, nhị xếp thành hai vòng trên ống tràng Cụm hoa cái có từ 2 đến 3 hoa, đài tràng hơi dính nhau ở gốc, không có nhị lép, bầu một ô, nhiều lá noãn Quả mọng, to, hình trứng ngược hoặc thuôn dài, khi chín màu vàng đỏ, hạt nhiều, màu đen [9]

1.2.2 Thành phần hóa học của cây Đu đủ

Trong vài thập kỷ qua, nghiên cứu về thành phần hóa học cũng nhƣ ứng dụng hoạt tính sinh học của Đu đủ ngày càng phát triển mạnh mẽ Alcaloid, phenol, flavonoid, tanin, glycosid là những hoạt chất đã đƣợc phân lập từ lá cây Đu đủ

Thành phần quan trọng của lá Đu đủ chính là các alcaloid, chúng ở dạng carpain, pseudocarpain, macrocyclic piperidin, hedydrocapain I và II, nicotin [68] Capain có

vi khuẩn lao trong một số thí nghiệm in vitro [17] Lá Đu đủ cũng chứa các acid

phenolic nhƣ acid protocatechuic, acid coumaric, acid caffeic, acid chlorogenic và coumarin là những chất chứa đặc tính chống oxy hóa [18], [66], [68]

Hình 1.2 Một số acid phenolic có trong lá Đu đủ

1: acid protocatechuic, 2: acid coumaric, 3: acid caffeic, 4: acid chlorogenic

Một nghiên cứu về hợp chất caroten trong một số thực vật ở Việt Nam năm 2006

tại khoa sinh học, đại học KHTN-DHQGHN cho thấy, quả Đu đủ có hàm lƣợng

β-caroten cao nhất trong 30 mẫu nghiên cứu Carotenoit là một nhóm các hợp chất thực vật thứ sinh phân bố phổ biến trong giới thực vật Chúng đƣợc biết đến nhƣ là các hợp chất có khả năng chống oxi hóa, do đó có thể có chức năng trong phòng chống các bệnh lão hóa Chính vì thế mà ngày nay các nhà khoa học đang rất quan tâm đến khả năng đƣa các chất này ứng dụng trong điều trị bệnh [10]

1.2.3 Carpain trong lá Đu đủ

Cấu trúc phân tử của carpain:

Carpain là alcaloid chính của cây Đu đủ, có nhiều trong lá cây và hạt cây Carpain trong Đu đủ được phân lập lần đầu tiên vào năm 1890 bởi Greshoff, kể từ đó cấu trúc hóa học của carpain được chú ý nhiều trong nghiên cứu Tuy nhiên, tính chất dược lý của nó vẫn chưa được quan tâm nhiều Sau khoảng 75 năm, cấu trúc hóa học của carpain được tìm ra, chúng là amin bậc 2, bao gồm 2 vòng piperidin giống nhau được liên kết với nhau bằng 2 nhóm ester, đồng phân quang học dạng dextran Cấu hình tuyệt đối của carpain đã được kết luận bởi nghiên cứu gần đây của Coke và Rice tại Đại học Bắc Caronila dưới sự tài trợ của Viện tim mạch quốc gia của Dịch vụ y tế

công cộng Hoa Kỳ [17]

Ngay sau khi phân lập được carpain, Merck và cộng sự đã đưa ra được công thức của

ngày nay vẫn xuất hiện trên hầu hết các văn bản và sách tham khảo mới nhất Trong nhiều năm liền, một số phương pháp phân lập và tinh chế carpain đã được công bố [17]

Carpain có trong lá Đu đủ với nồng độ cao tới 0,4 %, đủ để cung cấp trên thị trường với giá cả hợp lý Trong quá trình tìm hiểu cấu trúc hóa học của carpain, một số dẫn xuất của nó cũng được biết đến như methyl carpain, ethyl carpain, carpain chloroaurat, nitro-carpain Carpain tinh khiết hòa tan rất ít trong nước nhưng dẫn xuất hydrochlorid của nó thì rất dễ tan Carpain tan trong các dung môi alcaloid thông thường, nóng chảy ở 121 °C [17]

Tác dụng dược lý của carpain:

