Cao chiết phân đoạn n-butanol thể hiện tác dụng chống giảm tiểu cầu mạnh mẽ và chứa tới 2,28 % hàm lƣợng các flavonoid, do đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu tác dụng chống giảm tiểu cầu của nhóm hoạt chất này. Cao chiết phân đoạn butanol đƣợc tinh chế thành cao giàu flavonoid để phục vụ thí nghiệm. Kết quả là từ cao phân đoạn butanol có nồng độ các flavonoid 2,28 %, cao giàu flavonoid đã có 11,7 % các flavonoid. Chúng tôi không tìm đƣợc nghiên cứu nào đánh giá tác dụng kích thích sinh tiểu cầu của flavonoid hay cao giàu flavonoid trƣớc đây, do vậy không có mức liều để đối chiếu cho thí nghiệm này. Nồng độ cao giàu flavonoid đƣợc dùng trong thí nghiệm này là 25 mg/kg TT, tƣơng quan với nồng độ cao chiết phân đoạn n-butanol 400 mg/kg TT về tỷ lệ phần trăm của các flavonoid.
Kết quả thí nghiệm của chúng tôi chỉ ra rằng, cao chiết giàu flavonoid từ lá Đu đủ có tác dụng chống giảm tiểu cầu ở mức liều 25 mg/kg TT. Vào ngày 6, khi số lƣợng tiểu cầu trung bình của lô bệnh lý giảm một nửa, thì lô thuốc thử giảm ít hơn đáng kể so với lô bệnh lý. Khi lƣợng tiểu cầu thấp nhất vào ngày 6 đến khi lƣợng tiểu cầu dần tăng lên vào ngày 8, số lƣợng tiểu cầu của lô thuốc thử vẫn lớn hơn có ý nghĩa so với lô bệnh lý. Đặc biệt, vào ngày 8 lƣợng tiểu cầu ở lô chuột đƣợc uống cao giàu flavonoid 25 mg/kg TT đã trở về gần bình thƣờng, tức là gần bằng với lƣợng tiểu cầu của lô này vào ngày đầu tiên. Có thể kết luận rằng, cao chiết giàu flavonoid có tác dụng chống giảm tiểu cầu tốt ở mức liều 25 mg/kg TT. So với cao toàn phần, mức liều có tác dụng của cao chiết flavonoid thấp hơn nhiều (25mg/kg TT cao giàu flavonoid so với 800 mg/kg TT cao chiết toàn phần).
Bên cạnh số lƣợng tiểu cầu, chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng chống giảm tiểu cầu của cao giàu flavonoid qua thông số thời gian chảy máu. Do ảnh hƣởng của thí nghiệm đo thời gian chảy máu trên chuột (chuột dễ bị yếu, chết khi gây mê ảnh hƣởng đến thông số số lƣợng tiểu cầu vào những ngày tiếp theo), chúng tôi không thể kiểm tra thông số thời gian chảy máu vào thời điểm tiểu cầu giảm thấp nhất (ngày 6), thời gian chảy máu đƣợc xác định vào ngày 8 khi gần kết thúc thí nghiệm. Kết quả cho thấy, cao giàu flavonoid làm giảm thời gian chảy máu trên chuột so với lô bệnh lý (thời gian chảy máu ở chuột lô bệnh lý gấp đôi lô dùng cao giàu flavonoid liều 25
43
mg/kg TT). Mặc dù thông số thời gian chảy máu không phải thông số đặc hiệu cho số lƣợng tiểu cầu, kết quả này vẫn củng cố thêm khẳng định, cao giàu flavonoid có tác dụng kích thích sinh tiểu cầu ở mức liều 25 mg/kg TT trên mô hình giảm tiểu cầu bằng CPA.
Nhƣ vậy, cao giàu flavonoid có tác dụng chống giảm tiểu cầu trên chuột ở mức liều 25 mg/kg TT. Có thể mức liều này không phải là mức liều thấp nhất có tác dụng. Cần thêm nhiều nghiên cứu để xác đinh mức liều thấp nhất thể hiện tác dụng dƣợc lý này. Hơn nữa, nếu các flavonoid đƣợc tinh chế gần nhƣ tinh khiết, mức liều cần sử dụng có lẽ còn thấp hơn nhiều. Nghiên cứu đã chỉ ra, flavonoid có trong lá Đu đủ là nhóm hoạt chất có tác dụng chống giảm tiểu cầu mà lâu nay vẫn chƣa đƣợc biết đến. Điều này đem lại tiềm năng phát triển hoạt chất có tác dụng chống giảm tiểu cầu trên ngƣời, tuy nhiên vẫn cần nhiều nghiên cứu hơn nữa về độc tính của flavonoid trên cơ thể ngƣời cũng nhƣ cơ chế tác dụng chống giảm tiểu cầu của nhóm hoạt chất này.
