Nghiên cứu đặc điểm thực vật, định tính, định lượng flavonoid của rễ ba loài thuộc chi puerairia dc trồng ở thái nguyên việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ DIỄM THÙY NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG FLAVONOID CỦA RỄ BA LOÀI THUỘC CHI PUERARIA DC TRỒNG Ở THÁI NGUYÊN - VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ DIỄM THÙY NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG FLAVONOID CỦA RỄ BA LỒI THUỘC CHI PUERARIA DC TRỒNG Ở THÁI NGUYÊN - VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH DƯỢC LIỆU- DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 8720206 Người hướng dẫn khoa học: TS Phạm Hà Thanh Tùng PGS TS Trần Văn Ơn HÀ NỘI, 2021 LỜI CẢM ƠN Cảm ơn học, 18 tháng vừa qua quãng thời gian có ý nghĩa nhiều em Em định Đại Học Dược Hà Nội sau nghe giảng thầy Ơn đường phát triển dược liệu Việt Nam Biết nói cho hết điều mà em nhận 18 tháng học Em xin gửi lời cảm ơn đến PGS TS Trần Văn Ơn, TS Phạm Hà Thanh Tùng người trực tiếp hướng dẫn em toàn trình thực đề tài Cảm ơn Ths Vũ Văn Tuấn - Đại học Đại Nam hỗ trợ dạy em sử dụng máy HPLC Cảm ơn Ths Nghiêm Đức Trọng, TS Hoàng Quỳnh Hoa, Ths Phạm Thị Linh Giang, Ths Lê Thiên Kim, chị Chu Thị Thoa giúp đỡ em trình làm đề tài Em cảm ơn thầy/ cô chuyên ngành Dược Liệu - Dược học cổ truyền động viên, hỗ trợ trình học tập làm đề tài Cảm ơn cô Thái Hằng, mẹ, em trai, em gái, gia đình Kh’s family, gia đình Hà Nội, DTU, anh/ chị/ bạn/ em hay gửi lời động viên, hay lắng nghe câu than thở em, ủng hộ em với việc lựa chọn theo chuyên ngành Cảm ơn Mai, nhà trường, phịng ban tạo điều kiện để em hồn thành việc học trường Em biết đề tài em hạt cát sa mạc kiến thức nỗ lực kiên trì 18 tháng nhiều người em may mắn người làm xun suốt q trình Kết khơng thể ấn tượng giả thiết em nhìn lại để có thành tựu dược liệu Việt Nam thầy cô hi sinh gần đời người Hi vọng thầy/ cô đọc luận văn em cho em góp ý chân thành để hồn thiện nghiên cứu nhỏ bé vô ý nghĩa em Em xin trân trọng cảm ơn Hà Nội, ngày 07 tháng 04 năm 2021 Học viên Trần Thị Diễm Thùy MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan chi Pueraria DC 1.1.1 Vị trí phân loại chi Pueraria DC khóa phân loại 1.1.2 Đặc điểm thực vật khóa phân loại chi Pueraria DC 1.1.3 Phân bố chi Pueraria DC giới Việt Nam 1.2 Đặc điểm thực vật loài chi Pueraria DC Việt Nam 1.2.1 Pueraria candollei var mirifica (Airy Shaw & Suvat.) Niyomdham 1.2.2 Pueraria montana (Lour.) Merr 1.2.3 Pueraria peduncularis (Benth.) Benth 1.2.4 Pueraria phaseoloides (Roxb.) Benth 1.3 Các nghiên cứu định tính, định lượng hợp chất chi Pueraria DC CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Đối tượng nghiên cứu 18 2.2 Địa điểm nghiên cứu 18 2.3 Nguyên vật liệu thiết bị 19 2.3.1 Hóa chất dung mơi 19 2.3.2 Thiết bị, máy móc, dụng cụ 19 2.4 Phương pháp nghiên cứu 20 2.4.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật 20 2.4.