Trong quá trình nghiên cứu tính chất dược lý của carpain trong lá Đu đủ, ban đầu carpain được cho là giống digitalis và emetin nhưng nó lại không có hầu hết những tác dụng phụ giống như hai chất này Vì vậy, carpain được sử dụng như một chất kích thích tim và lợi tiểu mặc dù chúng không có mối liên quan hóa học với digitalis và emetin Tiến sỹ Noble đã chỉ ra rằng liều 20 mg carpain mỗi ngày có hiệu quả như liều chuẩn của digitalis Người Nhật đã có báo cáo carpain như một chất diệt khuẩn tốt dùng trong bệnh kiết lỵ Ramsawamy và Sirsi đã kết luận được carpain có thể ức chế

rằng carpain có tác dụng kích thích thích sản sinh tiểu thông qua tác dụng của cao chiết phân đoạn carpain thô và carpain tinh khiết Nghiên cứu còn kết luận rằng,

carpain tinh khiết có tác dụng chống giảm tiểu cầu vượt trội so với các cao chiết

carpain thô [67]

Phân lập và tinh chế carpain:

Ở Việt Nam, Phan Thành Nhân và cộng sự (2020) đã chiết tách thành công carpain từ cao chiết cồn lá Đu đủ bằng phương pháp sắc ký cột chân không Từ 8 kg bột lá Đu đủ, tiến hành chiết cao toàn phần bằng phương pháp ngấm kiệt với ethanol

70 %, thay đổi pH và lắc phân bố với các dung môi n-hexan, cloroform thu được các cao phân đoạn Tiến hành chấm SKLM để kiểm tra alcaloid có trong 2 phân đoạn chiết này, phân đoạn nào có chứa nhiều alcaloid hơn thì tiến hành phân lập Sau đó, tách các alcaloid từ cao chiết toàn phần bằng sắc ký cột chân không Dụng cụ là cột sắc ký có kích thước 4,5x50 cm với lưới thủy tinh xốp, bình erlen hút chân không thể tích 2 lít, ống nghiệm 200 ml, lọ thủy tinh đựng các phân đoạn, máy cô quay thu hồi dung môi

Sử dụng silica gel kích thước 40-63 µm nạp vào cột theo phương pháp cột khô, ổn định bằng dung môi nền dưới áp suất âm, lượng silica gel gấp 10 lần mẫu Mẫu được trộn với 1 lượng vừa phải silica gel, nghiền mịn và sấy ở 40-50 °C đến khô Khai triển cột đến khô nhờ áp suất hút, mỗi lần 100 ml pha động Các phân đoạn đơn giản được loại hết dung môi, hòa cắn trong dung môi thích hợp để loại các bớt tạp Sau đó kết tinh alcaloid trong các dung môi thích hợp Lọc và rửa tinh thể qua phễu thủy tinh xốp bằng dung môi lạnh cùng loại Kiểm tra độ tinh khiết trên SKLM [11]

Kết quả thu được 200 mg hợp chất CP1 được phân lập từ 8 kg lá Đu đủ Sau khi tách và tinh chế bằng sắc ký, cấu trúc hợp chất CP1 đã được xác định CP1 là carpain – một alcaloid chính trong lá Đu đủ với hoạt tính sinh học quan trọng Thử hoạt tính kháng khuẩn cho thấy kết quả kháng khuẩn tốt của cả cao alcaloid toàn phần và alcaloid chính Carpain được xác định là có hoạt tính kháng khuẩn đối với các vi khuẩn gây bệnh thường gặp Qua quá trình nghiên cứu phân lập alcaloid carpain từ lá

Đu đủ, khảo sát các điều kiện chiết tách, kết luận ethanol 70 % là điều kiện chiết carpain tối ưu Sử dụng phương pháp sắc ký cột chân không và dung môi thích hợp để phân lập và tinh chế carpain [11]

1.2.3 Flavonoid trong lá Đu đủ

Cấu trúc phân tử của flavonoid:

