Mô hình giảm tiểu cầu qua kháng thể kháng tiểu cầu hay còn gọi là mô hình giảm tiểu cầu miễn dịch thụ động, trong đó, huyết thanh kháng tiểu cầu hay các kháng thể đơn dòng đặc hiệu với tiểu cầu đƣợc tiêm vào vật chủ, khiến chúng bị giảm tiểu cầu. Hàng loạt các mô hình này đƣợc sử dụng từ những năm 1950 để nghiên cứu các khía cạnh liên quan tới chức năng tiểu cầu, các bệnh lý giảm tiểu cầu hoặc các tƣơng tác dƣợc lý. Ngƣời ta đã sử dụng mô hình này trên hàng loạt các loài động vật nhƣ chuột, thỏ, lợn, cừu, ngựa [71]. Vào năm 1960, Rossolini đã kiểm tra hiệu quả của cortisone trong việc điều trị giảm tiểu cầu ở lợn bằng mô hình giảm tiểu cầu miễn dịch thụ động này. Những nghiên cứu nhƣ vậy đã tìm ra nhiều kiến thức liên quan đến giảm tiểu cầu miễn dịch mà hiện nay vẫn ứng dụng trong y học. Vào những năm 1980, các kháng thể đơn dòng kháng tiểu cầu ở ngƣời đầu tiên đƣợc phát triển và theo sau đó là sự phát triển các kháng thể đơn dòng kháng tiểu cầu ở bò, chó, chuột cũng phát triển theo. Điều này dẫn tới việc sử dụng kháng thể kháng tiểu cầu trong các mô hình giảm tiểu
cầu miễn dịch thụ động [71]. Ví dụ, một trong những kháng thể đơn dòng chống tiểu
cầu đầu tiên đƣợc gọi là MReg30 và kháng thể này là kháng thể đơn dòng đầu tiên đƣợc sử dụng để gây giảm tiểu cầu miễn dịch thụ động ở chuột [72]. Sau đó, MReg30 và một số kháng thể kháng tiểu cầu đơn dòng khác đã đƣợc sử dụng rộng rãi để gây giảm tiểu cầu miễn dịch thụ động [71].
20
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu
Lá Đu đủ đƣợc thu hái tại Cần Thơ. Dƣợc liệu đƣợc định danh bởi Thạc sĩ Cao Ngọc Giang, Trung tâm Sâm và Dƣợc liệu Thành Phố Hồ Chí Minh, Viện Dƣợc liệu. Mẫu nghiên cứu đƣợc lƣu trữ tại khoa Hóa Thực Vật, Viện Dƣợc liệu. Các mẫu thử bao gồm cao chiết toàn phần, cao chiết phân đoạn, carpain đã tinh chế và cao giàu flavonoid từ lá Đu đủ đƣợc chuẩn bị tại Khoa Hóa Thực Vật, Viện Dƣợc liệu. Các mẫu nghiên cứu đƣợc định lƣợng hàm lƣợng carpain và flavonoid (bảng 2.1).
TT Mẫu nghiên cứu Hàm lƣợng carpain
(%)
Hàm lƣợng flavonoid (Q+K sau thủy phân
%)
1 Cao chiết toàn phần 0,17 0,41
2 Cao phân đoạn DCM 3,30 0
3 Cao phân đoạn BuOH 1,12 2,28
4 Cao phân đoạn Nƣớc 0 0,22
5 Carpain >95 0
6 Cao giàu Flavonoid 0 11,79
Bảng 2. 1. Thành phần carpain và flavonoid của một số mẫu nghiên cứu
Cách chuẩn bị các cao chiết này nhƣ sau:
Cao chiết toàn phần:
100,0 g dƣợc liệu lá Đu đủ kích thƣớc 0,5 - 1 cm chiết hồi lƣu bằng ethanol 70 %, chiết 3 lần với thời gian chiết lần lƣợt là 2,5h; 2h; 1,5h và tỷ lệ dung môi/dƣợc liệu (thể tích/khối lƣợng; ml/g) tƣơng ứng là 10:1; 8:1; 8:1 (10/8/8). Dịch chiết 3 lần sau khi lọc đƣợc gộp chung và đem cất loại dung môi dƣới áp suất giảm và cô cách thủy thu đƣợc 27,5 g cao (hiệu suất 27,5 %). Cao chiết có độ ẩm 4,7 %, hàm lƣợng flavonoid tổng số sau thủy phân tính theo quercetin và kaempferol là 0,38 %, hàm lƣợng carpain 0,17 %.