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 20 2.4.3 Định lượng số flavonoid phương pháp HPLC 21 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 26 3.1 Đặc điểm thực vật mẫu nghiên cứu 26 3.1.1 Đặc điểm hình thái mẫu nghiên cứu SD1 26 3.1.2 Đặc điểm hình thái mẫu nghiên cứu SD2 29 3.1.3 Đặc điểm hình thái mẫu nghiên cứu SD3 33 3.2 Đặc điểm giải phẫu Pueraria montana var chinensis (Ohwi) Sanjappa & Pradeep 35 3.2.1 Đặc điểm giải phẫu thân 36 3.2.2 Đặc điểm giải phẫu 37 3.2.3 Đặc điểm giải phẫu rễ 38 3.2.4 Đặc điểm bột rễ 39 3.3 Đặc điểm giải phẫu Pueraria alopecuroides Craib 40 3.3.1 Đặc điểm giải phẫu thân 40 3.3.2 Đặc điểm giải phẫu 41 3.3.3 Đặc điểm giải phẫu rễ 42 3.3.4 Đặc điểm bột rễ củ 43 3.4 Đặc điểm giải phẫu Pueraria candollei var mirifica (Airy Shaw & Suvat) Niyomdham 44 3.4.1 Đặc điểm giải phẫu thân 45 3.4.2 Đặc điểm giải phẫu 46 3.4.3 Đặc điểm giải phẫu rễ 47 3.4.4 Đặc điểm bột rễ 48 3.5 Định tính flavonoid dịch chiết tồn phần 49 3.5.1 Kết định tính flavonoid phản ứng hóa học 49 3.5.2 Sắc kí đồ TLC định tính flavonoid mẫu nghiên cứu 50 3.6 Kết định lượng đồng thời puerarin daidzein HPLC 51 3.6.1 Kết thẩm định phương pháp phân tích 51 3.6.2 Kết định lượng mẫu thuộc chi Pueraria DC 58 CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN 60 4.1 Về đặc điểm thực vật 60 4.1.1 Về giám định tên khoa học mẫu nghiên cứu 60 4.1.2 Về đặc điểm giải phẫu thân, lá, rễ 61 4.1.3 Về đặc điểm bột rễ 61 4.2 Về định tính flavonoid 62 4.3 Về định lượng puerarin daidzein mẫu nghiên cứu 63 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắc AOAC Tên đầy đủ Association of Official Hiệp hội nhà hóa phân tích Analytical Chemists thống CHCl3 Chloroform EtOAc Ethyl acetat EtOH Ethanol HCOOH Acid formic HNIP Hanoi Institute of Pharmacy HPLC HPTLC Diễn giải High-performance liquid chromatography High-performance thin-layer chromatography MeCN Acetonitril MeOH Methanol Phòng tiêu trường Đại học Dược Hà Nội Sắc kí lỏng hiệu cao Sắc kí lớp mỏng hiệu cao Số đĩa lí thuyết N RS Resolution Độ phân giải RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối S Diện tích pic Hệ số đối xứng SF Symmetry Factor TFA Trifluoroacetic acid TLC Thin-layer chromatography TLTK Tài liệu tham khảo tR Retention Time Thời gian lưu UV Ultraviolet Phổ tử ngoại Sắc kí lớp mỏng DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU Tên bảng biểu Bảng 1.1 Phân bố loài chi Pueraria DC Việt Nam Bảng 1.2.Các phương pháp định tính TLC, HPTLC HPLC số loài thuộc chi Pueraria DC Bảng 1.3 Các phương pháp định lượng HPTLC HPLC số loài thuộc chi Pueraria DC Trang 13 15 Bảng 2.1 Danh sách mẫu nghiên cứu 18 Bảng 2.2 Cách chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn puerarin 24 Bảng 2.3 Cách chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn daidzein 24 Bảng 2.4: Cách chuẩn bị dung dịch thử thêm chuẩn 25 Bảng 3.2: Kết định tính flavonoid phản ứng hóa học mẫu nghiên cứu Bảng 3.3 Thứ tự Rf vết sắc ký sắc ký đồ mẫu nghiên cứu Bảng 3.4 Kết đánh giá tính thích hợp hệ thống phương pháp định lượng hàm lượng puerarin daidzein rễ củ mẫu 49 50 51 Bảng 3.5 Diện tích pic dãy dung dịch chuẩn puerarin 54 Bảng 3.6 Diện tích pic dãy dung dịch chuẩn daidzein 55 Bảng 3.7 Kết xác định độ thu hồi phương pháp với puerarin 56 Bảng 3.8 Kết xác định độ thu hồi phương pháp với daidzein 56 Bảng 3.9 Kết phân tích lặp lại lần