Kết quả nghiên cứu trƣớc của chúng tôi cho thấy, cao chiết toàn phần lá Đu đủ có tác dụng chống giảm tiểu cầu ở liều 800 mg/kg TT. Mục đích của việc phân lập các chất chống giảm tiểu cầu từ lá Đu đủ thông qua quá trình chiết phân đoạn là để xác định các nhóm hóa thực vật chính chịu trách nhiệm cho tác dụng đƣợc chứng minh trong cao chiết toàn phần. Lá Đu đủ chứa nhiều thành phần nhƣ alcaloid, flavonoid, acid phenolic, saponins… Mỗi nhóm hoạt chất này tan trong các dung môi có độ phân cực khác nhau. Các phenolic, saponin mang nhiều nhóm phân cực nên chúng dễ hòa tan trong các dung môi phân cực mạnh nhƣ nƣớc, metanol, các flavonoid dạng
40
glycosid dễ tan trong dung môi phân cực, flavonoid dạng aglycon dễ tan trong dung môi kém phân cực, alcaloid không tan trong nƣớc và dễ tan trong dung môi kém phân cực..v..v [12], [44]. Do đó, chúng tôi có ba nhóm cao tƣơng ứng với ba dung môi đƣợc chiết lỏng lỏng với độ phân cực tăng dần là DCM, n-butanol và nƣớc nhằm mục đích lấy đƣợc những nhóm hoạt chất chiết khác nhau ở 3 cao chiết phân đoạn, qua đó đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của các phân đoạn cao chiết này, góp phần xác định dung môi chiết thích hợp để phân lập đƣợc những nhóm hoạt chất đóng góp chính vào tác dụng chống giảm tiểu cầu của lá Đu đủ. Liều các cao chiết phân đoạn đƣợc tính toán tƣơng ứng với liều của cao chiết toàn phần có tác dụng chống giảm tiểu cầu.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, cao chiết phân đoạn DCM liều 400 mg/kg TT không thể hiện tác dụng chống giảm tiểu cầu trên chuột, thậm chí vào ngày 4, số lƣợng tiểu cầu lô chuột uống DCM 400 mg/kg TT còn thấp hơn đáng kể so với lô bệnh lý. Cao chiết phân đoạn nƣớc liều 800 mg/kg TT cũng không có tác dụng chống giảm tiểu cầu đáng kể trên mô hình chuột giảm tiểu cầu bằng CPA. Trong khi cao chiết phân đoạn n-butanol thể hiện tác dụng kích thích tăng số lƣợng tiểu cầu ở mức liều 400 mg/kg TT, tác dụng này thể hiện mạnh mẽ nhất vào ngày 8. Nhƣ vậy, dung môi quá phân cực hoặc kém phân cực đều không có tác dụng chống giảm tiểu cầu đáng kể. Dung môi có độ phân cực vừa phải nhƣ n-butanol có lẽ lấy đƣợc lƣợng hoạt chất mang tác dụng dƣợc lý kích thích sản sinh tiểu cầu nhiều hơn.
Kết quả trên cho thấy, hoạt chất có nồng độ cao trong cao chiết phân đoạn n- butanol của lá Đu đủ sẽ thể hiện tác dụng chống giảm tiểu cầu. Trong quá trình phân lập các hợp chất có trong cao chiết phân đoạn n-butanol, một lƣợng đáng kể các flavonoid đã đƣợc tìm thấy (2,28 %). Do vậy, chúng tôi tiến hành đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của cao giàu flavonoid đƣợc tinh chế từ cao chiết phân đoạn n- butanol ở thử nghiệm trên.
Kết quả trên cũng chỉ ra rằng, cao chiết phân đoạn DCM không có tác dụng kích thích sinh tiểu cầu đáng kể, trên thực tế chúng tôi sẽ dừng nghiên cứu thêm về các thành phần có trong cao chiết phân đoạn này. Song, carpain 3,3 % đƣợc phân lập từ cao chiết phân đoạn DCM lại đƣợc chứng minh là có tác dụng kích thích sinh tiểu cầu mạnh mẽ trong một vài nghiên cứu trƣớc đây [67], [34]. Do đó, chúng tôi vẫn tiến hành đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của carpain tinh khiết đƣợc tinh chế từ cao chiết phân đoạn DCM với hai mức liều khác nhau.