Cao chiết phân đoạn:
3 kg lá Đu đủ kích thƣớc 0,5 - 1 cm đƣợc chiết hồi lƣu với ethanol 70 %, chiết 3 lần với thời gian chiết lần lƣợt là 2,5h; 2h; 1,5h và tỷ lệ dung môi/dƣợc liệu (thể
21
tích/khối lƣợng; ml/g) tƣơng ứng là 10:1; 8:1; 8:1. Dịch chiết ba lần sau khi lọc đƣợc
gộp chung, cất loại dung môi dƣới áp suất giảm và cô cạn trên bếp cách thủy ở 50oC
đến khi còn 3 lít dịch. Dịch chiết cô đặc đƣợc đƣa lên phễu chiết lỏng lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần là dichloromethan (DCM), n-butanol và nƣớc. Cô cạn dung môi dƣới áp suất giảm và trên bếp cách thủy, sấy trong tủ sấy chân không đƣợc lần lƣợt các cao dichloromethan (62 g, hiệu suất 2,1 %) và cao n-BuOH (56 g, 1,87 %). Cao chiết dichloromethan có độ ẩm 5 % hàm lƣợng carpain 3,3 %. Cao chiết n-BuOH có độ ẩm 4,3 %, hàm lƣợng carparin 1,12 %, hàm lƣợng flavonoid tổng số sau thủy phân tính theo quercetin và keampferol là 2,28 %.
Cao giàu flavonoid từ cao phân đoạn n-butanol
Cao chiết n-BuOH thu đƣợc từ quá trình chiết phân đoạn cao chiết ethanol 70 % lá Đu đủ đƣợc tinh chế để thu phân đoạn giàu flavonoid. Quá trình tinh chế đƣợc thực hiện nhƣ sau: 30 g cao chiết n-BuOH đƣợc phân tán trong 100 ml nƣớc, lọc loại bỏ phần không tan qua giấy lọc. Phần dịch đƣợc đƣa lên cột D101 (500 g) rửa giải lần
lƣợt với H2O, ethanol 10 %, ethanol 30 %, ethanol 50 %, thu các phân đoạn vào bình
nón 50 ml. Kiểm tra các phân đoạn bằng TLC với hệ dung môi Ethylacetat: H2O : acid (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
formic : acid acetic = 100 : 26 :11 :11, hiện màu với thuốc thử FeCl3 10 % thấy các
flavonoid tập chung chủ yếu ở phân đoạn ethanol 30 %. Các phân đoạn giàu flavonoid đƣợc gộp lại, cô cạn, sấy khô thu đƣợc 7,3 g. Phân đoạn giàu flavonoid từ cột D101 đƣợc hòa tan hoàn toàn trong MeOH đƣa lên cột sephadex LH 20, rửa giải với MeOH, thu vào các ống nghiệm 10 ml, kiểm tra bằng TLC và HPLC để thu các ống chứa flavonoid. Gộp các ống giàu flavonoid trên HPLC thu đƣợc 1,8 g phân đoạn giàu flavonoid từ lá Đu đủ (hàm lƣợng flavonoid tổng số sau thủy phân tính theo quercetin và keampferol là 11,79 %).
Carpain đƣợc tinh chế từ cao phân đoạn DCM:
Carpain đã tinh chế từ lá Đu đủ: carpain đƣợc tinh chế bởi khoa Hóa Thực Vật,
Viện Dƣợc liệu, có độ tinh khiết > 95 %.
Chuẩn bị mẫu thử:
Pha dung dịch thử: phân tán cao trong nƣớc cất đến những nồng độ thích hợp để sử dụng cho động vật uống. Liều dùng đƣợc biểu diễn theo khối lƣợng cao khô tuyệt đối. Riêng carpain tinh khiết ở dƣới dạng tinh thể, khó phân tán trong nƣớc nên cần thêm 1 - 2 giọt tween trong quá trình phân tán.
