Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu
Triển khai mô hình giảm tiểu cầu trên chuột bằng CPA
Đánh giá tác dụng chống
giảm tiểu
cầu của cao
chiết toàn phần lá đu đủ trên mô hình gây giảm tiểu cầu bằng CPA Đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu
của các cao
chiết phân
đoạn lá đu
đủ trên mô
hình gây
giảm tiểu cầu bằng CPA Đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của carpain tinh khiết từ lá đu đủ trên mô hình gây giảm tiểu cầu bằng CPA Đánh giá tác dụng chống giảm tiểu
cầu của cao
giàu flavonoid từ lá đu đủ trên mô hình gây giảm tiểu cầu bằng CPA
23
Các nghiên cứu trƣớc đây cho thấy, độc tính và mức độ giảm tiểu cầu trên chuột do CPA gây nên phụ thuộc vào liều và thời gian sử dụng. Nghiên cứu của Nur Atik (2018) sử dụng mức liều CPA là 25 mg/kg TT trong ba ngày và ghi nhân đƣợc sự giảm tiểu cầu đáng kể từ ngày 4 đến ngày 11, đặc biệt không ghi nhận chuột chết [16]. Phạm Đức Vịnh và cộng sự (2018) cũng tiến hành thăm dò đáp ứng giảm tiểu cầu gây ra bởi CPA với các mức liều 12,5 mg/kg TT, 25 mg/kg TT, 50 mg/kg TT và 100 mg/kg TT, tiêm dƣới da trong 3 ngày liên tiếp và thu đƣợc kết quả số lƣợng tiểu cầu giảm trên 90 % khi dùng CPA với liều 50 và 100 mg/kg TT, khoảng 86 % với liều 25 mg/kg TT và khoảng gần 50 % với mức liều 12,5 mg/kg TT, tuy nhiên mức liều 50 mg/kg TT và 100 mg/kg TT thể hiện độc tính đáng kể trên chuột [13]. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn mức liều CPA là 30 mg/kg TT, tiêm dƣới da hai ngày liên tiếp để gây giảm tiểu cầu khoảng 80 % (phù hợp với mức giảm tiểu cầu bệnh lý) trên chuột cho các thí nghiệm trên.
Nghiên cứu đƣợc thiết kế làm 4 đợt thí nghiệm, lần lƣợt đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của cao chiết toàn phần lá Đu đủ, các cao chiết phân đoạn lá Đu đủ, carpain và cao giàu flavonoid của lá Đu đủ trên mô hình gây giảm tiểu cầu ở chuột bằng CPA.
-Đợt 1: đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của cao chiết toàn phần lá Đu đủ
với 2 mức liều 400 mg/kg TT và 800 mg/kg TT trên chuột đã đƣợc gây giảm tiểu cầu bằng CPA.
-Đợt 2: đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của các cao chiết phân đoạn
nƣớc, n-butanol, DCM từ lá Đu đủ trên chuột đã đƣợc gây giảm tiểu cầu bằng CPA.
-Đợt 3: đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của carpain đƣợc tinh chế từ cao
chiết phân đoạn DCM trên chuột đã đƣợc gây giảm tiểu cầu bằng CPA.
-Đợt 4: đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của cao chiết giàu flavonoid
đƣợc tinh chế từ cao chiết n-butanol trên chuột đã đƣợc gây giảm tiểu cầu bằng CPA.
Đợt 1:
Đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của cao chiết toàn phần lá Đu đủ với 2 mức liều 400 mg/kg TT và 800 mg/kg TT trên chuột đã đƣợc gây giảm tiểu cầu bằng CPA.
Mặc dù các nghiên cứu hiện đại đã chứng minh lá Đu đủ có tác dụng chống giảm tiều cầu trên một số động vật, nhƣng với các dung môi chiết cao toàn phần khác nhau (cao chiết nƣớc trong nghiên cứu của Swati Patil năm 2013 [47], dịch ép toàn phần lá
24
Đu đủ trong nghiên cứu của Tansena Akhter năm 2015 [14], của Sinhalagoda năm 2013 [22]) và để xác định một lần nữa tác dụng chống giảm tiểu cầu của lá Đu đủ đƣợc thu hái tại Việt Nam, chúng tôi tiến hành đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của cao chiết cồn toàn phần lá Đu đủ trên mô hình gây giảm tiểu cầu bằng CPA. Dung môi chiết cao toàn phần đƣợc sử dụng là ethanol 70 %, một dung môi đƣợc sử dụng rộng rãi để chiết xuất các nhóm hợp chất từ thực vật.
Chuột cống trắng đƣợc chia làm 4 lô, mỗi lô 8 con cả đực và cái, bao gồm lô sinh lý, bệnh lý, cao chiết ethanol 400 mg/kg TT và ethanol 800 mg/kg TT. Chuột lô bệnh lý và hai lô cao chiết ethanol 400 mg/kg TT và ethanol 800 mg/kg TT đƣợc tiêm dƣới da CPA liều 30 mg/kg TT vào ngày thứ nhất và ngày thứ 2. Chuột lô sinh lý đƣợc tiêm nƣớc muối sinh lý với thể tích tƣơng đƣơng. Đồng thời, chuột 2 lô ethanol 400 mg/kg TT và ethanol 800 mg/kg TT đƣợc uống cao chiết toàn phần từ ngày đầu tới ngày kết thúc thí nghiệm, một lô uống với mức liều 400 mg/kg TT/lần/ngày, lô còn lại uống với liều 800 mg/kg TT/lần/ngày. Lô bệnh lý và sinh lý đƣợc cho uống nƣớc cất với thể tích tƣơng đƣơng. Trong suốt thời gian thí nghiệm, chuột đƣợc cho ăn thức ăn đầy đủ, uống nƣớc cất, vệ sinh lồng và thay trấu sạch hằng ngày để tránh nhiễm khuẩn. Tất cả chuột đƣợc lấy máu ở tĩnh mạch đùi vào ngày 0, ngày 4, ngày 6 và ngày 8 để phân tích số lƣợng hồng cầu, tiểu cầu và bạch cầu. Ngày 8, chuột đƣợc xác định thời gian máu chảy.
Đợt 2:
Đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của các phân đoạn cao chiết lá Đu đủ trên chuột đã đƣợc gây giảm tiểu cầu bằng CPA. Mục đích của việc phân lập các chất chống giảm tiểu cầu từ lá Đu đủ thông qua quá trình chiết phân đoạn là để xác định các nhóm hóa thực vật chính chịu trách nhiệm cho tác dụng đƣợc chứng minh trong cao chiết toàn phần
Chuột cống trắng đƣợc chia làm 5 lô, mỗi lô 8 con cả đực và cái, bao gồm lô 1 bệnh lý, lô 2 phân đoạn nƣớc, lô 3 phân đoạn butanol, lô 4 phân đoạn DCM, lô 5 sinh lý. Chuột lô bệnh lý và lô các cao chiết phân đoạn đƣợc tiêm dƣới da CPA liều 30 mg/kg TT vào ngày thứ nhất và ngày thứ 2. Chuột lô sinh lý đƣợc tiêm nƣớc muối sinh lý với thể tích tƣơng đƣơng. Chuột lô 2 đƣợc uống cao chiết nƣớc với liều 800 mg/kg TT/ngày, lô 3 đƣợc uống cao chiết phân đoạn butanol với liều 400 mg/kg TT/ngày, lô 4 đƣợc uống cao chiết phân đoạn DCM với mức liều 400 mg/kg TT/ngày từ ngày đầu cho tới khi kết thúc nghiên cứu. Lô 1 và lô 5 đƣợc uống nƣớc cất cùng thể tích. Trong
25
suốt thời gian thí nghiệm, chuột đƣợc cho ăn thức ăn đầy đủ, uống nƣớc cất, vệ sinh lồng và thay trấu sạch hằng ngày để tránh nhiễm khuẩn. Tất cả chuột đƣợc lấy máu ở tĩnh mạch đùi vào ngày 0, ngày 4, ngày 6 và ngày 8 để phân tích số lƣợng hồng cầu, tiểu cầu và bạch cầu. Ngày 8, chuột đƣợc xác định thời gian máu chảy.
Đợt 3:
Đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của carpain từ lá Đu đủ trên chuột đã đƣợc gây giảm tiểu cầu bằng CPA
Chuột cống trắng đƣợc chia làm 4 lô, mỗi lô 8 con cả đực và cái, bao gồm lô 1 bệnh lý, lô 2 carpain 2 mg/kg TT, lô 3 carpain 6 mg/kg TT, lô 4 sinh lý. Chuột lô 1, 2, 3 đƣợc tiêm dƣới da CPA liều 30 mg/kg TT vào ngày thứ nhất và ngày thứ 2. Chuột lô 4 sinh lý đƣợc tiêm nƣớc muối sinh lý với thể tích tƣơng đƣơng. Chuột lô 2 đƣợc uống carpain phân tán trong nƣớc với liều 2 mg/kg TT/ngày từ ngày đầu cho tới khi kết thúc nghiên cứu. Chuột lô 3 đƣợc uống carpain phân tán trong nƣớc với liều 6 mg/kg TT/ngày. Chuột lô 1 và lô 4 uống nƣớc cất cùng thể tích. Trong suốt thời gian thí nghiệm, chuột đƣợc cho ăn thức ăn đầy đủ, uống nƣớc cất, vệ sinh lồng và thay trấu sạch hằng ngày để tránh nhiễm khuẩn. Tất cả chuột đƣợc lấy máu ở tĩnh mạch đùi vào ngày 0, ngày 4, ngày 6 và ngày 8 để phân tích số lƣợng hồng cầu, tiểu cầu và bạch cầu. Ngày 8, chuột đƣợc xác định thời gian máu chảy.
Đợt 4:
Đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của cao giàu flavonoid từ lá Đu đủ trên chuột đã đƣợc gây giảm tiểu cầu bằng CPA
Chuột cống trắng đƣợc chia làm 3 lô, mỗi lô 8 con cả đực và cái, bao gồm lô 1 sinh lý, lô 2 bệnh lý, lô 3 flavonoid 25mg/kg TT. Chuột lô bệnh lý và lô thuốc thử đƣợc tiêm dƣới da CPA liều 30 mg/kg TT vào ngày thứ nhất và ngày thứ 2. Chuột lô sinh lý đƣợc tiêm nƣớc muối sinh lý với thể tích tƣơng đƣơng. Chuột lô 3 đƣợc uống flavonoid với mức liều 25 mg/kg TT/ngày từ ngày đầu cho tới khi kết thúc nghiên cứu. Chuột lô 1 và lô 2 uống nƣớc cất cùng thể tích. Trong suốt thời gian thí nghiệm, chuột đƣợc cho ăn thức ăn đầy đủ, uống nƣớc cất, vệ sinh lồng và thay trấu sạch hằng ngày để tránh nhiễm khuẩn. Tất cả chuột đƣợc lấy máu ở tĩnh mạch đùi vào ngày 0, ngày 4, ngày 6 và ngày 8 để phân tích số lƣợng hồng cầu, tiểu cầu và bạch cầu. Ngày 8, chuột đƣợc xác định thời gian máu chảy.
26
Hình 2.2. Quy trình nghiên cứu