Vì đây là nghiên cứu đầu tiên chỉ ra flavonoid là nhóm hợp chất có trong lá Đu đủ có tác dụng kích thích sinh tiểu cầu, chƣa có nghiên cứu nào đƣợc thực hiện để dự đoán hay xác định cơ chế tác dụng của chúng. Trên một cơ thể khỏe mạnh, tiểu cầu đƣợc sản xuất từ tế bào megakaryocytes trong vòng 4 - 6 ngày [19]. Tuy nhiên, trong những nghiên cứu của chúng tôi, hiệu quả của các cao chiết có tác dụng chống giảm tiểu cầu đƣợc quan sát chỉ trong vòng 3 - 4 ngày. Mặt khác, trong trạng thái bình thƣờng, lá lách chịu trách nhiệm bắt giữ một phần ba lƣợng tiểu cầu sản xuất từ tế bào megakaryocytes, khi cơ trơn lá lách co, giải phóng một lƣợng tiểu cầu dự trữ vào tuần hoàn [37]. Mà nhựa Đu đủ đã đƣợc chứng minh gây ra các cơn co thắt tử cung ở trên chuột [46]. Do vậy, có thể đƣa ra giả thuyết rằng, tác dụng chống giảm tiểu cầu của cao toàn phần lá Đu đủ hay của cao giàu flavonoid là do cơn co thắt cơ trơn lá lách? Nhiều y văn khác lại cho rằng, tác dụng chống giảm tiểu cầu của lá Đu đủ là do tác dụng kích thích tủy xƣơng và ngăn phá hủy tiểu cầu trong máu [14], [47], [50]. Cũng có thể tác dụng này là hiệp đồng của hai cơ chế kích thích megakaryocytes sinh tiểu cầu và co thắt cơ trơn lá lách. Vì vậy, cần thêm nhiều nghiên cứu để chỉ ra cơ chế tác dụng này, chỉ có vậy tiềm năng các flavonoid từ lá Đu đủ mới có thể phát triển thành các chế phẩm điều trị các triệu chứng giảm tiểu cầu trên ngƣời do nhiều bệnh lý khác nhau, với nhiều cơ chế khác nhau gây nên.
44
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
1.Tác dụng chống giảm tiểu cầu của cao toàn phần lá Đu đủ liều 800 mg/kg TT
đƣợc khẳng định trên mô hình gây giảm tiểu cầu chuột bằng CPA qua số lƣợng tiểu cầu và thời gian chảy máu trên chuột. Tuy nhiên, cao toàn phần lá Đu đủ liều 400 mg/kg TT không thể hiện tác dụng này.
2.Cao chiết phân đoạn DCM từ lá Đu đủ liều 400 mg/kg TT không có tác dụng
chống giảm tiểu trên chuột bị giảm tiểu cầu bằng CPA. Cao chiết phân đoạn nƣớc 800 mg/kg TT không cho thấy có tác dụng chống giảm tiểu cầu trên mô hình chuột giảm tiểu cầu bằng CPA. Ngƣợc lại cao chiết phân đoạn n-butanol 400 mg/kg TT thể hiện tác dụng chống giảm tiểu cầu rõ rệt sau 3 ngày thực hiện mô hình giảm tiểu cầu bằng CPA.
3.Carpain tinh khiết (>95 %) đƣợc tinh chế từ cao chiết phân đoạn DCM lá Đu đủ
liều 2 mg/kg TT và 6 mg/kg TT không thể hiện tác dụng chống giảm tiểu cầu trên mô hình chuột giảm tiểu cầu bằng CPA.
4.Cao giàu flavonoid đƣợc tinh chế từ cao chiết phân đoạn n-butanol lá Đu đủ đã
cho thấy tác dụng chống giảm tiểu cầu tốt ở mức liều 25 mg/kg TT trên mô hình chuột giảm tiểu cầu bằng CPA. Từ đó xác đinh đƣợc một nhóm hợp chất có trong lá Đu đủ có tác dụng chống giảm tiểu cầu đó là các flavonoid.