41
3.2.3. Về tác dụng chống giảm tiểu cầu của carpain được phân lập và tinh chế từ lá Đu đủ
Năm 2016, Zunjar V. và cộng sự đã đánh giá khả năng chống giảm tiểu cầu của carpain và các phân đoạn chiết alcaloid từ lá Đu đủ trên mô hình động vật gây giảm tiểu cầu bằng busulfan. Kết quả cho thấy, cả phân đoạn chiết alcaloid thô và carpain tinh khiết liều 2 mg/kg TT đều có khả năng chống giảm tiểu cầu rất mạnh. Nghiên cứu cũng cho thấy có sự tƣơng quan về hàm lƣợng carpain trong các phân đoạn chiết của lá Đu đủ với hoạt tính chống giảm tiểu cầu [67]. Do đó, chúng tôi tiến hành thử tác dụng chống giảm tiểu cầu của carpain đƣợc tinh chế từ lá Đu đủ ở hai mức liều 2 mg/kg TT và 6 mg/kg TT.
Ƣu điểm trong nghiên cứu này của chúng tôi là carpain trong hai mẫu thuốc thử là carpain tinh khiết, với độ tinh khiết >95 %, do đó tác dụng dƣợc lý nếu có của carpain sẽ thể hiện rõ ràng. Vào ngày thứ 4, số lƣợng tiểu cầu bắt đầu giảm ở lô bệnh lý và hai lô thuốc thử, số lƣợng tiểu cầu giảm mạnh nhất vào ngày thứ 6, lúc này ở cả lô bệnh lý và lô thuốc thử số lƣợng tiểu cầu chỉ còn 1/3 so với số lƣợng tiểu cầu ngày đầu. Ngày 8, lƣợng tiểu cầu bắt đầu tăng dần ở 3 lô này và tăng nhanh nhất ở lô bệnh lý. Kết quả chỉ ra rằng carpain không thể hiện tác dụng chống giảm tiểu cầu ở cả hai mức liều 2 mg/kg TT và 6 mg/kg TT trên mô hình chuột gây giảm tiểu cầu bằng CPA (số lƣợng tiểu cầu của hai lô dùng thuốc không có sự khác biệt đáng kể so với lô bệnh lý). Nhƣ vậy, kết quả thu đƣợc không giống với kết quả một số nghiên cứu trƣớc đó [67].
Nghiên cứu trƣớc đây cho rằng, các alcaloid hiện diện trong lá Đu đủ bao gồm carpain, pseudocarpain và dehydrocarpain I và II. Những thành phần này có thể tác động lên tủy xƣơng, ngăn chặn sự phá hủy và tăng cƣờng khả năng sản sinh tiểu cầu. Hơn nữa, nó cũng có thể ngăn chặn sự phá hủy tiểu cầu trong máu và do đó làm tăng tuổi thọ của tiểu cầu ở máu ngoại vi [14], [47], [50]. Các carpain đƣợc cho là những hợp chất tiềm năng có trong lá Đu đủ chịu trách nhiệm trong việc duy duy trì số lƣợng tiểu cầu trên ngƣời. Trƣớc khi thực hiện các nghiên cứu về tác dụng của các carpain tinh khiết, độc tính của carpain đã đƣợc xem xét trong một số thử nghiệm. Ismail và cộng sự đã kết luận rằng, dịch chiết lá Đu đủ không có độc tính trên chuột với liều 2 g/kg cân nặng. Độc tính đƣợc đánh giá qua các thông số huyết học, sinh hóa, các mô bệnh học của gan, lá lách và thận của tất cả các động vật tham gia nghiên cứu. Kết quả không cho thấy các bất thƣờng nào của các thông số trên [31]. Do vậy, có thể cân nhắc
42
tiến hành đánh giá tác dụng của carpain tinh chế từ lá Đu đủ ở các mức liều cao hơn mà không lo độc tính có thể gây nên trên động vật thí nghiệm,