mẫu thử 57 Bảng 3.10 Kết định lượng đồng thời puerarin daidzein mẫu thử Bảng 4.1 Bảng tóm tắt hàm lượng puerarin daidzein mẫu rễ củ loài thuộc chi Pueraria DC Việt Nam giới 59 64 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Tên hình vẽ, đồ thị Trang Hình 3.1 Đặc điểm hình thái quan sinh dưỡng mẫu SD1 26 Hình 3.2 Đặc điểm hình thái hoa mẫu SD1 27 Hình 3.3 Đặc điểm hình thái mẫu SD1 28 Hình 3.4 Hình ảnh mẫu nghiên cứu SD1 loài Pueraria montana var chinensis (Ohwi) Sanjappa & Pradeep phòng tiêu Chinese Virtual 29 Herbarium Hình 3.5 Đặc điểm hình thái quan dinh dưỡng mẫu SD2 31 Hình 3.6 Đặc điểm hình thái hoa mẫu SD2 32 Hình 3.7 Đặc điểm hình thái mẫu SD2 33 Hình 3.8.Hình ảnh mẫu nghiên cứu SD2 lồi Pueraria alopecuroides Craib phịng tiêu Royal Botanic Garden Kew Hình 3.9 Đặc điểm hình thái mẫu SD3 Hình 3.10.Hình ảnh mẫu nghiên cứu SD3 lồi Pueraria candollei var mirifica phòng tiêu Royal Botanic Garden Kew Hình 3.11 Đặc điểm giải phẫu thân Pueraria montana var chinensis (Ohwi) Sanjappa & Pradeep Hình 3.12 Đặc điểm giải phẫu Pueraria montana var chinensis (Ohwi) Sanjappa & Pradeep Hình 3.13 Đặc điểm giải phẫu rễ Pueraria montana var chinensis (Ohwi) Sanjappa & Pradeep Hình 3.14 Đặc điểm bột rễ Pueraria montana var chinensis (Ohwi) Sanjappa & Pradeep 33 34 35 36 37 38 39 Hình 3.15 Đặc điểm vi phẫu thân Pueraria alopecuroides Craib 40 Hình 3.16 Đặc điểm vi phẫu Pueraria alopecuroides Craib 41 Hình 3.17 Đặc điểm vi phẫu rễ Pueraria alopecuroides Craib 43 Hình 3.18 Bột rễ củ Pueraria alopecuroides Craib 44 Hình 3.19 Đặc điểm giải phẫu Pueraria candollei var mirifica (Airy Shaw & Suvat) Niyomdham Hình 3.20 Đặc điểm giải phẫu Pueraria candollei var mirifica (Airy Shaw & Suvat) Niyomdham Hình 3.21 Đặc điểm giải phẫu rễ Pueraria candollei var mirifica (Airy Shaw & Suvat) Niyomdham Hình 3.22 Đặc điểm bột rễ Pueraria candollei var mirifica (Airy Shaw & Suvat) Niyomdham 45 47 48 49 Hình 3.23 Sắc kí đồ TLC định tính flavonoid mẫu nghiên cứu 50 Hình 3.24 Hình ảnh sắc ký đồ mẫu trắng 52 Hình 3.25 Hình ảnh sắc ký đồ dung dịch chuẩn puerarin 20μg/ml 52 Hình 3.26 Hình ảnh sắc ký đồ dung dịch chuẩn daidzein 10 μg/ml 53 Hình 3.27 Hình ảnh sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp 53 Hình 3.28 Hình ảnh sắc ký đồ dung dịch thử 53 Hình 3.29 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ puerarin 54 Hình 3.30 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ daidzein 55 Hình 4.1 Hình ảnh đặc điểm tinh bột mẫu SD1, SD2, SD3 thể cứng mẫu SD3 62 ĐẶT VẤN ĐỀ Chi Pueraria DC phân bố rộng khắp Đông Nam Á Châu Đại Dương Các bác sĩ y học cổ truyền Trung Quốc sử dụng nhiều dược liệu thuộc chi Pueraria DC điều trị dị ứng, khó tiêu, tiểu đường, đau thắt ngực, đau cổ vai gáy, chữa khát nước sốt [29] Các thành phần flavonoid thành phần hóa học bật loài thuộc chi Pueraria DC Các isoflavonoid puerarin, daidzin, daidzein chứng minh có tác dụng bảo vệ gan, điều trị bệnh tim mạch, tăng huyết áp, đái tháo đường, giảm độc ethanol Các isoflavonoid số lồi cịn chứng minh có tác dụng giảm hấp thu rượu từ đường uống, giảm rõ rệt triệu chứng gây rượu động vật thí nghiệm [29] Nổi bật