Kiến nghị
1.Nghiên cứu ảnh hƣởng của cao giàu flavonoid hoặc flavonoid tinh khiết từ lá
Đu đủ trên cơ quan tạo huyết khối và cơ trơn lá lách để xác định cơ chế tác dụng chống giảm tiểu cầu của nhóm hoạt chất này.
45
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt
Nam, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, tr. 824-827.
2. Bộ Y tế (2015), Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị một số bệnh lý huyết học,
Nhà xuất bản Y học, tr. 134-139.
3. Bộ Y tế (2011), Hướng dẫn chẩn đoán, điều trị sốt xuất huyết Dengue.
4. Bộ Y tế (2015), Dược thư Quốc gia Việt Nam.
5. Nguyễn Việt Cƣờng, Võ Văn Lệnh (2020), "Tối ƣu hóa quy trình chiết xuất
flavonoid từ bìm ba răng (Merremia Tridentata L., Convolvulaceae)", Tạp chí
khoa học Lạc Hồng, 6, tr.006-009.
6. Đại học Y Hà Nội (2006), Tiểu cầu và bệnh xuất huyết giảm tiểu cầu, Bài giảng
Huyết học – Truyền máu sau Đại học, NXB Y học.
7. Nguyễn Công Khanh (2008), Xuất huyết giảm tiểu cầu tự phát, Huyết học lâm
sàng nhi khoa, NXB Y học.
8. Nguyễn Quốc Khang, Hà Thị Thanh Bình (1999), "Góp phần nghiên cứu một số
hoạt tính sinh học của flavonoid lá đu đủ (Carica papaya L", Tạp chí dược học, 6,
tr. 15-17.
9. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản y học, tr.
360-362.
10. Hà Thị Bích Ngọc, Trần Thị Huyền Nga (2007), "Điều tra hợp chất carotenoit
trong một số thực vật của Việt Nam", Tạp chí khoa đọc Đại học Quốc Gia Hà Nội,
Khoa học Tự nhiên và Công Nghệ, 23, tr. 130-134.
11. Phan Thành Nhân, Vũ Thị Ngọc Thảo và cộng sự (2020), "Nghiên cứu phân lập
carpain từ lá đu đủ (Carica Papaya Caricaceae)", Tạp chí khoa học Lạc Hồng, 9, tr.
001-005.
12. Nguyễn Văn Tặng, Trần Thanh Giang và cộng sự (2020), "Ảnh hƣởng của dung môi và phƣơng pháp trích ly đến khả năng chiết tách các hợp chất phenolics,
saponins và alkaloids từ vỏ quả ca cao (Theobroma Cacao L.), Tạp chí khoa học
trường Đại Học Cần Thơ, 4B, tr. 71-78 .
13. Phạm Đức Vịnh, Nguyễn Tùng Sơn và cộng sự (2018), "Nghiên cứu tác dụng của cao toàn phần lá đu đủ (Carica papay L.) trên mô hình gây giảm tiểu cầu thực
46
nghiệm bằng cyclophosphamid)", Tạp chí dược học, 58 (508), tr. 42-46.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
14. Akhter, T., Khan, M. I., & Eva, E. (2015), "Comparative evaluation of platelet augmentation activity of Carica papaya leaf juice and hydrocortisone in
thrombocytopenic rats", Bangladesh Journal of Physiology and Pharmacology,
30(2), pp. 32-40.
15. Asia W.H.O.R.O. for S.-E. (2011), Comprehensive guideline for prevention and
control of Dengue and Dengue haemorrhagic fever. Revised and expanded edition, WHO Regional Office for South-East Asia.
16. Atik N., Amrullah A.H., et Rahmadi A.R. (2018), "Guava leaf juice effect towards
number of megakaryocytes in bone marrow of thrombocytopenic mice", Universa
Medicina, 37(1), pp. 19–24.
17. Burdick E.M. (1971), "Carpaine: an alkaloid of Carica Papaya: its chemistry and
pharmacology", Economic Botany, 25(4), pp. 363–365.
18. Canini A., Alesiani D., D Arcangelo G., et al. (2007), " Gas chromatography–mass
spectrometry analysis of phenolic compounds from Carica papaya L. leaf", Journal
of Food Composition and Analysis, 20(7), pp. 584–590.
