3.1.3.1. Ảnh hưởng của carpain từ lá Đu đủ đến số lượng tiểu cầu trên các mức liều khác nhau
Hình 3.7. Ảnh hƣởng của carpain từ lá Đu đủ đến số lƣợng tiểu cầu qua các ngày
Ghi chú: Sinh lý, bệnh lý, carpain 2 mg/kg, carpain 6 mg/kg lần lượt là các lô chuột sinh lý, lô chuột bệnh lý, lô chuột được uống carpain liều 2 mg/kg TT, lô chuột được uống carpain liều 6 mg/kg TT. Kết quả được biểu diễn dưới dạng trung bình ± sai số chuẩn; với **p < 0,01; ***p <0,001 khi so sánh với lô bệnh lý.
Nhận xét:
Ngày 4, ngày 6 và ngày 8, số lƣợng tiểu cầu lô bệnh lý (với các giá trị lần lƣợt là 530,875 ± 37,458; 258,875 ± 24,066; 467,125 ± 63,776) giảm rõ rệt so với lô sinh lý (với các giá trị lần lƣợt là 700,792 ± 29,376; 724,875 ± 40,651, 719,375 ± 39,525), sự giảm này có ý nghĩa thống kê với các giá trị p lần lƣợt là p < 0,01 vào ngày 4, p <
35
0,001 vào ngày 6, p < 0,01 vào ngày 8. Hai lô chuột đƣợc uống carpain 2 mg/kg TT và 6 mg/kg TT không thể hiện tác dụng chống giảm tiểu cầu, do số lƣợng tiểu cầu tại hai lô này không có sự khác biệt có ý nghĩa so với lô bệnh lý (p > 0,05).
3.1.4. Kết quả đánh giá được tác dụng chống giảm tiểu cầu của cao giàu flavonoid từ lá Đu đủ
3.1.4.1. Ảnh hưởng của cao giàu flavonoid từ lá Đu đủ đến số lượng tiểu cầu
Hình 3.8. Ảnh hƣởng của cao chiết giàu flavonoid từ lá Đu đủ đến số lƣợng tiểu cầu qua các ngày
Ghi chú: Sinh lý, bệnh lý, flavonoid lần lượt biểu diễn các lô chuột sinh lý, lô chuột bệnh lý, lô chuột được uống cao giàu flavonoid 25 mg/kg TT. Kết quả được biểu diễn dưới dạng trung bình ± sai số chuẩn; với *p < 0,05; ***p <0,001 khi so sánh với lô bệnh lý.
Nhận xét:
Ngày 4, số lƣợng tiểu cầu của chuột lô bệnh lý nhỏ hơn có ý nghĩa so với lô sinh lý (522,13 ± 40,25 so với 758,00 ± 40,57; p < 0,05). Trong khi đó, số lƣợng tiểu cầu lô chuột đƣợc uống cao giàu flavonoid (633,25 ± 51,04) lớn hơn so với lô bệnh lý (522,125± 40,25), tuy nhiên, sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
Ngày 6 số lƣợng tiểu cầu lô bệnh lý giảm rõ rệt có ý nghĩa thống kê so với lô sinh lý (289,75 ± 23,38 so với 680,71 ± 32,42; p < 0,001). Cao giàu flavonoid 25 mg/kg TT thể hiện tác dụng chống giảm tiểu cầu do lô chuột đƣợc uống cao giàu flavonoid 25
36
mg/kg TT có số lƣợng tiểu cầu tăng có ý nghĩa thống kê so với lô bệnh lý (420,25 ± 44,09 so với 289,75 ± 23,38; p < 0,05).
Đến ngày 8, số lƣợng tiểu cầu lô bệnh lý vẫn nhỏ hơn có ý nghĩa thống kê so với lô sinh lý (397,38 ± 41,63 so với 719,38 ± 36,97; p < 0,001). Lô cao giàu flavonoid có số lƣợng tiểu cầu lớn hơn có ý nghĩa thống kê so với lô bệnh lý (589,00 ± 47,58 so với 397,38 ± 41,63 p < 0,05).