3.2.4. Về tác dụng chống giảm tiểu cầu của cao giàu flavonoid từ lá Đu đủ
Cao chiết phân đoạn n-butanol thể hiện tác dụng chống giảm tiểu cầu mạnh mẽ và chứa tới 2,28 % hàm lƣợng các flavonoid, do đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu tác dụng chống giảm tiểu cầu của nhóm hoạt chất này. Cao chiết phân đoạn butanol đƣợc tinh chế thành cao giàu flavonoid để phục vụ thí nghiệm. Kết quả là từ cao phân đoạn butanol có nồng độ các flavonoid 2,28 %, cao giàu flavonoid đã có 11,7 % các flavonoid. Chúng tôi không tìm đƣợc nghiên cứu nào đánh giá tác dụng kích thích sinh tiểu cầu của flavonoid hay cao giàu flavonoid trƣớc đây, do vậy không có mức liều để đối chiếu cho thí nghiệm này. Nồng độ cao giàu flavonoid đƣợc dùng trong thí nghiệm này là 25 mg/kg TT, tƣơng quan với nồng độ cao chiết phân đoạn n-butanol 400 mg/kg TT về tỷ lệ phần trăm của các flavonoid.
Kết quả thí nghiệm của chúng tôi chỉ ra rằng, cao chiết giàu flavonoid từ lá Đu đủ có tác dụng chống giảm tiểu cầu ở mức liều 25 mg/kg TT. Vào ngày 6, khi số lƣợng tiểu cầu trung bình của lô bệnh lý giảm một nửa, thì lô thuốc thử giảm ít hơn đáng kể so với lô bệnh lý. Khi lƣợng tiểu cầu thấp nhất vào ngày 6 đến khi lƣợng tiểu cầu dần tăng lên vào ngày 8, số lƣợng tiểu cầu của lô thuốc thử vẫn lớn hơn có ý nghĩa so với lô bệnh lý. Đặc biệt, vào ngày 8 lƣợng tiểu cầu ở lô chuột đƣợc uống cao giàu flavonoid 25 mg/kg TT đã trở về gần bình thƣờng, tức là gần bằng với lƣợng tiểu cầu của lô này vào ngày đầu tiên. Có thể kết luận rằng, cao chiết giàu flavonoid có tác dụng chống giảm tiểu cầu tốt ở mức liều 25 mg/kg TT. So với cao toàn phần, mức liều có tác dụng của cao chiết flavonoid thấp hơn nhiều (25mg/kg TT cao giàu flavonoid so với 800 mg/kg TT cao chiết toàn phần).
Bên cạnh số lƣợng tiểu cầu, chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng chống giảm tiểu cầu của cao giàu flavonoid qua thông số thời gian chảy máu. Do ảnh hƣởng của thí nghiệm đo thời gian chảy máu trên chuột (chuột dễ bị yếu, chết khi gây mê ảnh hƣởng đến thông số số lƣợng tiểu cầu vào những ngày tiếp theo), chúng tôi không thể kiểm tra thông số thời gian chảy máu vào thời điểm tiểu cầu giảm thấp nhất (ngày 6), thời gian chảy máu đƣợc xác định vào ngày 8 khi gần kết thúc thí nghiệm. Kết quả cho thấy, cao giàu flavonoid làm giảm thời gian chảy máu trên chuột so với lô bệnh lý (thời gian chảy máu ở chuột lô bệnh lý gấp đôi lô dùng cao giàu flavonoid liều 25
43
mg/kg TT). Mặc dù thông số thời gian chảy máu không phải thông số đặc hiệu cho số lƣợng tiểu cầu, kết quả này vẫn củng cố thêm khẳng định, cao giàu flavonoid có tác dụng kích thích sinh tiểu cầu ở mức liều 25 mg/kg TT trên mô hình giảm tiểu cầu bằng CPA.