19. Choi E.S., Nichol J.L., Hokom M.M., et al .(1995), "Platelets generated in vitro
from proplatelet-displaying human megakaryocytes are functional". Blood, 85(2),
pp. 402–413.
20. Cines D.B., Bussel J.B., Liebman H.A., et al. (2009), "The ITP syndrome:
pathogenic and clinical diversity", Blood, 113(26), pp. 6511–6521.
21. Cines D.B., Liebman H. et Stasi R. (2009), "Pathobiology of secondary immune
thrombocytopenia", Semin Hematol, 46(1 Suppl 2), pp. 2-14.
22. Dharmarathna S.L.C.A., Wickramasinghe S., Waduge R.N., et al. (2013), "Does Carica papaya leaf-extract increase the platelet count? An experimental study in a
murine model", Asian Pac J Trop Biomed, 3(9), pp. 720–724.
23. Erkurt. (2012), "Thrombocytopenia in adults: review article", J Hematol.
24. Faggio C., Sureda A., Morabito S., et al. (2017), "Flavonoids and platelet
aggregation: a brief review", Eur J Pharmacol, 807, pp. 91–101.
25. George J.N. et Aster R.H. (2009), "Drug-induced thrombocytopenia: pathogenesis,
47 153–158.
26. Gubler D.J. (1998), "Dengue and dengue hemorrhagic fever", Clin Microbiol Rev,
11(3), pp. 480–496.
27. Hall J.E. và Guyton A.C. (2011), Guyton and Hall textbook of medical physiology,
Saunders/Elsevier, Philadelphia, Pa.
28. Hallund J., Bügel S., Tholstrup T., et al. (2006), "Soya isoflavone-enriched cereal
bars affect markers of endothelial function in postmenopausal women", Br J Nutr,
95(6), pp. 1120–1126.
29. Hasimun P., Suwendar, Ernasari G.I. (2014), "Analgetic activity of Papaya (Carica
papaya L.) leaves extract" Procedia Chemistry, 13, pp. 147–149.
30. Hottz E., Tolley N.D., Zimmerman G.A., et al. (2011), "Platelets in Dengue
infection", Drug Discovery Today: Disease Mechanisms, 8(1), pp. 33–38.
31. Ismail Z., Halim S.Z., Abdullah N.R., et al. (2014), "Safety evaluation of oral toxicity of Carica papaya Linn. Leaves: a subchronic toxicity study in Sprague
Dawley Rats", Evid Based Complement Alternat Med, 2014, 741470.
32. Jeong Y.-J., Choi Y.-J., Kwon H.-M., et al. (2005), "Differential inhibition of oxidized LDL-induced apoptosis in human endothelial cells treated with different
flavonoids", Br J Nutr, 93(5), pp. 581–591.
33. Jinna S. etKhandhar P.B. (2020), Thrombocytopenia. StatPearls Publishing,
Treasure Island (FL).
34. Kad DR, Tambe VS. (2018), "Phytochemical screening and evaluation of platelet
stimulating activity of carica papaya leaf ethanolic extract", Adv Plants Agric Res,
8(6), pp. 531-535.
35. Kalayanarooj S., Vaughn D.W., Nimmannitya S., et al .(1997), "Early clinical and
laboratory indicators of acute dengue illness", J Infect Dis, 176(2), pp. 313–321.
36. Kanatiwela de Silva C., Gammulle A., Ratnasooriya W., et al .(2012), "Thrombocytosis and anti-inflammatory properties, and toxicological evaluation of
Carica papaya mature leaf concentrate in a Murine model", Online International
Journal of Medicinal Plants Research.
37. Kasper, Dennis L., et al. (2015), Harrison's Principles of Internal Medicine. 19th
edition. New York: McGraw Hill Education
48
dendritic cells in a mouse model of infection", J Infect Dis, 195(12), pp. 1808–
1817.
39. Mahévas M., Chiche L., Uzunhan Y., et al. (2011), "Association of sarcoidosis and immune thrombocytopenia: presentation and outcome in a series of 20 patients",
Medicine (Baltimore), 90(4), pp. 269–278.
40. Mladenka P., Zatloukalová L., Filipský T., et al. (2010), "Cardiovascular effects of
flavonoids are not caused only by direct antioxidant activity", Free Radic Biol
Med, 49(6), pp. 963–975.