22
2.1.2. Động vật thí nghiệm
Chuột cống trắng cả hai giống đực và cái chủng Wistar, khỏe mạnh, cân nặng từ
180 - 250 g do Học viện Quân Y cung cấp. Chuột đƣợc nuôi bằng thức ăn chuẩn do Viện Vệ sinh Dịch tễ trung ƣơng cung cấp, uống nƣớc lọc.Chuột đƣợc nuôi một thời gian để thích nghi với điều kiện phòng thí nghiệm trƣớc khi tiến hành thí nghiệm. Chọn lọc chuột khỏe mạnh, cân nặng từ 180 – 250 g để tham gia nghiên cứu.
2.1.3. Hóa chất thuốc thử, thiết bị nghiên cứu
- Cyclophosphamid: cyclophosphamide monohydrat 5 gam, đạt tiêu chuẩn phân
tích, số lô sản xuất: A0412722.
- Na2EDTA
- Ethanol 70 %.
- Bơm kim tiêm, lam kính, bông
- Dao mổ y tế số 11
- Máy xét nghiệm huyết học tự động
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu
Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu
Triển khai mô hình giảm tiểu cầu trên chuột bằng CPA
Đánh giá tác dụng chống
giảm tiểu
cầu của cao
chiết toàn phần lá đu đủ trên mô hình gây giảm tiểu cầu bằng CPA Đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu
của các cao
chiết phân
đoạn lá đu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
đủ trên mô
hình gây
giảm tiểu cầu bằng CPA Đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của carpain tinh khiết từ lá đu đủ trên mô hình gây giảm tiểu cầu bằng CPA Đánh giá tác dụng chống giảm tiểu
cầu của cao
giàu flavonoid từ lá đu đủ trên mô hình gây giảm tiểu cầu bằng CPA
23
Các nghiên cứu trƣớc đây cho thấy, độc tính và mức độ giảm tiểu cầu trên chuột do CPA gây nên phụ thuộc vào liều và thời gian sử dụng. Nghiên cứu của Nur Atik (2018) sử dụng mức liều CPA là 25 mg/kg TT trong ba ngày và ghi nhân đƣợc sự giảm tiểu cầu đáng kể từ ngày 4 đến ngày 11, đặc biệt không ghi nhận chuột chết [16]. Phạm Đức Vịnh và cộng sự (2018) cũng tiến hành thăm dò đáp ứng giảm tiểu cầu gây ra bởi CPA với các mức liều 12,5 mg/kg TT, 25 mg/kg TT, 50 mg/kg TT và 100 mg/kg TT, tiêm dƣới da trong 3 ngày liên tiếp và thu đƣợc kết quả số lƣợng tiểu cầu giảm trên 90 % khi dùng CPA với liều 50 và 100 mg/kg TT, khoảng 86 % với liều 25 mg/kg TT và khoảng gần 50 % với mức liều 12,5 mg/kg TT, tuy nhiên mức liều 50 mg/kg TT và 100 mg/kg TT thể hiện độc tính đáng kể trên chuột [13]. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn mức liều CPA là 30 mg/kg TT, tiêm dƣới da hai ngày liên tiếp để gây giảm tiểu cầu khoảng 80 % (phù hợp với mức giảm tiểu cầu bệnh lý) trên chuột cho các thí nghiệm trên.
Nghiên cứu đƣợc thiết kế làm 4 đợt thí nghiệm, lần lƣợt đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của cao chiết toàn phần lá Đu đủ, các cao chiết phân đoạn lá Đu đủ, carpain và cao giàu flavonoid của lá Đu đủ trên mô hình gây giảm tiểu cầu ở chuột bằng CPA.
-Đợt 1: đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của cao chiết toàn phần lá Đu đủ
với 2 mức liều 400 mg/kg TT và 800 mg/kg TT trên chuột đã đƣợc gây giảm tiểu cầu bằng CPA.
-Đợt 2: đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của các cao chiết phân đoạn
nƣớc, n-butanol, DCM từ lá Đu đủ trên chuột đã đƣợc gây giảm tiểu cầu bằng CPA.
-Đợt 3: đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của carpain đƣợc tinh chế từ cao
chiết phân đoạn DCM trên chuột đã đƣợc gây giảm tiểu cầu bằng CPA.