3.1.4.2.Ảnh hưởng của cao giàu flavonoid từ lá Đu đủ đến thời gian chảy máu
Hình 3.9. Ảnh hƣởng của cao chiết giàu flavonoid từ lá Đu đủ đến thời gian chảy máu trên động vật thí nghiệm
Ghi chú: Sinh lý, bệnh lý, flavonoid lần lượt biểu diễn các lô chuột sinh lý, lô chuột bệnh lý, lô chuột được uống cao giàu flavonoid 25mg/kg TT. Kết quả được biểu diễn dưới dạng trung vị và các tứ phân vị 25 %, 75 %; với *p < 0,05 khi so sánh với lô bệnh lý.
Nhận xét:
Chuột lô bệnh lý có thời gian chảy máu kéo dài có ý nghĩa thống kê so với chuột lô sinh lý (612,1 ± 88,7 so với 254,4 ± 70.7; p < 0,05). Cao chiết giàu flavonoid với liều 25 mg/kg TT từ lá Đu đủ làm giảm một nửa thời gian chảy máu ở chuột so với lô bệnh lý, sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê ( 295,1 ± 80,5 so với 612,1 ± 88,7; p < 0,05). Th ờ i g ia n ch ảy m á u * Sinh lý Bệnh lý Flavonoid Lô *
37
3.2. Bàn luận.
3.2.1. Về đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của cao chiết toàn phần lá Đu đủ
Mrinal Saraf và cộng sự năm 2017 đã tiến hành đánh giá tác dụng kích thích tiểu cầu của cao chiết cồn lá đu đủ ở hai mức liều là 100 mg/kg TT và 200 mg/kg TT nhƣng kết quả là cao chiết cồn lá Đu đủ không thể hiện tác dụng kích thích sinh tiểu cầu ở hai mức liều trên. Sau đó, mức liều đƣợc nâng lên là 400 mg/kg TT và cao chiết cồn thể hiện rõ tác dụng tại mức liều này (lƣợng tiểu cầu tại lô chuột đƣợc uống cao chiết cồn lá Đu đủ liều 400 mg/kg TT gấp 2,7 lần lô bệnh lý) [53]. Do đó, chúng tôi lựa chọn 2 mức liều 400 mg/kgTT và 800 mg/kg TT cao chiết ethanol toàn phần lá Đu đủ để đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của lá Đu đủ trên mô hình chuột gây giảm tiểu cầu bằng CPA.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, lô chuột đƣợc uống cao ethanol 800mg/kg TT có sự gia tăng số lƣợng tiểu cầu gấp rƣỡi so với lô bệnh lý (p < 0,05). Tuy nhiên, ngày thứ 8, sự tăng tiểu cầu của lô cao ethanol 800mg/kg TT so với lô bệnh lý lại không có sự khác biệt có nghĩa, mặc dù lƣợng tiểu cầu lô bệnh lý vẫn giảm có ý nghĩa so với lô sinh lý. Nhƣ vậy, cao chiết toàn phần lá Đu đủ liều 800 mg/kg TT có tác dụng chống giảm tiểu cầu trên chuột bị giảm tiểu cầu do CPA, nhƣng hiệu quả này chỉ có giá trị khi lƣợng tiểu cầu giảm thấp (ngày 6). Tác dụng này không kéo dài đƣợc lâu khi lƣợng tiểu cầu trên chuột dần hồi phục (vào ngày thứ 8). Cao chiết cồn toàn phần liều 400 mg/kg TT thì không thể hiện tác dụng chống giảm tiểu cầu trên mô hình giảm tiểu cầu bằng CPA. Có thể do tại mức liều 400 mg/kg TT, lƣợng hoạt chất chính chịu trách nhiệm cho tác dụng chống giảm tiểu cầu còn thấp, nên không đủ để gây ra tác dụng.