41. Navarro-Núñez L., Castillo J., Lozano M.L., et al. (2009), "Thromboxane A2
receptor antagonism by flavonoids: structure-activity relationships", J Agric Food
Chem, 57(4), pp. 1589–1594.
42. Nguyen T.T.T., Shaw P.N., Parat M.-O., et al. (2013), "Anticancer activity of
Carica papaya: a review", Mol Nutr Food Res, 57(1), pp. 153–164.
43. Nie H., Li K., Zhang X., et al. (2010), "Establishment of a mouse
thrombocytopenia model induced by cyclophosphamide", Zoological Research,
30(6), pp. 645–652.
44. Nugroho A., Heryani H., Choi J.S., et al. (2017), "Identification and quantification
of flavonoids in Carica papaya leaf and peroxynitrite-scavenging activity", Asian
Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 7(3), pp. 208–213.
45. Nurden A.T., Viallard J.-F. Nurden P. (2009), "New-generation drugs that stimulate platelet production in chronic immune thrombocytopenic purpura",
Lancet, 373(9674), pp.1562–1569.
46. Parle M. và Gurditta. (2011), "Basketful benefits of papaya", International
Research Journal of Pharmacy, 2, pp. 6–12.
47. Patil S., Shetty S., Bhide R., et al. (2013), "Evaluation of platelet augmentation
activity of Carica papaya Leaf aqueous extract in rats", Journal of Pharmacognosy
and Phytochemistry, 1, pp. 57–60.
48. Peck-Radosavljevic M. (2017), "Thrombocytopenia in chronic liver disease", Liver
Int, 37(6), pp. 778–793.
49. Jeong Y.-J., Choi Y.-J., Kwon H.-M., et al. (2005), "Differential inhibition of oxidized LDL-induced apoptosis in human endothelial cells treated with different
49
50. Purnima Bordoloi1, Diptimoyee Devi, et al. (2016), "A comparative study of the platelet augmentation potential of leaf extracts of Psidium guajava with Carica",
Sch. J. App. Med. Sci, 4(8A), pp. 2774-2782
51. Rigau-Pérez J.G. (1998), "The early use of break-bone fever (Quebranta huesos,
1771) and dengue (1801) in Spanish", Am J Trop Med Hyg, 59(2), pp. 272–274.
52. Sanghvi PK, et al. (1989), "Epidemiological studies on guinea-worm in some newly discovered villages of Jhabua District (M.P.) and test of carica papaya
leaves of guinea worm infection", Indian Journal of Medical Sciences. 1989
May;43(5), pp. 123-124.
53. Saraf M. et Kavimandan B. (2017), "Animal trials of carica papaya leaf extracts for
increasing platelet count", Indian Journal of Public Health Research &
Development, 8, pp. 782.
54. Sathasivam, K., Ramanathan, S., Mansor, S., et al. (2009), "Thrombocyte counts in
mice after the administration of papaya leaf suspension", Wien Klin Wochenschr,
121, pp. 19
55. Schmidt A.C. (2010), "Response to dengue fever--the good, the bad, and the
ugly?", N Engl J Med, 363(5), pp. 484–487.
56. Schwartz E., Mendelson E., et Sidi Y. (1996), " Dengue fever among travelers",
Am J Med, 101(5), pp. 516–520.
57. Senthilvel P., Lavanya P., Kumar K.M., et al. (2013), "Flavonoid from Carica papaya inhibits NS2B-NS3 protease and prevents Dengue 2 viral assembly",
Bioinformation, 9(18), pp. 889–895.
58. Serafini M., Peluso I., và Raguzzini A. (2010), "Flavonoids as anti-inflammatory
agents", Proc Nutr Soc, 69(3), pp. 273–278.
59. Siddique O, Sundus A, Ibrahim MF. (2014), "Effects of papaya leaves on
thrombocyte counts in dengue--a case report", The Journal of the Pakistan Medical
Association, 64(3), pp. 364-366
60. Smock K.J, Perkins S.L. (2014), "Thrombocytopenia: an update", Int Jnl Lab
Hem, 36(3), pp. 269–278.
61. Subenthiran S., Choon T.C., Cheong K.C., et al. (2013), "Carica Papaya leaves juice significantly accelerates the rate of increase in platelet count among patients