Flavonoid là những hợp chất có cấu trúc polyphenol, được đặc trưng bởi nhân flavan, tìm thấy phổ biến trong các loài thực vật Cấu trúc cơ bản của các flavonoid

bao gồm 3 vòng phenolic, vòng A gắn liền với vòng C, vòng B giống như một vị trí thế Các nhóm flavonoid khác nhau ở mức độ oxy hóa và các nhóm thế trên vòng C Các flavonoid riêng lẻ trong mỗi nhóm lại khác nhau ở số lượng và loại nhóm thế ở hai vòng A, B Ở thực vật, flavonoid được tổng hợp thông qua con đường phenylpropanoid, bắt nguồn từ phenylalanin Tùy thuộc vào loài thực vật và các nhóm enzym khác nhau sẽ tạo ra các flavonoid khác nhau Flavonoid nhìn chung được chia thành hai nhóm, 2-phenylchroman (bao gồm flavonol, các flavon, các flavanon, các flavan-3-ol, các antocyanidin và các tannin ngưng tụ) và 3-phenylchroman (các isoflavonoid) Các chalcon mặc dù có cấu trúc tương tự nhưng không phải là flavonoid thực sự Các flavonoid được biết đến là chất oxy hóa mạnh và có khả năng dọn dẹp

đến là những chất chống oxy hóa mạnh có tác động tích cực chống lại các bệnh như

các bệnh thoái hóa thần kinh, bệnh tim mạch [24]

Hình 1.4 Cấu trúc cơ bản của các flavonoid

Nhiều flavonoid đã được xác định trong lá Đu đủ bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép phổ khối (HPLC-ICP-MS) Afzan và cộng sự đã xác định được

bốn flavonoid trong lá Đu đủ bao gồm quercetin3-(2G-rhamnosylrutinosid), kaempferol 3-(2G-rhamnosylrutinosid), quercetin 3-rutinosid, và kaempferol 3- rutinosid Nguyen và cộng sự đã dự kiến xác định được kaempferol β-D- glucopyranosid, luteolin β-D-glucopyranosid, myricetin 3-rhamnosid, quercetin and

rutin Tan và cộng sự thì tìm thấy apigenin, kaempferol, quercetin, myricetin isorhamnetin, catechin, hesperitin và naringenin Sử dụng HPLC, Andarwulan và cộng

sự đã tìm ra được quercetin, kaempferol và apigenin [44]

Tác dụng dược lý của flavonoid:

Trong những năm gần gây, cộng đồng khoa học tập trung vào nghiên cứu vai trò sinh học của flavonoid do các bằng chứng đến từ các nghiên cứu dịch tễ học lớn cho thấy chế độ ăn giàu thức ăn chứa flavonoids có liên quan tới việc giảm nguy cơ mắc

các bệnh mạn tính Các hoạt động của flavonoid trong các thí nghiệm in vitro liên

quan đến việc ức chế sự tổng hợp và hoạt động của các chất gây viêm khác nhau như eicosanoids, cytokin, các phân tử kết dính và protein phản ứng C Các hoạt động phân

tử của flavonoid bao gồm ức chế các yếu tố phiên mã như NF-kB và hoạt hóa

protein-1 (AP-protein-1) Tuy nhiên, các bằng chứng in vitro có những điểm hạn chế như nồng độ

flavonoid được sử dụng là phi sinh lý hay sự chuyển hóa flavonoid trong cơ thể thành

vô số những hợp chất khác nhau Các nghiên cứu trên người điều tra hiệu quả chống viêm của flavonoid còn thiếu, và chủ yếu tập trung vào thực phẩm chứa flavonoid nhưng không tập trung vào các chế phẩm giàu flavonoid hay flavonoid tinh khiết Một vài nghiên cứu đánh giá sự ảnh hưởng của chế độ ăn giàu flavonoids đến nồng độ các cytokin trong cơ thế có kết quả mâu thuẫn nhau và vần còn nhiều tranh cãi Các thực phẩm giàu flavonoids được sử dụng như rượu vang đỏ, ca cao hay đậu nành Hiện nay, nhiều nghiên cứu về tác dụng chống viêm của flavonoid vẫn đang được thực hiện [49], [58]

Tại Việt Nam, năm 1999, Nguyễn Quốc Khang và Hà Thị Thanh Bình đã nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của flavonoid chiết từ lá Đu đủ Các tác giả thí nghiệm với