Swati Patil và cộng sự năm 2013 tiến hành đánh giá tác dụng kích thích tiểu cầu của cao chiết nƣớc lá Đu đủ với hai mức liều 400 mg/kg TT và 800 mg/kg TT và chỉ ra rằng cả hai mức liều này đều có tác dụng tăng tiểu cầu đáng kể [47]. Tansena Akhter và cộng sự cũng thử nghiệm khả năng kích thích sinh tiểu cầu của dịch ép lá Đu đủ với hai mức liều 400 mg/kg TT và 800 mg/kg TT thì đều có tác dụng kích thích sản xuất tiểu cầu [50], kết quả tƣơng tự đƣợc chứng minh trong thử nghiệm đánh giá
tác dụng của dịch ép tinh khiết lá Đu đủ củaSinhalagoda (2013) nhƣng với mức liều
cao hơn 2g/ động vật thí nghiệm (xấp sỉ 1600 mg/kg TT) [22] . Sự khác biệt về liều thể hiện tác dụng có thể do nhiều nguyên nhân nhƣ chất lƣợng dƣợc liệu và quy trình chiết xuất dƣợc liệu không giống nhau, dẫn tới hàm lƣợng các hoạt chất có tác dụng kích
38
thích sản xuất tiểu cầu khác nhau. Thao tác và mô hình thí nghiệm khác nhau cũng có thể dẫn tới những sự khác biệt vể kết quả. Đặc biệt là thao tác lấy máu và chống đông máu, máu không đƣợc lấy đúng cách và chống đông tốt sẽ nhanh chóng đông lại, số lƣợng tiểu cầu đo đƣợc sẽ sai khác so với số lƣợng tiểu cầu trên thực tế.
Trên các dòng tế bào bạch cầu, CPA làm giảm đến 80 % số lƣợng tế bào bạch cầu ở lô bệnh lý. Nhƣng cao toàn phần ethanol 400 mg.kg TT và ethanol 800 mg/kg TT không thể hiện tác dụng kích thích dòng bạch cầu. Kết quả tƣơng tự cũng đƣợc ghi
nhận trong nghiên cứu củaSinhalagoda (2013) [22] và một nghiên cứu trƣớc đó tại Việt
Nam [13]. Trong khi một nghiên cứu khác của Achini Gammulle ghi nhận dịch ép tinh
khiết lá Đu đủ có tác dụng làm tăng số lƣợng tế bào bạch cầu đáng kể (30,51 %) [36]. Trên dòng tế bào hồng cầu, mô hình gây giảm tiểu cầu bằng CPA không gây giảm số lƣợng hồng cầu. Kết quả tƣơng đồng với sự ghi nhận của nghiên cứu trƣớc đó [13]. Trái lại, Achini Gammulle (2012) và Sinhalagoda (2013) chỉ ra rằng dịch chiết lá Đu đủ có tác dụng làm tăng số lƣợng hồng cầu trong nghiên cứu đánh giá tác dụng kích thích tạo tiểu cầu của lá Đu đủ [22], [36].
Bên cạnh đánh giá số lƣợng các tế bào máu, chúng tôi cũng tiến hành đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của cao chiết toàn phần lá Đu đủ trên thông số thời gian chảy máu. Kết quả chỉ ra rằng, sự giảm thời gian chảy máu của lô dùng cao lá Đu đủ ethanol 800 mg/kg TT khác biệt có ý nghĩa so với lô bệnh lý. Lô cao Đu đủ 400 mg/kg TT có làm rút ngắn thời gian chảy máu trên chuột, song sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với lô bệnh lý. Thông số thời gian chảy máu không chỉ phụ thuộc vào số lƣợng tiểu cầu, mà nó còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhƣ chức năng của tiểu cầu, các yếu tố Von Willebrand (đóng góp vào sự ổn định chức năng của tiểu cầu), fibrinogen, chức năng của thành mạch..v..v và cao toàn phần lá Đu đủ tác động cả trên những yếu tố này? So sánh ảnh hƣởng của cao toàn phần tới số lƣợng tiểu cầu và thời gian chảy máu, có thể thấy có mối tƣơng quan giữa hai thông số đó, số lƣợng tiểu cầu giảm sẽ kéo dài đáng kể thời gian chảy máu. Điều này cũng phù hợp với chức năng chính của tiểu cầu là tham gia vào quá trình cầm máu. Trái ngƣợc với kết quả này, nghiên cứu trƣớc đó của Phạm Đức Vịnh (2018) lại không ghi nhận đƣợc cao chiết nƣớc lá Đu đủ có tác dụng rút ngắn thời gian chảy máu [13].