số kể đến Sắn dây củ tròn (Pueraria candollei var mirifica (Airy Shaw & Suvat.) Niyomdham, lồi khơng dùng thuốc cổ truyền mà cịn có nhiều tác dụng sinh học đáng ý, nghiên cứu cho thấy nhóm isoflavonoid có tác dụng hướng estrogen mạnh Đồng thời có báo cáo thử nghiệm, chứng minh tác dụng cải thiện triệu chứng phụ nữ thời kỳ mãn kinh [23], [24], [25] Nhận thấy tác dụng sinh học quan trọng lồi thuộc chi Pueraria DC., nhóm nghiên cứu thu hái trồng số loài thuộc chi Pueraria DC Thái Nguyên Qua khảo sát bước đầu, nhóm nghiên cứu nhận thấy có ba lồi thuộc chi Pueraria DC., ngồi lồi ghi nhận tài liệu phân bố Việt Nam [5], [6], cịn có lồi hệ thực vật Việt Nam Để nghiên cứu rõ đặc điểm thực vật, thành phần hóa học, hàm lượng số flavonoid loài thuộc chi Pueraria DC Thái Nguyên, đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, định tính, định lượng flavonoid rễ ba loài thuộc chi Pueraria DC trồng Thái Nguyên – Việt Nam” thực với mục tiêu sau: Mô tả đặc điểm thực vật giám định tên khoa học ba loài thuộc chi Pueraria DC trồng Thái Nguyên, Việt Nam Định tính flavonoid rễ ba loài thuộc chi Pueraria DC phương pháp hóa học sắc kí lớp mỏng, định lượng puerarin daidzein phương pháp HPLC -UV Phụ lục 1.3 Ảnh tiêu mẫu nuớc giới Pueraria montana var chinensis (Ohwi) Sanjappa & Pradeep Mẫu SD1 MSTB: HINP/18631/21 Pueraria montana var chinensis (Ohwi) Sanjappa & Pradeep MSTB: K001121171, Royal Botanic Gardens Kew Pueraria montana var chinensis (Ohwi) Sanjappa & Pradeep MSTB: 0655871, Chinese Virtual Herbarium Pueraria montana var chinensis (Ohwi) Sanjappa & Pradeep MSTB: K000883266, Royal Botanic Gardens Kew Pueraria alopecuroides Craib Mẫu SD2 MSTB: HNIP/18630/21 Pueraria alopecuroides Craib MSTB: K000264093, Royal Botanic Gardens Kew (Mẫu type) Pueraria alopecuroides Craib MSTB: HITBC 0014004, Chinese Virtual Herbarium Pueraria alopecuroides Craib MSTB: IBSC 0192650, Chinese Virtual Herbarium Pueraria candollei var mirifica (Airy Shaw & Suvat.) Niyomdham Mẫu SD3 Pueraria candollei var mirifica (Airy Shaw & Suvat.) Niyomdham MSTB: QBG No:17533, Queen Sirikit Thái Lan Pueraria candollei var mirifica (Airy Shaw & Suvat.) Niyomdham MSTB: K000264069, Royal Botanic Gardens Kew Phụ lục 2.1 Phản ứng hóa học Phụ lục 2.2 Sắc kí dồ số hệ khảo sát CHCl3: MeOH: H2O: HCOOH 30:6:1:0,05 SD1 SD2 SD3 D CHCl3: CHCl: MeOH: H2O: HCOOH 30:6:0,25:0,05 P SD1 SD2 SD3 SD1 SD2 SD3 CHCl3: MeOH: H2O: HCOOH 30:6:0,25:0,25 CHCl3: MeOH: H2O 6:1,5:0,5 D P SD1 SD2 SD3 ... đặc điểm thực vật, định tính, định lượng flavonoid rễ ba lồi thuộc chi Pueraria DC trồng Thái Nguyên – Việt Nam? ?? thực với mục tiêu sau: Mô tả đặc điểm thực vật giám định tên khoa học ba loài thuộc. .. HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ DIỄM THÙY NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG FLAVONOID CỦA RỄ BA LOÀI THUỘC CHI PUERARIA DC TRỒNG Ở THÁI NGUYÊN - VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN... phần flavonoid định lượng vài flavonoid ba loài Pueraria DC Thái Nguyên, Việt Nam Do đó, từ tài liệu tham khảo nhóm nghiên cứu tiến hành đề tài: ? ?Nghiên cứu đặc điểm thực vật, định tính, định lượng