5 chủng vi khuẩn và 2 chủng nấm gây bệnh Nồng độ flavonoid trong thí nghiệm là 0,4 mg/ml Kết quả, flavonoid trong lá Đu đủ thể hiện hoạt tính kháng khuẩn tốt đối với

các chủng vi khuẩn và nấm thử nghiệm bao gồm: Escherichia coli, Staphylococcus

aureus, Bacillus subtilis, Salmonella typhi T239, Salmonella typhi T241, Candida albicans, Candida stellaloides [8]

Flavonoid đã được chứng minh có một số tác dụng chống thoái hóa thần kinh Tuy nhiên, tác dụng có lợi của flavonoid trên hệ tim mạch được nghiên cứu rộng rãi nhất do ảnh hưởng của chúng lên chuyển hóa lipid, giảm khả năng gây kết dính tế bào, tăng cường chức năng của nội mô và mạch máu [24], [28], [32] Hơn nữa, có nhiều bằng chứng cho thấy flavonoid cũng có tác dụng ức chế kết tập tiểu cầu Nhiều cơ chế cho tác dụng này đã được đưa ra như thông qua ức chế phospholipase A2, phosphodiesterases nhưng cơ chế cơ bản, phổ biến với nhiều hợp chất flavonoids là ức

chế kết tập tiểu cầu thông qua con đường acid arachidonic [24], [40], [41]

Flavonoid quercetin được cho rằng có năng lượng liên kết cao nhất với protein NS2B-NS3 (một phức hợp protein không cấu trúc có vai trò rất quan trọng trong việc nhân lên của virus Dengue-2) được thể hiện rõ bằng việc hình thành 6 liên kết hydro với gốc aminoacid tại vị trí liên kết của receptor Điều này gợi ý tác dụng dược lý của flavonoid quercetin, mở ra nhiều hướng nghiên cứu mới với hoạt chất này [57]

Phân lập flavonoid:

Không có một phương pháp chung nào để chiết xuất các flavonoid vì chúng rất khác nhau về độ tan trong nước và trong các dung môi hữu cơ Các flavonoid glycosid thường dễ tan trong các dung môi phân cực, các flavonoid aglycon dễ tan trong dung

trong dung dịch kiềm loãng, có thể dựa vào tính chất này để chiết chúng Ví dụ để

flavonoid ra khỏi nguyên liệu, sau đó acid hoá bằng HCl để kết tủa lại rutin Để phân lập từng chất flavonoid người ta áp dụng phương pháp sắc ký cột Muốn có đơn chất tinh khiết thì cần phải sắc ký cột lại vài lần hoặc sắc ký chế hoá [44] Tại Việt Nam, flavonoid đã được phân lập từ nhiều loại thực vật Nguyễn Việt Cường và cộng sự đã tiến hành chiết flavonoid từ cây Bìm ba răng, dung môi chiết là cồn 58,2 %, có hỗ trợ bằng sóng siêu âm, sau đó định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao [5]

1.2.4 Tác dụng dược lý của cây Đu đủ

Tác dụng chữa bệnh của quả Đu đủ cũng như các bộ phận khác của cây được biết đến nhiều trong y học cổ truyền Các bộ phận của cây có tác dụng dược lý khác nhau Dịch chiết lá Đu đủ 20 % với dumg môi nước và cồn có thể kháng khuẩn với

Staphylococus aureus và Escherichia coli [62] Cao lá Đu đủ có tác dụng kháng khuẩn

tốt với Typhimurium mentagrophytes, T.rubrum, và Staphylococus aureus Cao chiết

từ vỏ quả và hạt có tác dụng kháng khuẩn với Staphylococus aureus, Bacillus cereus,

Escherichia coli, Pseudomonas eruginosa, Shigella flexneri Benzyl isothyocyanat là

aglycol của glycotropacolin phân lập từ Đu đủ, ức chế sự sinh sôi của nhiều vi khuẩn

gram âm và gram dương như E.Coli, Penicillium notatum và Shigella [17]

Bột lá Đu đủ có tác dụng làm giảm triệu chứng và loại bỏ giun trên chuột lang

sau 3 ngày cho uống [52] Chúng có tác dụng với Toxocara transfuga, Ascaridia

lumbricoides…Hoạt tính diệt giun của Đu đủ chủ yếu do benzyl isothyocyanat, đã

chứng minh được cơ chế tác dụng của benzyl isothyocyanat là do ức chế chuyển hóa

năng lượng và tác động đến hoạt tính chuyển động của ký sinh trùng in vitro [17]

Nhóm chất phenolic chiết tách được từ lá Đu đủ (5,7-dimethoxy coumarin, acid

protocatechui, acid p-coumaric, acid caffeic, kaempferol, quercetin) có tác dụng ức chế

sự tăng sinh tế bào, tăng cường chức năng miễn dịch, ức chế enzym pha I và II trong chu kỳ phân bào, ức chế sự kết dính tế bào và xâm lấn, cảm ứng quá trình tự chết, ức chế sự truyền tín hiệu, ngăn chặn sự hình thành mạch máu trong khối u [42]

Dịch chiết lá Đu đủ với dung môi chiết (n-hexan, ethyl acetat, ethanol) đã được

chứng minh có tác dụng giảm đau trên chuột được gây đau bằng mô hình acid acetic (phương pháp Siegmund) ở cả ba mức liều 0,175; 0,35; 0,7 mg/kg TT đường uống so

[29]

Soobitha Subenthiran và cộng sự (2013) đã chỉ ra rằng dịch chiết lá Đu đủ có tác dụng làm tăng tiểu cầu trên bệnh nhân sốt xuất huyết [61] Hỗn dịch lá Đu đủ Carica trong dầu cọ được sử dụng để điều trị sốt xuất huyết ở chuột bạch tạng Thụy Sĩ và quan sát thấy sự gia tăng số lượng tiểu cầu trong máu [59] Bên cạnh đó, việc tăng số lượng tiểu cầu trên bệnh nhân bị sốt xuất huyết sau khi uống dịch chiết lá Đu đủ đã được ghi nhận trong một số nghiên cứu [59], [65] Kết quả cũng tương tự trong một nghiên cứu của Soobitha Subenthiran và cộng sự (2013) thực hiện trên 228 bệnh nhân sốt xuất huyết Dengue Các phân tích biểu hiện gen cũng đã được thực hiện bởi cùng nhóm trên gen ALOX 12 và PTAFR, kết quả cho thấy, nhóm sử dụng dịch chiết lá Đu

đủ có biểu hiện gen cao hơn nhóm còn lại [61] Tuy nhiên, thông tin về hoạt chất, nhóm hoạt chất có hoạt tính làm tăng số lượng tiểu cầu trong lá Đu đủ thì vẫn chưa được biết đến

Hiện nay, một số nhóm mô hình đã được sử dụng để mô phỏng các cơ chế bệnh sinh khác nhau của rối loạn giảm tiểu cầu trên động vật thí nghiệm, bao gồm gây giảm tiểu cầu bằng hóa trị liệu, dùng kháng thể kháng tiểu cầu, gây nhiễm virus Dengue trên động vật và một số mô hình khác

1.3.1 Gây giảm tiểu cầu bằng hóa trị liệu

Các hợp chất hóa trị liệu có đặc điểm chung là ức chế tủy xương sản xuất các tế bào máu qua đó ức chế sản xuất tiểu cầu Tuy nhiên, các hóa trị liệu thường gây gảm

tiểu cầu kéo dài, tạo ra độc tính quá mức, có thể gây chết động vật thí nghiệm Vì vậy, cần lựa chọn tác nhân hóa trị liệu và phương pháp phù hợp Một số tác nhân hóa trị liệu được dùng dưới đây

Mô hình gây giảm tiểu cầu bằng cyclophosphamid

Hiện nay, một số mô hình đã được sử dụng để mô phỏng các cơ chế bệnh sinh khác nhau của rối loạn giảm tiểu cầu trên động vật thí nghiệm, bao gồm gây giảm tiểu cầu bằng hóa trị liệu, dùng kháng thể kháng tiểu cầu, gây nhiễm virus Dengue trên động vật và một số mô hình khác

Cyclophosphamid là một tác nhân alkyl hoá có tác dụng chống ung thư và ức chế miễn dịch, thuộc nhóm oxazaphosphorin Cyclophosphamid là một tiền chất, chỉ tác dụng khi vào trong cơ thể, được chuyển hoá ở gan bởi hệ thống các cytochrom 450 thành các chất chuyển hoá có hoạt tính là aldophosphamid và phosphoramid Hai chất này liên kết với ADN, ức chế sự sao chép ADN và khởi đầu chu trình chết của tế bào Cyclophosphamid hoạt động như một tác nhân alkyl hóa protein và ADN, không phụ thuộc vào chu kỳ tế bào, có hoạt tính chống ung thư, là hóa trị liệu phổ biến kết hợp với các hoạt chất khác để điều trị u lympho ác tính, bệnh bạch cầu, u nguyên bào thần kinh, u nguyên bào võng mạc, ung thư vú, buồng trứng, nội mạc tử cung, phổi Cyclophosphamid ức chế chung sự phân chia của tất cả các tế bào đang tăng sinh, đặc biệt là các tế bào tủy xương dẫn đến giảm bạch cầu, giảm tiểu cầu và thiếu máu Mức

độ gây giảm tiểu cầu của cyclophosphamid phụ thuộc vào liều [4], [43]

Trên thực nghiệm, người ta thường sử dụng cyclophosphamid làm tác nhân giảm tiểu cầu trên chuột Đa phần trong các thí nghiệm, cyclophosphamid đều được dùng theo đường tiêm, có liều nạp hay không có liều nạp Trong một thử nghiệm mô hình giảm tiểu cầu bằng cyclophosphamid, NIE Hong và cộng sự (2009) sử dụng cyclophosphamid với liều nạp 200 mg/kg TT và liều suy trì 30 mg/kg TT trong 6 ngày thì nhận thấy có tới 60 % chuột chết trong thời gian thí nghiệm Cùng nghiên cứu đó, nhóm khác được dùng cyclophosphamid với liều 150 mg/kg TT trong 3 ngày thì không ghi nhận chuột chết, và lượng tiểu cầu giảm từ 33 % đến 11 % lần lượt vào ngày thứ 7 và ngày thứ 11 [43] Tương tự, Tansena Akhter (2014) so sánh hiệu quả của dịch chiết lá Đu đủ với corticoid trong điều trị giảm tiểu cầu cũng sử dụng cyclophosphamid với liều 100 mg/kg TT trong 3 ngày mà không ghi nhận chuột chết,

và cũng ghi nhận số lượng tiểu cầu bắt đầu giảm từ ngày thứ 4, xuống thấp nhất vào

ngày thứ 11 [14] Tại một nghiên cứu củaNur Atik (2018) , cyclophosphomid được sử dụng với mức liều nhỏ hơn là 25 mg/kg TT trong 3 ngày liên tiếp, cũng ghi nhận số lượng tiểu cầu giảm từ ngày 4 đến ngày thứ 11 [16]

Một nghiên cứu tại Việt Nam đã tiến hành thăm dò đáp ứng giảm tiểu cầu gây ra bởi cyclophosphamid với các mức liều khác nhau, bao gồm 12,5 mg/kg TT, 25 mg/kg

TT, 50 mg/kg TT và 100 mg/kg TT, tiêm dưới da trong 3 ngày liên tiếp, nhằm lựa chọn được mức liều phù hợp để áp dụng đánh giá tác dụng của thuốc Kết quả cho thấy

cả 4 mức liều CPA nói trên đều gây giảm tiểu cầu rõ rệt vào ngày thứ 7 với tỷ lệ giảm

bằng cyclophosphomid với nhiều mức liều khác nhau giúp xác định được mức liều tối

ưu, giảm độc tính và tỷ lệ tử vong trên động vật thí nghiệm

Gây giảm tiều cầu bằng busulfan

Busulfan là một tác nhân alkyl hóa, có tác dụng ngăn cản sự sao chép ADN và phiên mã ARN, nên làm rối loạn chức năng của acid nucleic, và có tác dụng không đặc hiệu đến các pha của chu kỳ phân chia tế bào Busulfan có 2 nhóm methansulfonat không bền, đính vào các đầu đối diện nhau của mạch alkyl có 4 carbon Trong nước, busulfan bị thủy phân, giải phóng ra các nhóm methansulfonat, và sản sinh ra các ion carbon hoạt động, có khả năng alkyl hóa ADN, nên gây độc tế bào Busulfan có hoạt tính ức chế miễn dịch yếu Busulfan có tác dụng ức chế chọn lọc đến tủy xương Với liều thấp, thuốc ức chế quá trình tạo bạch cầu hạt, và ở một mức độ ít hơn ức chế cả quá trình tạo tiểu cầu; nhưng rất ít tác dụng đến tế bào lympho Với liều cao hơn, thuốc

ức chế tủy xương mạnh và có thể không hồi phục [4]

Tại một số thí nghiệm, busulfan được dùng cho mô hình giảm tiều cầu ở cừu bằng

tiên và ngày thứ 3 Cừu được lấy 2 đến 3 đơn vị máu một ngày trong 2 đến 3 ngày và sau đó chết (không rõ thời điểm chết của cừu) [69] Một thí nghiệm khác đánh giá hiệu quả tăng tiểu cầu của capain trong lá đu đủ trên chuột, busulfan cũng được sử dụng trong mô hình gây giảm tiểu cầu với liều 5mg/kg tiêm dưới da vào ngày 1, 5, 10 và ngày 15 Mức liều này được coi là phù hợp vì không gây ra độc tính quá mức dẫn tới chết chuột và lượng tiểu cầu giảm đáng kể so với nhóm chứng cụ thể lượng tiểu cầu

hình giảm tiểu cầu trên thỏ dùng busulfan với nồng độ 25mg/kg TT tiêm bụng vào

ngày đầu tiên và ngày thứ 3 Sau đó không phát hiện các biến chứng nào trên thỏ [70].

1.3.2 Giảm tiểu cầu qua kháng thể kháng tiểu cầu

Mô hình giảm tiểu cầu qua kháng thể kháng tiểu cầu hay còn gọi là mô hình giảm tiểu cầu miễn dịch thụ động, trong đó, huyết thanh kháng tiểu cầu hay các kháng thể đơn dòng đặc hiệu với tiểu cầu được tiêm vào vật chủ, khiến chúng bị giảm tiểu cầu Hàng loạt các mô hình này được sử dụng từ những năm 1950 để nghiên cứu các khía cạnh liên quan tới chức năng tiểu cầu, các bệnh lý giảm tiểu cầu hoặc các tương tác dược lý Người ta đã sử dụng mô hình này trên hàng loạt các loài động vật như chuột, thỏ, lợn, cừu, ngựa [71] Vào năm 1960, Rossolini đã kiểm tra hiệu quả của cortisone trong việc điều trị giảm tiểu cầu ở lợn bằng mô hình giảm tiểu cầu miễn dịch thụ động này Những nghiên cứu như vậy đã tìm ra nhiều kiến thức liên quan đến giảm tiểu cầu miễn dịch mà hiện nay vẫn ứng dụng trong y học Vào những năm 1980, các kháng thể đơn dòng kháng tiểu cầu ở người đầu tiên được phát triển và theo sau đó là sự phát triển các kháng thể đơn dòng kháng tiểu cầu ở bò, chó, chuột cũng phát triển theo Điều này dẫn tới việc sử dụng kháng thể kháng tiểu cầu trong các mô hình giảm tiểu

cầu đầu tiên được gọi là MReg30 và kháng thể này là kháng thể đơn dòng đầu tiên được sử dụng để gây giảm tiểu cầu miễn dịch thụ động ở chuột [72] Sau đó, MReg30

và một số kháng thể kháng tiểu cầu đơn dòng khác đã được sử dụng rộng rãi để gây giảm tiểu cầu miễn dịch thụ động [71]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguyên liệu

Lá Đu đủ được thu hái tại Cần Thơ Dược liệu được định danh bởi Thạc sĩ Cao Ngọc Giang, Trung tâm Sâm và Dược liệu Thành Phố Hồ Chí Minh, Viện Dược liệu Mẫu nghiên cứu được lưu trữ tại khoa Hóa Thực Vật, Viện Dược liệu Các mẫu thử bao gồm cao chiết toàn phần, cao chiết phân đoạn, carpain đã tinh chế và cao giàu flavonoid từ lá Đu đủ được chuẩn bị tại Khoa Hóa Thực Vật, Viện Dược liệu Các mẫu nghiên cứu được định lượng hàm lượng carpain và flavonoid (bảng 2.1)