Nhƣ vậy, cao giàu flavonoid có tác dụng chống giảm tiểu cầu trên chuột ở mức liều 25 mg/kg TT. Có thể mức liều này không phải là mức liều thấp nhất có tác dụng. Cần thêm nhiều nghiên cứu để xác đinh mức liều thấp nhất thể hiện tác dụng dƣợc lý này. Hơn nữa, nếu các flavonoid đƣợc tinh chế gần nhƣ tinh khiết, mức liều cần sử dụng có lẽ còn thấp hơn nhiều. Nghiên cứu đã chỉ ra, flavonoid có trong lá Đu đủ là nhóm hoạt chất có tác dụng chống giảm tiểu cầu mà lâu nay vẫn chƣa đƣợc biết đến. Điều này đem lại tiềm năng phát triển hoạt chất có tác dụng chống giảm tiểu cầu trên ngƣời, tuy nhiên vẫn cần nhiều nghiên cứu hơn nữa về độc tính của flavonoid trên cơ thể ngƣời cũng nhƣ cơ chế tác dụng chống giảm tiểu cầu của nhóm hoạt chất này.
Vì đây là nghiên cứu đầu tiên chỉ ra flavonoid là nhóm hợp chất có trong lá Đu đủ có tác dụng kích thích sinh tiểu cầu, chƣa có nghiên cứu nào đƣợc thực hiện để dự đoán hay xác định cơ chế tác dụng của chúng. Trên một cơ thể khỏe mạnh, tiểu cầu đƣợc sản xuất từ tế bào megakaryocytes trong vòng 4 - 6 ngày [19]. Tuy nhiên, trong những nghiên cứu của chúng tôi, hiệu quả của các cao chiết có tác dụng chống giảm tiểu cầu đƣợc quan sát chỉ trong vòng 3 - 4 ngày. Mặt khác, trong trạng thái bình thƣờng, lá lách chịu trách nhiệm bắt giữ một phần ba lƣợng tiểu cầu sản xuất từ tế bào megakaryocytes, khi cơ trơn lá lách co, giải phóng một lƣợng tiểu cầu dự trữ vào tuần hoàn [37]. Mà nhựa Đu đủ đã đƣợc chứng minh gây ra các cơn co thắt tử cung ở trên chuột [46]. Do vậy, có thể đƣa ra giả thuyết rằng, tác dụng chống giảm tiểu cầu của cao toàn phần lá Đu đủ hay của cao giàu flavonoid là do cơn co thắt cơ trơn lá lách? Nhiều y văn khác lại cho rằng, tác dụng chống giảm tiểu cầu của lá Đu đủ là do tác dụng kích thích tủy xƣơng và ngăn phá hủy tiểu cầu trong máu [14], [47], [50]. Cũng có thể tác dụng này là hiệp đồng của hai cơ chế kích thích megakaryocytes sinh tiểu cầu và co thắt cơ trơn lá lách. Vì vậy, cần thêm nhiều nghiên cứu để chỉ ra cơ chế tác dụng này, chỉ có vậy tiềm năng các flavonoid từ lá Đu đủ mới có thể phát triển thành các chế phẩm điều trị các triệu chứng giảm tiểu cầu trên ngƣời do nhiều bệnh lý khác nhau, với nhiều cơ chế khác nhau gây nên.
44
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
1.Tác dụng chống giảm tiểu cầu của cao toàn phần lá Đu đủ liều 800 mg/kg TT
đƣợc khẳng định trên mô hình gây giảm tiểu cầu chuột bằng CPA qua số lƣợng tiểu cầu và thời gian chảy máu trên chuột. Tuy nhiên, cao toàn phần lá Đu đủ liều 400 mg/kg TT không thể hiện tác dụng này.
2.Cao chiết phân đoạn DCM từ lá Đu đủ liều 400 mg/kg TT không có tác dụng
chống giảm tiểu trên chuột bị giảm tiểu cầu bằng CPA. Cao chiết phân đoạn nƣớc 800 mg/kg TT không cho thấy có tác dụng chống giảm tiểu cầu trên mô hình chuột giảm tiểu cầu bằng CPA. Ngƣợc lại cao chiết phân đoạn n-butanol 400 mg/kg TT thể hiện tác dụng chống giảm tiểu cầu rõ rệt sau 3 ngày thực hiện mô hình giảm tiểu cầu bằng CPA.