Một hạn chế trong thí nghiệm của chúng tôi đó là, thời gian chảy máu không đƣợc xác định vào thời điểm số lƣợng tiểu cầu giảm thấp nhất, do đó ảnh hƣởng ít
39
nhiều đến kết luận về tác dụng của cao chiết cồn toàn phần lá Đu đủ đến thời gian chảy máu. Mặc dù thời gian chảy máu không phải là thông số đặc hiệu cho số lƣợng và chất lƣợng của tiểu cầu, kết quả trên cũng góp phần củng cố thêm tác dụng chống giảm tiểu cầu của cao chiết cồn toàn phần lá Đu đủ ở mức liều 800 mg/kg TT.
Giống nhƣ các thí nghiệm trƣớc đó [13], [47], [36], chúng tôi không tìm đƣợc tác nhân để làm nhóm đối chứng dƣơng cho mô hình. Xem xét những phác đồ điều trị giảm tiểu cầu hiện nay, chúng tôi nhận thấy, hydrocodtisol và các thuốc kích thích tiểu cầu thế hệ mới đƣợc sử dụng trên bệnh nhân giảm tiểu cầu. Tuy nhiên, prednisone hay methyl presnisolon thƣờng đƣợc sử dụng trong trƣờng hợp giảm tiểu cầu do cơ chế miễn dịch, trong khi CPA gây giảm tiểu cầu do ức chế tủy xƣơng và các giả thuyết đều cho rằng lá Đu đủ chống giảm tiểu cầu theo cơ chế kích thích sản sinh tiểu cầu và ngăn chặn phá hủy tiểu cầu ở ngoại vi. Đối với các thuốc kích thích sản xuất tiểu cầu thế hệ mới, hiện nay chƣa có sẵn tại Việt Nam và giá thành vẫn rất đắt đỏ, vì vậy chúng tôi không có đƣợc nhóm chứng dƣơng ở mô hình thí nghiệm này.
Nhƣ vậy, lá Đu đủ có tác dụng chống giảm tiểu cầu trên chuột bị giảm tiểu cầu do CPA ở mức liều cao ethanol 800 mg/kg TT, đây có thể là mức liều bắt đầu có tác dụng của cao chiết toàn phần lá Đu đủ, bởi cao chiết ethanol 400 mg/kg TT thì không thể hiện tác dụng này. Nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra kết quả tƣơng tự, do đó mở ra hƣớng nghiên cứu đi tìm nhóm hợp chất trong lá Đu đủ đóng vai trò chính cho tác dụng chống giảm tiểu cầu đã đƣợc ghi nhận này [14], [59], [53], [34]. Lá Đu đủ chứa nhiều thành phần nhƣ tanin, alcaloid, flavonoid, acid phenolic, saponins… [22]. Do đó, chúng tôi cân nhắc tiến hành nhiều nghiên cứu hơn để xác định những nhóm hoạt chất có tác dụng kích thích sản sinh tiểu cầu.
3.2.2. Về tác dụng chống giảm tiểu cầu của các cao chiết phân đoạn lá đu đủ.
Kết quả nghiên cứu trƣớc của chúng tôi cho thấy, cao chiết toàn phần lá Đu đủ có tác dụng chống giảm tiểu cầu ở liều 800 mg/kg TT. Mục đích của việc phân lập các chất chống giảm tiểu cầu từ lá Đu đủ thông qua quá trình chiết phân đoạn là để xác định các nhóm hóa thực vật chính chịu trách nhiệm cho tác dụng đƣợc chứng minh trong cao chiết toàn phần. Lá Đu đủ chứa nhiều thành phần nhƣ alcaloid, flavonoid, acid phenolic, saponins… Mỗi nhóm hoạt chất này tan trong các dung môi có độ phân cực khác nhau. Các phenolic, saponin mang nhiều nhóm phân cực nên chúng dễ hòa tan trong các dung môi phân cực mạnh nhƣ nƣớc, metanol, các flavonoid dạng
40
glycosid dễ tan trong dung môi phân cực, flavonoid dạng aglycon dễ tan trong dung môi kém phân cực, alcaloid không tan trong nƣớc và dễ tan trong dung môi kém phân cực..v..v [12], [44]. Do đó, chúng tôi có ba nhóm cao tƣơng ứng với ba dung môi đƣợc chiết lỏng lỏng với độ phân cực tăng dần là DCM, n-butanol và nƣớc nhằm mục đích lấy đƣợc những nhóm hoạt chất chiết khác nhau ở 3 cao chiết phân đoạn, qua đó đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của các phân đoạn cao chiết này, góp phần xác định dung môi chiết thích hợp để phân lập đƣợc những nhóm hoạt chất đóng góp chính vào tác dụng chống giảm tiểu cầu của lá Đu đủ. Liều các cao chiết phân đoạn đƣợc tính toán tƣơng ứng với liều của cao chiết toàn phần có tác dụng chống giảm tiểu cầu.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, cao chiết phân đoạn DCM liều 400 mg/kg TT không thể hiện tác dụng chống giảm tiểu cầu trên chuột, thậm chí vào ngày 4, số lƣợng tiểu cầu lô chuột uống DCM 400 mg/kg TT còn thấp hơn đáng kể so với lô bệnh lý. Cao chiết phân đoạn nƣớc liều 800 mg/kg TT cũng không có tác dụng chống giảm tiểu cầu đáng kể trên mô hình chuột giảm tiểu cầu bằng CPA. Trong khi cao chiết phân đoạn n-butanol thể hiện tác dụng kích thích tăng số lƣợng tiểu cầu ở mức liều 400 mg/kg TT, tác dụng này thể hiện mạnh mẽ nhất vào ngày 8. Nhƣ vậy, dung môi quá phân cực hoặc kém phân cực đều không có tác dụng chống giảm tiểu cầu đáng kể. Dung môi có độ phân cực vừa phải nhƣ n-butanol có lẽ lấy đƣợc lƣợng hoạt chất mang tác dụng dƣợc lý kích thích sản sinh tiểu cầu nhiều hơn.
Kết quả trên cho thấy, hoạt chất có nồng độ cao trong cao chiết phân đoạn n- butanol của lá Đu đủ sẽ thể hiện tác dụng chống giảm tiểu cầu. Trong quá trình phân lập các hợp chất có trong cao chiết phân đoạn n-butanol, một lƣợng đáng kể các flavonoid đã đƣợc tìm thấy (2,28 %). Do vậy, chúng tôi tiến hành đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của cao giàu flavonoid đƣợc tinh chế từ cao chiết phân đoạn n- butanol ở thử nghiệm trên.
Kết quả trên cũng chỉ ra rằng, cao chiết phân đoạn DCM không có tác dụng kích thích sinh tiểu cầu đáng kể, trên thực tế chúng tôi sẽ dừng nghiên cứu thêm về các thành phần có trong cao chiết phân đoạn này. Song, carpain 3,3 % đƣợc phân lập từ cao chiết phân đoạn DCM lại đƣợc chứng minh là có tác dụng kích thích sinh tiểu cầu mạnh mẽ trong một vài nghiên cứu trƣớc đây [67], [34]. Do đó, chúng tôi vẫn tiến hành đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của carpain tinh khiết đƣợc tinh chế từ cao chiết phân đoạn DCM với hai mức liều khác nhau.
41
3.2.3. Về tác dụng chống giảm tiểu cầu của carpain được phân lập và tinh chế từ lá Đu đủ
Năm 2016, Zunjar V. và cộng sự đã đánh giá khả năng chống giảm tiểu cầu của carpain và các phân đoạn chiết alcaloid từ lá Đu đủ trên mô hình động vật gây giảm tiểu cầu bằng busulfan. Kết quả cho thấy, cả phân đoạn chiết alcaloid thô và carpain tinh khiết liều 2 mg/kg TT đều có khả năng chống giảm tiểu cầu rất mạnh. Nghiên cứu cũng cho thấy có sự tƣơng quan về hàm lƣợng carpain trong các phân đoạn chiết của lá Đu đủ với hoạt tính chống giảm tiểu cầu [67]. Do đó, chúng tôi tiến hành thử tác dụng