(%)

Hàm lượng flavonoid (Q+K sau thủy phân

%)

Bảng 2 1 Thành phần carpain và flavonoid của một số mẫu nghiên cứu

Cách chuẩn bị các cao chiết này như sau:

Cao chiết toàn phần:

100,0 g dược liệu lá Đu đủ kích thước 0,5 - 1 cm chiết hồi lưu bằng ethanol 70

%, chiết 3 lần với thời gian chiết lần lượt là 2,5h; 2h; 1,5h và tỷ lệ dung môi/dược liệu (thể tích/khối lượng; ml/g) tương ứng là 10:1; 8:1; 8:1 (10/8/8) Dịch chiết 3 lần sau khi lọc được gộp chung và đem cất loại dung môi dưới áp suất giảm và cô cách thủy thu được 27,5 g cao (hiệu suất 27,5 %) Cao chiết có độ ẩm 4,7 %, hàm lượng flavonoid tổng số sau thủy phân tính theo quercetin và kaempferol là 0,38 %, hàm lượng carpain 0,17 %

Cao chiết phân đoạn:

3 kg lá Đu đủ kích thước 0,5 - 1 cm được chiết hồi lưu với ethanol 70 %, chiết 3 lần với thời gian chiết lần lượt là 2,5h; 2h; 1,5h và tỷ lệ dung môi/dược liệu (thể

tích/khối lượng; ml/g) tương ứng là 10:1; 8:1; 8:1 Dịch chiết ba lần sau khi lọc được

đến khi còn 3 lít dịch Dịch chiết cô đặc được đưa lên phễu chiết lỏng lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần là dichloromethan (DCM), n-butanol và nước Cô cạn dung môi dưới áp suất giảm và trên bếp cách thủy, sấy trong tủ sấy chân không được lần lượt các cao dichloromethan (62 g, hiệu suất 2,1 %) và cao n-BuOH (56 g, 1,87 %) Cao chiết dichloromethan có độ ẩm 5 % hàm lượng carpain 3,3 % Cao chiết n-BuOH có độ ẩm 4,3 %, hàm lượng carparin 1,12 %, hàm lượng flavonoid tổng số sau thủy phân tính theo quercetin và keampferol là 2,28 %

Cao giàu flavonoid từ cao phân đoạn n-butanol

Cao chiết n-BuOH thu được từ quá trình chiết phân đoạn cao chiết ethanol 70 %

lá Đu đủ được tinh chế để thu phân đoạn giàu flavonoid Quá trình tinh chế được thực hiện như sau: 30 g cao chiết n-BuOH được phân tán trong 100 ml nước, lọc loại bỏ phần không tan qua giấy lọc Phần dịch được đưa lên cột D101 (500 g) rửa giải lần

flavonoid tập chung chủ yếu ở phân đoạn ethanol 30 % Các phân đoạn giàu flavonoid được gộp lại, cô cạn, sấy khô thu được 7,3 g Phân đoạn giàu flavonoid từ cột D101 được hòa tan hoàn toàn trong MeOH đưa lên cột sephadex LH 20, rửa giải với MeOH, thu vào các ống nghiệm 10 ml, kiểm tra bằng TLC và HPLC để thu các ống chứa flavonoid Gộp các ống giàu flavonoid trên HPLC thu được 1,8 g phân đoạn giàu flavonoid từ lá Đu đủ (hàm lượng flavonoid tổng số sau thủy phân tính theo quercetin

và keampferol là 11,79 %)

Carpain được tinh chế từ cao phân đoạn DCM:

Carpain đã tinh chế từ lá Đu đủ: carpain được tinh chế bởi khoa Hóa Thực Vật, Viện Dược liệu, có độ tinh khiết > 95 %

Chuẩn bị mẫu thử:

Pha dung dịch thử: phân tán cao trong nước cất đến những nồng độ thích hợp

để sử dụng cho động vật uống Liều dùng được biểu diễn theo khối lượng cao khô tuyệt đối Riêng carpain tinh khiết ở dưới dạng tinh thể, khó phân tán trong nước nên cần thêm 1 - 2 giọt tween trong quá trình phân tán