3.Carpain tinh khiết (>95 %) đƣợc tinh chế từ cao chiết phân đoạn DCM lá Đu đủ
liều 2 mg/kg TT và 6 mg/kg TT không thể hiện tác dụng chống giảm tiểu cầu trên mô hình chuột giảm tiểu cầu bằng CPA.
4.Cao giàu flavonoid đƣợc tinh chế từ cao chiết phân đoạn n-butanol lá Đu đủ đã
cho thấy tác dụng chống giảm tiểu cầu tốt ở mức liều 25 mg/kg TT trên mô hình chuột giảm tiểu cầu bằng CPA. Từ đó xác đinh đƣợc một nhóm hợp chất có trong lá Đu đủ có tác dụng chống giảm tiểu cầu đó là các flavonoid.
Kiến nghị
1.Nghiên cứu ảnh hƣởng của cao giàu flavonoid hoặc flavonoid tinh khiết từ lá
Đu đủ trên cơ quan tạo huyết khối và cơ trơn lá lách để xác định cơ chế tác dụng chống giảm tiểu cầu của nhóm hoạt chất này.
45
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt
Nam, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, tr. 824-827.
2. Bộ Y tế (2015), Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị một số bệnh lý huyết học,
Nhà xuất bản Y học, tr. 134-139.
3. Bộ Y tế (2011), Hướng dẫn chẩn đoán, điều trị sốt xuất huyết Dengue.
4. Bộ Y tế (2015), Dược thư Quốc gia Việt Nam.
5. Nguyễn Việt Cƣờng, Võ Văn Lệnh (2020), "Tối ƣu hóa quy trình chiết xuất
flavonoid từ bìm ba răng (Merremia Tridentata L., Convolvulaceae)", Tạp chí
khoa học Lạc Hồng, 6, tr.006-009.
6. Đại học Y Hà Nội (2006), Tiểu cầu và bệnh xuất huyết giảm tiểu cầu, Bài giảng
Huyết học – Truyền máu sau Đại học, NXB Y học.
7. Nguyễn Công Khanh (2008), Xuất huyết giảm tiểu cầu tự phát, Huyết học lâm
sàng nhi khoa, NXB Y học.
8. Nguyễn Quốc Khang, Hà Thị Thanh Bình (1999), "Góp phần nghiên cứu một số
hoạt tính sinh học của flavonoid lá đu đủ (Carica papaya L", Tạp chí dược học, 6,
tr. 15-17.
9. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản y học, tr.
360-362.
10. Hà Thị Bích Ngọc, Trần Thị Huyền Nga (2007), "Điều tra hợp chất carotenoit
trong một số thực vật của Việt Nam", Tạp chí khoa đọc Đại học Quốc Gia Hà Nội,
Khoa học Tự nhiên và Công Nghệ, 23, tr. 130-134.
11. Phan Thành Nhân, Vũ Thị Ngọc Thảo và cộng sự (2020), "Nghiên cứu phân lập
carpain từ lá đu đủ (Carica Papaya Caricaceae)", Tạp chí khoa học Lạc Hồng, 9, tr.
001-005.
12. Nguyễn Văn Tặng, Trần Thanh Giang và cộng sự (2020), "Ảnh hƣởng của dung môi và phƣơng pháp trích ly đến khả năng chiết tách các hợp chất phenolics,
saponins và alkaloids từ vỏ quả ca cao (Theobroma Cacao L.), Tạp chí khoa học
trường Đại Học Cần Thơ, 4B, tr. 71-78 .
13. Phạm Đức Vịnh, Nguyễn Tùng Sơn và cộng sự (2018), "Nghiên cứu tác dụng của cao toàn phần lá đu đủ (Carica papay L.) trên mô hình gây giảm tiểu cầu thực