-Đợt 4: đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của cao chiết giàu flavonoid
đƣợc tinh chế từ cao chiết n-butanol trên chuột đã đƣợc gây giảm tiểu cầu bằng CPA.
Đợt 1:
Đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của cao chiết toàn phần lá Đu đủ với 2 mức liều 400 mg/kg TT và 800 mg/kg TT trên chuột đã đƣợc gây giảm tiểu cầu bằng CPA.
Mặc dù các nghiên cứu hiện đại đã chứng minh lá Đu đủ có tác dụng chống giảm tiều cầu trên một số động vật, nhƣng với các dung môi chiết cao toàn phần khác nhau (cao chiết nƣớc trong nghiên cứu của Swati Patil năm 2013 [47], dịch ép toàn phần lá
24
Đu đủ trong nghiên cứu của Tansena Akhter năm 2015 [14], của Sinhalagoda năm 2013 [22]) và để xác định một lần nữa tác dụng chống giảm tiểu cầu của lá Đu đủ đƣợc thu hái tại Việt Nam, chúng tôi tiến hành đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của cao chiết cồn toàn phần lá Đu đủ trên mô hình gây giảm tiểu cầu bằng CPA. Dung môi chiết cao toàn phần đƣợc sử dụng là ethanol 70 %, một dung môi đƣợc sử dụng rộng rãi để chiết xuất các nhóm hợp chất từ thực vật.
Chuột cống trắng đƣợc chia làm 4 lô, mỗi lô 8 con cả đực và cái, bao gồm lô sinh lý, bệnh lý, cao chiết ethanol 400 mg/kg TT và ethanol 800 mg/kg TT. Chuột lô bệnh lý và hai lô cao chiết ethanol 400 mg/kg TT và ethanol 800 mg/kg TT đƣợc tiêm dƣới da CPA liều 30 mg/kg TT vào ngày thứ nhất và ngày thứ 2. Chuột lô sinh lý đƣợc tiêm nƣớc muối sinh lý với thể tích tƣơng đƣơng. Đồng thời, chuột 2 lô ethanol 400 mg/kg TT và ethanol 800 mg/kg TT đƣợc uống cao chiết toàn phần từ ngày đầu tới ngày kết thúc thí nghiệm, một lô uống với mức liều 400 mg/kg TT/lần/ngày, lô còn lại uống với liều 800 mg/kg TT/lần/ngày. Lô bệnh lý và sinh lý đƣợc cho uống nƣớc cất với thể tích tƣơng đƣơng. Trong suốt thời gian thí nghiệm, chuột đƣợc cho ăn thức ăn đầy đủ, uống nƣớc cất, vệ sinh lồng và thay trấu sạch hằng ngày để tránh nhiễm khuẩn. Tất cả chuột đƣợc lấy máu ở tĩnh mạch đùi vào ngày 0, ngày 4, ngày 6 và ngày 8 để phân tích số lƣợng hồng cầu, tiểu cầu và bạch cầu. Ngày 8, chuột đƣợc xác định thời gian máu chảy.
Đợt 2:
Đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của các phân đoạn cao chiết lá Đu đủ trên chuột đã đƣợc gây giảm tiểu cầu bằng CPA. Mục đích của việc phân lập các chất chống giảm tiểu cầu từ lá Đu đủ thông qua quá trình chiết phân đoạn là để xác định các nhóm hóa thực vật chính chịu trách nhiệm cho tác dụng đƣợc chứng minh trong cao chiết toàn phần
Chuột cống trắng đƣợc chia làm 5 lô, mỗi lô 8 con cả đực và cái, bao gồm lô 1 bệnh lý, lô 2 phân đoạn nƣớc, lô 3 phân đoạn butanol, lô 4 phân đoạn DCM, lô 5 sinh lý. Chuột lô bệnh lý và lô các cao chiết phân đoạn đƣợc tiêm dƣới da CPA liều 30 mg/kg TT vào ngày thứ nhất và ngày thứ 2. Chuột lô sinh lý đƣợc tiêm nƣớc muối sinh lý với thể tích tƣơng đƣơng. Chuột lô 2 đƣợc uống cao chiết nƣớc với liều 800 mg/kg TT/ngày, lô 3 đƣợc uống cao chiết phân đoạn butanol với liều 400 mg/kg TT/ngày, lô 4 đƣợc uống cao chiết phân đoạn DCM với mức liều 400 mg/kg TT/ngày từ ngày đầu cho tới khi kết thúc nghiên cứu. Lô 1 và lô 5 đƣợc uống nƣớc cất cùng thể tích. Trong
25
suốt thời gian thí nghiệm, chuột đƣợc cho ăn thức ăn đầy đủ, uống nƣớc cất, vệ sinh lồng và thay trấu sạch hằng ngày để tránh nhiễm khuẩn. Tất cả chuột đƣợc lấy máu ở tĩnh mạch đùi vào ngày 0, ngày 4, ngày 6 và ngày 8 để phân tích số lƣợng hồng cầu, tiểu cầu và bạch cầu. Ngày 8, chuột đƣợc xác định thời gian máu chảy.
Đợt 3:
Đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của carpain từ lá Đu đủ trên chuột đã đƣợc gây giảm tiểu cầu bằng CPA
Chuột cống trắng đƣợc chia làm 4 lô, mỗi lô 8 con cả đực và cái, bao gồm lô 1 bệnh lý, lô 2 carpain 2 mg/kg TT, lô 3 carpain 6 mg/kg TT, lô 4 sinh lý. Chuột lô 1, 2, 3 đƣợc tiêm dƣới da CPA liều 30 mg/kg TT vào ngày thứ nhất và ngày thứ 2. Chuột lô 4 sinh lý đƣợc tiêm nƣớc muối sinh lý với thể tích tƣơng đƣơng. Chuột lô 2 đƣợc uống carpain phân tán trong nƣớc với liều 2 mg/kg TT/ngày từ ngày đầu cho tới khi kết thúc nghiên cứu. Chuột lô 3 đƣợc uống carpain phân tán trong nƣớc với liều 6 mg/kg TT/ngày. Chuột lô 1 và lô 4 uống nƣớc cất cùng thể tích. Trong suốt thời gian thí nghiệm, chuột đƣợc cho ăn thức ăn đầy đủ, uống nƣớc cất, vệ sinh lồng và thay trấu sạch hằng ngày để tránh nhiễm khuẩn. Tất cả chuột đƣợc lấy máu ở tĩnh mạch đùi vào ngày 0, ngày 4, ngày 6 và ngày 8 để phân tích số lƣợng hồng cầu, tiểu cầu và bạch cầu. Ngày 8, chuột đƣợc xác định thời gian máu chảy. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đợt 4:
Đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của cao giàu flavonoid từ lá Đu đủ trên chuột đã đƣợc gây giảm tiểu cầu bằng CPA
Chuột cống trắng đƣợc chia làm 3 lô, mỗi lô 8 con cả đực và cái, bao gồm lô 1 sinh lý, lô 2 bệnh lý, lô 3 flavonoid 25mg/kg TT. Chuột lô bệnh lý và lô thuốc thử đƣợc tiêm dƣới da CPA liều 30 mg/kg TT vào ngày thứ nhất và ngày thứ 2. Chuột lô sinh lý đƣợc tiêm nƣớc muối sinh lý với thể tích tƣơng đƣơng. Chuột lô 3 đƣợc uống flavonoid với mức liều 25 mg/kg TT/ngày từ ngày đầu cho tới khi kết thúc nghiên cứu. Chuột lô 1 và lô 2 uống nƣớc cất cùng thể tích. Trong suốt thời gian thí nghiệm, chuột đƣợc cho ăn thức ăn đầy đủ, uống nƣớc cất, vệ sinh lồng và thay trấu sạch hằng ngày để tránh nhiễm khuẩn. Tất cả chuột đƣợc lấy máu ở tĩnh mạch đùi vào ngày 0, ngày 4, ngày 6 và ngày 8 để phân tích số lƣợng hồng cầu, tiểu cầu và bạch cầu. Ngày 8, chuột đƣợc xác định thời gian máu chảy.
26
Hình 2.2. Quy trình nghiên cứu
2.2.2. Xác định các thông số nghiên cứu
Thông số đánh giá: