Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây gai kim (barleria prionitis linn)

TỔNG QUAN

Chi Hoa chông (Barleria)

Theo các tài liệu, chi Barleria được xếp vào họ Ô rô (Acanthaceae) Trong hệ thống phân loại thực vật, chi Barleria có vị trí phân loại như sau: [6], [27], [44]

Chi Barleria có khoảng 300 loài phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới Châu Phi và Châu Á, với duy nhất một loài B oenotheroides xuất hiện ở Châu Mỹ từ Mexico đến miền Bắc Nam Mỹ và Tây Phi Đông Phi có 77 loài, chủ yếu ở Ethiopia, Somalia, Djibouti, Tanzania và Kenya, trong khi Nam Phi có 69 loài, phân bố ở Namibia, Botswana, Nam Phi và Swaziland Tây Phi có 25 loài, bao gồm các nước như Senegal, Sierra Leone, Liberia, Togo, Ghana, Nigeria, Cameroon và Congo, còn Bắc Phi có 12 loài ở Egypt và Sudan Khoảng 30 loài khác xuất hiện ở Châu Á, với sự hiện diện ở Nhật Bản, Trung Quốc, Thái Lan, Việt Nam, Philippines, Sri Lanka, Malaysia và Ấn Độ.

Một số loài thuộc chi Hoa chông gồm có B merxmuelleri, B acanthoides, B heterotricha, B ventricosa agg., B lupulina, B prionitis, B albostellata, B buxifolia, …

Chi Barleria thuộc họ Ô rô (Acanthaceae) là loại cây thảo, cây bụi hoặc dây leo, có tuổi thọ lâu năm Thân cây cứng, có thể có hoặc không có gai ở nách lá Lá cây đơn, mọc đối chữ thập, với phiến lá hình trứng ngược và bề mặt có cặp nang thạch nổi lên Hoa của chi này có thể xuất hiện dưới dạng hoa đơn độc hoặc cụm hoa xim, bao gồm xim một ngả, xim hai ngả, hoặc sự kết hợp giữa xim một ngả và xim hai ngả.

3 ngả Lá bắc có nhiều hình dạng khác nhau, mép lá bắc thường nguyên hoặc có dạng gai dài Có

2 lá bắc con hình dạng gần bằng nhau hoặc hiếm khi thấy dạng lưỡng hình

Hoa lưỡng tính, mẫu 4 hoặc mẫu 5 (thường có các bộ phận tiêu giảm) Đài hoa có 4 thùy,

Hoa có hai thùy ngoài lớn hơn hai thùy bên trong và có răng Tràng hoa hình ống, chuông hoặc phễu với môi dưới teo lại Số lượng nhị thường là 2 hoặc 4, có thể có hoặc không có 2 nhị lép; bao phấn thường có 2 ô, hình thuôn hoặc gần tròn, đính trên chỉ nhị song song Bộ nhụy có bầu thượng với 2 ô, mỗi ô thường chứa 1 noãn Quả nang mang 2 hoặc 4 hạt, được đính trên móc cong.

[3], [16], [27], [44] Hạt dẹt, có nhiều hình dạng khác nhau; bề mặt thường được bao phủ bởi các sợi lông hút ẩm [7], [16], [27]

Chi Hoa chông (Barleria) chứa nhiều hợp chất hóa học quan trọng như iridoid, terpenoid, flavonoid, acid phenolic, lignin, alkaloid, phytosterol và phenylethanoid glycoside Một số loài như B buxifolia, B longiflora và B prionitis còn có chứa anthranoid Đến nay, các nghiên cứu đã tập trung vào thành phần hóa học của một số loài trong chi này, bao gồm B acanthoides.

B buxifolia, B cristata, B dinteri, B lupulina, B montana, B multiflora, B noctiflora, B prionitis, B strigosa, B trispinosa [31], [48].

Loài Barleria prionitis Linn

Loài Barleria prionitis phân bố rộng rãi ở cả Châu Á và Châu Phi, ngoại trừ Trung Mỹ Tại Châu Á, loài này có mặt ở nhiều quốc gia nhiệt đới như Ấn Độ, Malaysia, Pakistan, Philippines, Sri Lanka, Bangladesh, Lào, Việt Nam, Myanmar, Thái Lan và Yemen Ở Châu Phi, Barleria prionitis được tìm thấy tại các nước như Angola, Botswana, Ethiopia, Kenya, Malawi, Mauritius, Madagascar, Mozambique, Namibia và Réunion.

1.2.2 Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật

Barleria prionitis Linn, thuộc chi Barleria trong họ Ô rô (Acanthaceae), là một loại cây bụi lâu năm, mọc thẳng và rậm rạp, cao từ 1-2m Thân cây có màu nâu nhạt hoặc xám, với bề mặt láng và hình trụ cứng, phân nhánh nhiều Cành cây có 2-4 gai nhọn ở đáy, dài khoảng 11mm Lá cây mọc đối, có chiều dài từ 6-15cm và rộng từ 4-6cm, với mép lá nguyên và phiến lá hình bầu dục đến hình thon.

4 trứng, đầu nhọn Mặt trên có lông rải rác, mép lá có lông mịn, mặt dưới có lông mềm thưa [17],

[18], [34], [44] Cuống lá dài 0.5-3cm, ở nách lá có 2-4 gai nhọn, dài 5 – 15 mm [44]

Hình 1.1 Hình ảnh đặc điểm thực vật loài Barleria prionitis Linn [44]

(Ghi chú: a nhánh cây có hoa; b tràng hoa; c,d lá bắc; e đài hoa bên ngoài; f đài hoa bên trong; g.nhị hoa; h nhụy hoa; i quả nang; j hạt)

Hoa có màu vàng, lưỡng tính, không cuống, hình ống dài 3-4cm, phát hoa tập trung ở nách lá, tạo thành chùm dày đặc hoặc đơn độc Lá bắc thẳng hình mũi mác, dài 1-1,5cm, rộng 0,2-0,8cm, trong khi lá bắc con dài khoảng 1,4cm và rộng 0,15cm Hoa có 4 lá đài, với thùy ngoài hình xoan thuôn dài kích thước 1,5cm x 0,4cm và thùy bên trong hẹp, dạng mũi mác dài 13mm và rộng 2mm Tràng hoa màu vàng, dài 1,5cm, có lông tơ bên ngoài và nhẵn bên trong, với 2 môi và thùy hình thuôn dài Bộ nhị gồm 2 nhị sinh sản và 2 nhị lép, trong đó 2 nhị sinh sản lộ ra ngoài ống vành, còn 2 nhị lép rất ngắn; chỉ nhị màu vàng nhạt, có lông.

Cây có lá dài từ 2-2,5 cm, bao phấn màu vàng dài 3 mm Bầu noãn hình trứng với vòi nhụy dài thẳng, dính và không có lông, màu hơi hồng, mỗi buồng chứa 2 noãn Thời gian ra hoa từ tháng 8 đến tháng 10 Quả nang có hình trứng với mỏ nhọn, kích thước dài 1-2 cm và rộng 0,6-0,8 cm, chứa 2 hạt hình bầu dục thuôn dài, dẹt, dài khoảng 5-8 mm, được bao phủ bởi những sợi lông màu nâu đồng mượt.

Ethanol and methanol extracts of the entire Barleria prionitis plant contain a variety of compounds, including iridoids, alkaloids, glycosides, flavonoids, saponins, phenolics, tannins, phytosterols, steroids, carbohydrates, proteins, amino acids, and anthraquinones The water extract of the whole plant is rich in phenolic compounds, tannins, saponins, flavonoids, and phytosterols The aerial parts of the plant have been found to contain terpenoids, flavonoids, glycosides, iridoids, and phenylethanoids Additionally, the leaves of Barleria prionitis are composed of alkaloids, flavonoids, saponins, tannins, phytosterols, terpenoids, steroids, and phenolic acids, along with essential oils.

[48], không phát hiện anthranoid [29] Thành phần hóa học của hoa có flavonoid, glycoside và scutellarein -7- neohesperidosid [20]

Ngoài ra, lá và hoa của Barleria prionitis giàu chất khoáng như muối kali Hoa chứa lượng đường dưới dạng mật [6], [33]

Bảng 1.1 Một số hợp chất phân lập từ loài Barleria prionitis Linn

Nhóm hợp chất Bộ phận Tên hợp chất TLTK

Trên mặt đất apigenin–7–O–β–D–glucoside [38]

Trên mặt đất luteolin–7–O–β–D–glucoside [12]

Thân 13,14–seco–stigmasta–5,14–diene–3–α–ol [38]

Toàn cây 6-O-trans–p–coumaroyl–8–O–acetylshanzhiside methyl ester [22]

Trên mặt đất shanzhiside methyl ester [22]

Trên mặt đất acetyl barlerin [22]

Secoiridoid Trên mặt đất 7–methoxydiderroside [13]

Toàn cây 1,8 –dihydroxy–2,7–dimethyl –3,6–dimethoxy anthraquinone [30]

Toàn cây 1,3,6,8–tetra methoxy–2,7–dimethyl anthraquinone [30]

1.2.4.1 Tác dụng kháng vi sinh vật

Nghiên cứu của Kapoor và cộng sự (2014) cho thấy dịch chiết từ cây B.prionitis có khả năng ức chế nhiều loại vi khuẩn, trong đó dịch chiết ethanol đạt hiệu quả ức chế cao nhất đối với Staphylococcus aureus với vùng ức chế 12 mm và nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là 10 mg/ml Ngoài ra, dịch chiết ethanol cũng ức chế E.coli với MIC 10 mg/ml và vùng ức chế 11 mm, trong khi Salmonella typhi bị ức chế ở nồng độ 20 mg/ml Đối với Vibrio cholerae, MIC cần thiết để ức chế là 100 mg/ml.

Nghiên cứu của Patel và cộng sự (2015) cho thấy dịch chiết phân đoạn ethyl acetat từ lá có khả năng ức chế vi khuẩn gram dương Bacillus pumilus, với vùng ức chế đạt 9.83 mm và nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) xác định.

1.0mg/ml), dịch chiết phân đoạn ethyl acetat của thân có tác dụng ức chế trên vi khuẩn gram âm Pseudomonas aeruginosa (vùng ức chế 5,58 mm, MIC 2,0mg/ml) [42]

A study by Aneja et al (2010) demonstrated that ethanol, methanol, and acetone extracts from the bark of B prionitis exhibit antifungal activity against pathogenic fungal strains associated with oral infections.

Saccharomy cescerevisiae và Candida albicans [11]

1.2.4.2 Tác dụng chống oxy hóa

Năm 2011, Chetan và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu in vitro, cho thấy rằng dịch chiết ethanol và dịch chiết nước từ toàn cây B prionitis có khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ, đặc biệt là đối với các gốc tự do DPPH, ABTS, nitric oxide, khử Fe3+ và gốc hydroxyl Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng các phân đoạn chiết xuất từ cây này có tác dụng đáng kể trong việc dọn dẹp gốc tự do DPPH.

1.2.4.3 Tác dụng hạ đường huyết

Liều 200 mg/kg trọng lượng cơ thể cao chiết ethanol từ lá B.prionitis đã chứng minh hiệu quả giảm đáng kể glucose trong máu và hemoglobin glycosyl hóa, đồng thời tăng cường insulin huyết thanh lên 130% và mức glycogen trong gan lên 96,68% ở chuột mắc bệnh tiểu đường Ngoài ra, dịch chiết còn có tác dụng hỗ trợ giảm cân cho người bệnh tiểu đường.

Cao chiết từ lá, thân và rễ của Barleria prionitis, bao gồm dichloromethan, dầu hỏa và ethanol, cho thấy khả năng ức chế enzym COX1 và COX2, từ đó làm giảm tổng hợp prostaglandin, chất trung gian trong quá trình viêm và gây đau Ngoài ra, dịch chiết nước toàn cây B.prionitis cũng thể hiện hoạt tính chống viêm cấp tính trong mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan.

1.2.4.5 Các tác dụng sinh học khác

Dịch chiết methanol từ lá, thân và rễ của B prionitis có khả năng ức chế enzym AChE, với một số glycoside như barlerinoside, barlerin, acetylbarlerin, pataline và lupeol được phân lập cho thấy mức độ ức chế AChE khác nhau Ngoài ra, các hợp chất này cùng với prioniside B và prioniside C cũng thể hiện hoạt động ức chế GST, trong đó prioniside B và prioniside C được coi là những chất ức chế GST tiềm năng hơn.

Nghiên cứu của Gupta (2000) đã tiến hành thí nghiệm trên chuột nhắt trắng đực, sử dụng dịch chiết từ rễ B prionitis với liều lượng 100mg/ngày trong 60 ngày Kết quả cho thấy có sự giảm đáng kể về số lượng và khả năng di chuyển của tinh trùng.

Nghiên cứu của Maji và cộng sự (2011) cho thấy chiết xuất cồn thủy phân từ cây ở nồng độ 10 àg/ml có khả năng ức chế hợp chất 48/80, làm giảm sự phân hủy tế bào mast ở mạc treo ruột chuột lên đến 64,91% và đồng thời giảm quá trình tan hồng cầu do giảm trương lực tới 27,10%.

Theo y học cổ truyền Ấn Độ, lá Barleria prionitis có tác dụng điều trị rối loạn dạ dày, đường tiết niệu, viêm và sốt Dịch lá pha mật ong được sử dụng cho trẻ em mắc bệnh xuất tiết kèm sốt rét, trong khi dịch lá cũng giúp rửa và xoa ngăn ngừa nứt nẻ chân mùa mưa Nước ép lá kết hợp với dầu dừa hỗ trợ trị mụn nhọt, còn lá và hoa có tác dụng lợi tiểu Vỏ cây được dùng để tẩy giun và long đờm, trong khi bột rễ giúp giảm sưng và điều trị mụn nhọt Tro từ cây trộn mật ong hỗ trợ điều trị hen phế quản Lá sắc đặc có thể ngậm chữa sâu răng, hoa dùng để điều trị đau nửa đầu, áp xe, phù nề, ho ra máu, nhiễm khuẩn niệu, rối loạn sinh tinh và giảm béo phì Toàn cây có công dụng chữa tê cứng chân tay, sưng bìu tinh hoàn, đau thần kinh tọa, nhiễm trùng đường tiết niệu, vàng da, tắc nghẽn gan và cổ chướng Tại Trung Quốc, rễ cây được sử dụng chữa đau răng, ho và điều trị bệnh trĩ.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên vật liệu, thiết bị

Nghiên cứu được thực hiện với nguyên liệu từ cơ quan sinh dưỡng (rễ, thân, lá) và cơ quan sinh sản (cụm hoa) của cây Gai kim, thu hái vào ngày 20/12/2020 tại huyện Saysettha, Viêng Chăn, Lào Cây đã được xác định tên khoa học là Barleria prionitis Linn Tiêu bản thực vật hiện đang được lưu giữ tại Phòng tiêu bản cây thuốc thuộc Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược.

Dược liệu tại Hà Nội (Số hiệu HNIP/18650/22) được rửa sạch, cắt nhỏ và phơi sấy ở nhiệt độ 55°C để đạt độ ẩm dưới 10% Sau đó, dược liệu được bảo quản trong túi PE kín tại Bộ môn Dược học cổ truyền, Đại học Dược Hà Nội.

- Bản mỏng tráng sẵn pha thường silicagel F254 (Merck), pha đảo RP18 F254s (Merck), chất hấp phụ silica gel pha thường (cỡ hạt 63-200 àm, Merck), pha đảo RP-18 (30-50 àm, Merck)

- Dung môi, thuốc thử: ethanol (EtOH), n-hexan, ethyl acetat (EOA), aceton, n-butanol, dichloromethan (CH2Cl2), methanol (MeOH), nước cất (H2O)

- Các hoá chất dùng trong nghiên cứu đặc điểm thực vật: Javen, acid acetic 5%, xanh methylen, đỏ son phèn

- Các hoá chất định tính: Thuốc thử Baljet, Mayer, Dragendorff, Bouchardat, Legal,

Keddle, Liebermanm-Burchard, Diazo mới pha, FeCl3 5%, gelatin 1%,

- Kính hiển vi Nikon DS-Fi2, máy ảnh kỹ thuật số Canon, Bộ môn Thực vật - Trường Đại học Dược Hà Nội

- Sắc ký cột dựng chất hấp phụ là silica gel F254 cỡ hạt 60 - 200 àm (Merck), hạt C18

Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (HMBC) của hãng Bruker với tần số 500MHz đang được sử dụng tại Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam (VAST).

- Mỏy cụ quay 5 lớt và 20 lớt của BĩCHI, Thụy Sĩ

- Máy gia nhiệt BATHS HH-S2, BATHS HH-S4, Bộ môn Dược cổ truyền

- Máy siêu âm Elmasonic S, Bộ môn Dược cổ truyền

- Máy soi UV Vilber, Bộ môn Dược cổ truyền

- Tủ sấy Memmert, tủ sấy Shellab, tủ sấy Wiseven, Bộ môn Dược cổ truyền

- Cân phân tích Adapter, Bộ môn Dược cổ truyền

- Cân kỹ thuật Precisa, Bộ môn Dược cổ truyền

- Micropipet cỏc cỡ (0,5 àl - 1000 àl), pipet 1-20 ml, pipet paster

- Bơm RAMBOO EP-8000, Bộ môn Dược cổ truyền

- Ống đong các loại (10 – 100 ml)

- Bình cầu đáy tròn các loại (50 - 2000 ml)

- Ống nghiệm, lọ thủy tinh 100-500 ml

- Bình thủy tinh lớn 10 lít

Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu về đặc điểm thực vật

- Lẫy mẫu, mô tả đặc điểm hình thái, giám định tên khoa học

- Mô tả đặc điểm vi phẫu thân, lá

- Mô tả đặc điểm bột thân, bột lá

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hoá học

- Định tính các nhóm chất chính của lá bằng phản ứng hóa học thường quy

- Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hoá học của một số hợp chất trong lá.

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu về đặc điểm thực vật

2.3.1.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái thực vật

- Quan sát tại thực địa và mô tả đặc điểm hình thái thực vật

Lấy mẫu cây và ép tiêu bản là quy trình quan trọng trong việc giám định tên khoa học Phương pháp so sánh hình thái được áp dụng, dựa trên tài liệu thực vật phân loại loài và bộ tiêu bản online từ các phòng tiêu bản trong và ngoài nước Sự hỗ trợ từ chuyên gia phân loại thực vật là cần thiết để đảm bảo tính chính xác trong quá trình này.

2.3.1.2 Nghiên cứu đặc điểm vi học

 Đối với vi phẫu thân, phần thân được chọn là đoạn thân bánh tẻ (cách khoảng 20 – 25cm tính từ ngọn xuống ở thân chính)

Khi chọn lá, nên lấy những lá mọc cách ngọn từ 20 đến 30cm Vị trí cắt vi phẫu lý tưởng là phần phiến lá có chứa gân chính, ở khoảng 1/2 đến 1/3 phía dưới gốc lá.

Các bộ phận của thân và lá trong mẫu nghiên cứu được cắt, tẩy và nhuộm kép theo phương pháp làm tiêu bản vi học thực vật Sau đó, tiêu bản được tạo ra bằng phương pháp giọt ép Cuối cùng, vi phẫu được quan sát dưới kính hiển vi để xác định các đặc điểm vi phẫu.

Soi bột là quá trình sử dụng bộ phận đã được phơi khô và nghiền thành bột, sau đó tạo tiêu bản để quan sát dưới kính hiển vi Qua đó, người ta có thể xác định và chụp ảnh những đặc điểm của bột một cách rõ ràng.

2.3.2 Nghiên cứu về thành phần hoá học

2.3.2.1 Định tính sơ bộ các nhóm chất chính bằng phản ứng hoá học Định tính các nhóm chất chính từ phần trên mặt đất bằng phản ứng hóa học thường quy theo tài liệu [1] a Định tính anthranoid

Cân khoảng 1 g bột dược liệu và cho vào bình nón 50 ml, sau đó thêm 5 – 10 ml dung dịch acid sulfuric 1N và đun sôi Lọc dịch chiết nóng qua giấy vào bình gạn 50 ml, để nguội dịch lọc rồi thêm 5 ml cloroform và lắc nhẹ Gạn bỏ lớp nước, lấy 1 ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm, thêm 1 ml dung dịch NaOH 10% và lắc nhẹ Phản ứng dương tính sẽ xuất hiện nếu lớp kiềm có màu đỏ sim.

Trải bột dược liệu thành lớp mỏng trong chén nung nhỏ và đốt nhẹ trên đèn cồn Đậy chén bằng lam kính có miếng bông thấm nước, tiếp tục đun nóng khoảng 5 phút Sau khi lấy lam kính ra để nguội, quan sát bằng kính hiển vi sẽ thấy tinh thể hình kim màu vàng Khi nhỏ dung dịch NaOH 10% lên lam kính, dung dịch sẽ chuyển sang màu đỏ, từ đó định tính Glycosid tim.

Cân 10 gam bột dược liệu vào bình nón 250 ml, sau đó thêm 100 ml ethanol 25% và ngâm trong 24 giờ Sau khi ngâm, gạn dịch chiết vào cốc có mỏ 10 ml.

Để tiến hành thí nghiệm, đầu tiên chuẩn bị 12 ml dịch chiết chì acetat 30% và khuấy đều Sau đó, lọc dung dịch qua giấy lọc gấp nếp vào cốc dung tích 100 ml Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào ống nghiệm và thêm một giọt chì acetat Nếu có tủa xuất hiện, dừng quá trình lọc và thêm khoảng 1 ml chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy đều và lọc lại Tiếp tục thử nghiệm cho đến khi dịch lọc không còn tủa với chì acetat.

Chuyển dịch lọc vào bình gạn 125 ml và lắc kỹ với 16 ml cloroform chia thành 2 lần Sau đó, gạn dịch chiết cloroform vào cốc có mỏ và loại bỏ nước bằng natri sulfat khan Cuối cùng, chia đều dịch chiết vào 4 ống nghiệm nhỏ đã sấy khô và bốc hơi trên nồi cách thuỷ cho đến khi khô.

Cắn thu được đem tiến hành các phản ứng sau:

 Phản ứng của khung steroid

Phản ứng Liebermann – Bouchardat được thực hiện bằng cách cho 1 ml anhydrid acetic vào ống nghiệm và lắc đều cho tan Sau đó, nghiêng ống nghiệm 45° và từ từ thêm 0,5 ml H2SO4 đặc theo thành ống để tránh xáo trộn Phản ứng dương tính khi giữa hai lớp chất lỏng xuất hiện vòng màu tím đỏ, với lớp phía dưới có màu hồng và lớp trên có màu xanh lá.

 Phản ứng của vòng lacton 5 cạnh

Phản ứng Baljet được thực hiện bằng cách hòa tan mẫu cắn trong ống nghiệm với 0,5 ml ethanol 90% Sau khi lắc đều để cắn tan hoàn toàn, nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha vào ống nghiệm Phản ứng dương tính sẽ được xác định khi ống nghiệm xuất hiện màu đỏ đến tím, và cần so sánh màu sắc này với ống chứng không có cắn.

Phản ứng Legal được thực hiện bằng cách hòa tan cắn trong ống nghiệm với 0,5 ml ethanol 90% Sau đó, nhỏ 1 giọt thuốc thử natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10% vào ống nghiệm Lắc đều hỗn hợp và kiểm tra phản ứng dương tính; nếu ống nghiệm xuất hiện màu đỏ cam, điều này cho thấy sự hiện diện của cắn So sánh màu sắc với ống chứng, tức là ống không có cắn, để xác định kết quả chính xác.

 Phản ứng của phần đường

Phản ứng Keller - Kiliani được thực hiện bằng cách hòa tan cắn trong ống nghiệm với 0,5 ml ethanol 90% và lắc đều cho tan hoàn toàn Sau đó, nhỏ dung dịch FeCl3 5% trong acid acetic vào ống nghiệm và lắc đều Nghiêng ống nghiệm 45, từ từ cho 0,5 ml H2SO4 đặc theo thành ống, tránh làm xáo trộn Nếu có glycosid tim, sẽ xuất hiện vòng màu tím đỏ tại mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng Sau khi lắc nhẹ, lớp chất lỏng phía trên sẽ chuyển sang màu xanh lá.

Cân 3 gam bột dược liệu vào bình nón 50 ml, sau đó thêm 20 ml dung dịch H2SO4 1N Đun sôi hỗn hợp rồi để nguội, tiếp theo lọc dịch vào bình gạn 100 ml Cuối cùng, tiến hành kiềm hoá dịch lọc.

THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Kết quả nghiên cứu đặc điểm thực vật

3.1.1 Đặc điểm hình thái và giám định tên khoa học

Cây bụi này là loại cây sống lâu năm, cao từ 1-2m, có thân và nhánh phân nhánh nhiều Khi còn non, thân có màu xanh, nhưng khi trưởng thành sẽ chuyển sang màu nâu hoặc xám nhạt Thân cây cứng và nhẵn, có đường kính từ 1-1,5cm, với lõi bên ngoài màu xanh và bên trong màu trắng chứa mô mềm xốp Cây có 2-4 gai nhọn ở đáy cành và nhiều rễ phụ phát triển mạnh.

Hình 3.1 Hình thái và dạng sống (Ghi chú: 1 Toàn cây; 2 Cành phân nhánh ở thân; 3 Thân cắt ngang; 4 Rễ cây)

Lá đơn mọc đối, phiến lá nguyên hình bầu dục với đầu nhọn, dài từ 5-10cm, màu xanh và có lông rải rác ở mặt trên, trong khi mặt dưới có lông mềm thưa; lá già rụng để lại sẹo lồi trên thân Cuống lá dài từ 0,6-2cm và ở nách lá có 2-4 gai nhọn màu xám nhạt, dài 1-2cm Phát hoa ở đỉnh ngọn cây, tạo thành nhóm dày đặc, nhưng cũng có hoa đơn ở nách lá Hoa to, lưỡng tính, hình ống hoặc hình phễu, màu vàng, dài 2,5-3cm, không có cuống.

Từ tháng 8 đến tháng 12, cây có lá bắc thẳng hình mũi mác, dài từ 1-1,5 cm và rộng khoảng 0,1-0,8 cm, phủ lông tơ Lá đài có 4 chiếc, hình thuôn dài với kích thước 1,5 cm chiều dài và 0,4 cm chiều rộng Tràng hoa gồm 5 cánh, hình bầu dục thuôn dài, nguyên, màu vàng tươi sáng và có lông mịn bên ngoài, chiều dài tràng hoa cũng khoảng 1,5 cm.

Nhị 4 của hoa có kích thước 3cm, bao gồm 2 nhị sinh sản và 2 nhị lép; trong đó, 2 nhị sinh sản lộ ra ngoài hoa và có màu vàng nâu với lông mịn, dài từ 2 - 2,5cm Bao phấn dài 2 – 3 mm, cũng có lông và màu vàng Bầu hoa hình trứng, có 2 ô, mỗi ô chứa 2 noãn, với vòi nhụy thẳng, dài 2cm và màu trắng, không có lông Quả nang hình trứng với mỏ nhọn, dài 1,8cm, chứa 2 hạt hình bầu dục, dẹt, dài khoảng 5 mm, được bao phủ bởi sợi lông màu nâu đồng mượt.

Hình 3.2 mô tả đặc điểm của cơ quan sinh dưỡng và sinh sản, bao gồm các thành phần như cành mang hoa và lá, cụm hoa, hoa nhìn từ trên xuống và bên cạnh, tràng hoa, lá bắc, lá đài, nhụy, nhị, gai, hạt, cũng như các loại quả như quả nguyên và quả cắt ngang, cùng với thân và lá ở cả mặt trên và mặt dưới.

3.1.2 Đặc điểm vi phẫu dược liệu a Đặc điểm vi phẫu lá

Gân lá có cấu trúc đặc biệt với mặt trên và mặt dưới lồi, trong đó mặt dưới lồi hơn Từ dưới lên trên, cấu trúc gân lá bao gồm: biểu bì dưới với một lớp tế bào hình chữ nhật xếp đều, mô dày dưới gồm 2-3 lớp tế bào đa giác sát nhau, và mô mềm chiếm phần lớn diện tích với nhiều tế bào có hình dạng và kích thước khác nhau Bó libe và gỗ nằm ở giữa gân lá, với libe có nhiều tế bào dẹt xếp sít nhau và gỗ ở bên trong Ngoài ra, có thể thấy thêm hai bó libe và gỗ của gân phụ, tạo thành cấu trúc hình tròn với gỗ ở trong và libe ở ngoài.

Mô dày trên bao gồm 4 - 6 lớp tế bào, có cấu trúc tương tự như mô dày dưới, nhưng các tế bào của mô dày trên có thành dày hơn Biểu bì trên có cấu tạo giống với biểu bì dưới, không có lông che chở và lông tiết ở cả hai lớp biểu bì.

Phiến lá: có cấu tạo dị thể không đối xứng, được mô tả từ dưới lên trên gồm: biểu bì dưới

Biểu bì dưới (10) có một lớp tế bào hình chữ nhật tương đối đồng đều về hình dạng nhưng không đồng đều về kích thước, bắt màu hồng nhạt và chứa nhiều lỗ khí (8) khi quan sát dưới vật kính 40x Mô khuyết (11) phân bố rải rác với hình dạng và kích thước không đồng đều, có thể thấy mảnh mạch điểm (9) khi soi kính Mô giậu (12) nằm dưới biểu bì trên (13) gồm một hàng tế bào hình que sắp xếp đều đặn, bắt màu hồng và chứa các hạt diệp lục Biểu bì trên (13) có một lớp tế bào bắt màu hồng, với kích thước lớn hơn so với tế bào biểu bì dưới, và có hình dạng cũng như kích thước đồng đều Nhóm nghiên cứu đã thực hiện đo đếm trên kính hiển vi và tính toán chuyển đổi số liệu ra đơn vị thông qua trắc vi vật kính, kết quả được trình bày trong Bảng 3.1.

Bảng 3.1 Kết quả phân tích giải phẫu lá của cây Gai kim

Chỉ tiờu giải phẫu lỏ (àm)

BBT MD MK BBD BDL Tỷ lệ MD/MK

( Ghi chú: BBT : Biểu bì trên, MD: Mô giậu, MK: Mô khuyết, BBD: Biểu bì dưới, BDL: Bề dày lá, MD/MK: tỷ lệ mô giậu trên mô khuyết)

Trong điều kiện ánh sáng khác nhau, đặc điểm hình thái và giải phẫu lá thay đổi rõ rệt Lá sống trong môi trường ánh sáng yếu thường mỏng, mềm và có màu xanh sẫm, trong khi lá ở nơi có ánh sáng đầy đủ thường dày, tiết diện thu nhỏ và có màu xanh lục nhạt Cụ thể, lá cây Gai kim có màu xanh sẫm, mềm và mỏng với bề dày khoảng 85,91 mm, cho thấy nhu cầu ánh sáng không cao của loài cây này Tỷ lệ mô giậu và mô khuyết cũng phản ánh nhu cầu ánh sáng của cây; ở những cây ưa sáng, mô giậu phát triển mạnh với 2-3 hoặc nhiều hơn lớp tế bào, bên trong chứa nhiều lục lạp.

Mô giậu là mô quang hợp chính cho cây, đặc biệt ở những cây chịu bóng, tỷ lệ mô giậu/mô khuyết thường nhỏ hơn 1 Cụ thể, ở cây Gai kim, tỷ lệ này là 0,71, cho thấy cây này có khả năng chịu bóng Dựa vào đặc điểm giải phẫu lá và hình thái của Gai kim, có thể khẳng định đây là loài cây ưa bóng.

Hình 3.3 mô tả đặc điểm vi phẫu của phiến lá, trong đó bao gồm các thành phần chính như gân lá với biểu bì dưới, mô dày góc dưới, mô mềm vỏ, libe, gỗ, mô dày góc trên và biểu bì trên Bên cạnh đó, phiến lá cũng có các yếu tố quan trọng như lỗ khí, mảnh mạch điểm, biểu bì dưới, mô khuyết và mô giậu Những cấu trúc này đóng vai trò quan trọng trong quá trình quang hợp và trao đổi khí của cây.

Biểu bì trên) b Đặc điểm vi phẫu thân

Vi phẫu tiết diện tròn bao gồm nhiều lớp cấu trúc, bắt đầu từ lớp bần (1) với các tế bào hình chữ nhật, có vách dày hoá cutin xếp thành một lớp xuyên tâm, thể hiện màu xanh khi nhuộm Dưới lớp bần là một

Lớp lục bì gồm 2 lớp tế bào mỏng, hình chữ nhật, xếp thẳng hàng và bắt màu hồng Mô dày góc có từ 2-5 lớp tế bào dày, hình đa giác tròn, kích thước không đồng đều, xếp lộn xộn và bắt màu hồng đậm Mô mềm vỏ bao gồm nhiều tế bào mỏng, hình đa giác, kích thước khác nhau, vách mỏng và xếp lộn xộn Libe sơ cấp được sắp xếp thành dải không liên tục, gồm các tế bào mỏng bị ép dẹp, không rõ hình dạng, bắt màu hồng đậm và xếp hàng xuyên tâm, ngăn cách mô mềm vỏ ngoài và mô mềm vỏ trong.

Libe thứ cấp gồm nhiều lớp tế bào hình chữ nhật, bắt màu hồng đậm và kích thước không đều, được sắp xếp sát nhau Tầng phát sinh libe-gỗ chỉ có một lớp tế bào với hình dạng khó quan sát, nằm giữa libe và gỗ thứ cấp Gỗ thứ cấp bao gồm nhiều mạch gỗ có kích thước không đều, hình đa giác gần tròn hoặc tròn, được bao quanh bởi mô mềm gỗ và sắp xếp thành dãy Gỗ sơ cấp tập trung thành cụm với hình dạng đa giác, trong khi mô mềm ruột nằm ở trung tâm, có các tế bào thành mỏng, hình đa giác, kích thước không đều và xếp xen kẽ nhau tạo ra những khoảng gian bào.

Hình 3.4 Đặc điểm vi phẫu thân

Bột dược liệu từ lá có những đặc điểm nổi bật như cấu trúc mô bần và lục bì, mô dày góc, cùng với các loại mô mềm vỏ ngoài và vỏ trong Ngoài ra, bột lá còn chứa libe sơ cấp và libe thứ cấp, cùng với tầng phát sinh libe-gỗ Gỗ thứ cấp và gỗ sơ cấp cũng góp phần vào tính chất của bột, trong khi mô mềm ruột tạo ra những đặc tính riêng biệt cho sản phẩm.

Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học

3.2.1 Định tính các nhóm hợp chất bằng phương pháp hóa học

Nhóm nghiên cứu đã thực hiện các phản ứng hóa học để xác định thành phần hóa học của dịch chiết lá, phát hiện các nhóm chất như alkaloid, flavonoid, coumarin, saponin, tanin, iridoid glycoside, sterol, triterpenoid, đường khử và acid amin Kết quả định tính các nhóm chất này được trình bày chi tiết trong Bảng 3.2.

Bảng 3.2 Phản ứng định tính các nhóm chất trong lá mẫu nghiên cứu

Nhóm chất Phản ứng Kết quả Kết luận

Phản ứng của Khung steroid -

Phản ứng với thuốc thử Mayer +

Phản ứng với thuốc thử Dragendorff + Có Phản ứng với thuốc thử Bouchartdat +

Phản ứng với Kiềm + Có

Phản ứng với dung dịch FeCl3 5% +

Phản ứng đóng mở vòng Lacton +

Phản ứng với dung dịch FeCl3 5% +

Có Phản ứng với dung dịch Chì acetat 10% +

The reaction of a 1% gelatin solution with iridoid glycosides was positive, indicating the presence of these compounds Additionally, the presence of sterol-triterpenoids was confirmed through a reaction with the Liebermann-Burchard reagent Furthermore, the presence of reducing sugars was also verified by a positive reaction with Fehling's solution.

Acid hữu cơ Phản ứng với Na2CO3 - Không có

Acid amin Phản ứng với thuốc thử Ninhydrin + Có

Carotenoid Phản ứng với H2SO4 - Không có

Polysaccharid Phản ứng với thuốc thử Lugol - Không có

Tinh dầu Mùi thơm đặc trưng của tinh dầu - Không có Chất béo Phát hiện vết chất béo trên giấy - Không có

Ghi chú: (-) phản ứng âm tính (+) phản ứng dương tính

3.2.2 Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ lá cây Gai kim

Lá được nghiền thô và ngâm chiết với ethanol 96% theo tỷ lệ 4 kg dược liệu với 8 lít ethanol 96% trong ba lần, ở nhiệt độ 45°C Sau quá trình chiết siêu âm kéo dài 30 phút cho mỗi lần, dung dịch được lọc và cất thu hồi dung môi, tạo ra cao toàn phần với khối lượng 100,4 g Cao toàn phần sau đó được hòa với nước cất và tiến hành chiết phân đoạn bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, ethyl acetat và n-butanol, thu được cao n-hexan 60,18 g, cao ethyl acetat 13,46 g và dịch nước.

Phân đoạn EtOAc (13,46 g) được tách qua cột sắc ký silica gel (3 x 60 cm) và rửa giải bằng hệ dung môi dichloromethan-methanol với tỷ lệ 100:1, 80:1, 50:1, 20:1, 10:1, 5:1, 1:1 v/v, thu được 10 phân đoạn (EG1 – EG10) Tiếp theo, phân đoạn EG3 (1,35 g) được xử lý qua cột sắc ký silica gel (2 x 60 cm) với dung môi dichloromethan-methanol (80:1, 60:1, 40:1, 0:1 v/v), tạo ra 5 phân đoạn (EG3-1 – EG3-5) Cuối cùng, phân đoạn EG3-3 (0,49 g) được tinh chế bằng cột pha thường (2 x 45 cm) với silica gel, rửa giải bằng hệ dichloromethan-methanol (50:1 v/v) và gộp các lọ có vết tương tự trên sắc ký lớp mỏng, thu được hợp chất 1.

Hình 3.7 Sơ đồ chiết xuất và phân lập hợp chất từ lá cây Gai kim

3.2.3 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được

Hợp chất 1 (GE1) được thu nhận dưới dạng bột màu trắng, với phổ 1 H-NMR cho thấy tín hiệu của 7 nhóm methyl tại các độ chuyển dịch δH (ppm) 0,89; 0,94; 0,94; 0,96; 0,98; 1,24; 1,28, đặc trưng cho khung oleanan Ngoài ra, tín hiệu doublet-doublet của một proton ở δH (ppm) 3,37 và triplet của vinyl proton ở δH (ppm) 5,38 tương ứng với hydro gắn với C-18 và C-12, chỉ ra sự hiện diện của khung olea-12-en Phổ 13 C-NMR cũng cho thấy tín hiệu tại vị trí 180,1, tương ứng với nhóm carboxyl ở carbon số 28 So sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác nhận hợp chất 1 là acid oleanolic (C30H48O3).

Bảng 3.3 So sánh dữ liệu NMR của hợp chất 1 (GE1) với tài liệu tham khảo

Hợp chất 1 (GE1) (CD3OD)

Acid oleanolic (CD3OD) [43] δH (ppm) ( J , Hz) δC

Phổ 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD)

Hình 3.8 Công thức cấu tạo của hợp chất 1

Bàn luận

3.3.1 Về đặc điểm thực vật a Về đặc điểm hình thái và giám định tên khoa học

Chi Hoa chông (Barleria) trên thế giới có khoảng 300 loài, trong đó Việt Nam có khoảng 4 loài như Barleria prionitis, Barleria cristata, Barleria lupulina và Barleria strigosa được sử dụng trong y học cổ truyền Tuy nhiên, nghiên cứu về đặc điểm thực vật của các loài này vẫn còn hạn chế Loài Gai kim, thu hái tại huyện Viêng Chăn, Lào, đã được xác định với tên khoa học là Barleria prionitis thông qua nghiên cứu phân loại và so sánh với các mẫu tiêu bản của chi này.

Barleria và sự giúp đỡ của các chuyên gia tại Bộ môn Thực vật - Trường Đại học Dược Hà

Cây bụi này là loại cây sống lâu năm, cao từ 1-2m, với thân và nhánh có màu xanh khi còn non và chuyển sang màu nâu hoặc xám nhạt khi già Thân cây cứng, nhẵn, có đường kính từ 1-1,5cm, với lõi bên ngoài màu xanh và bên trong màu trắng chứa mô mềm xốp Đặc biệt, ở đáy cành có 2-4 gai nhọn dài khoảng 11mm Lá cây đơn, mọc đối, có phiến lá nguyên hình bầu dục, đầu nhọn, dài từ 5-10cm và có màu xanh với lông rải rác trên bề mặt.

Lá có chiều dài từ 34cm, với mặt trên nhẵn và mặt dưới phủ lông mềm thưa Cuống lá dài từ 0,6 đến 2cm, và ở nách lá có từ 2 đến 4 gai nhọn, dài khoảng 1 đến 2cm, mang màu xám nhạt, tương tự như mô tả trong tài liệu tham khảo [44].

Hoa phát triển ở đỉnh ngọn cây, thường mọc thành từng nhóm dày đặc, bên cạnh đó cũng có hoa đơn xuất hiện ở nách lá Hoa có kích thước lớn, lưỡng tính, hình dạng ống hoặc phễu, màu vàng rực rỡ, dài từ 2,5 đến 3cm và không có cuống.

Lá cây có hình mũi mác, dài từ 1-1,5 cm và rộng 0,1-0,8 cm, với các lông tơ Lá đài có 4 chiếc, hình thuôn dài, dài 1,5 cm và rộng 0,4 cm Tràng hoa có 5 cánh, hình bầu dục thuôn dài, màu vàng tươi sáng, với lông mịn bên ngoài, dài từ 1,5-3 cm Nhị gồm 4 phần, trong đó có 2 nhị sinh sản lộ ra ngoài và 2 nhị lép ngắn Chỉ nhị màu vàng nâu, dài 2-2,5 cm, có lông mịn Bao phấn dài 2-3 mm, màu vàng và có lông Bầu hình trứng, có 2 ô với mỗi ô chứa 2 noãn; vòi nhụy thẳng, không lông, dài 2 cm và màu trắng Quả nang hình trứng với mỏ nhọn, dài 1,8 cm, chứa 2 hạt hình bầu dục, dẹt, dài khoảng 5 mm, được bao phủ bởi lông màu nâu đồng.

Nghiên cứu hình thái, đặc điểm vi phẫu và bột thân, lá của cây Gai kim đã hoàn thiện cơ sở dữ liệu về đặc điểm thực vật của loài này, đồng thời nâng cao nhận thức, phân biệt và xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cho dược liệu.

3.3.2 Về thành phần hoá học

Khóa luận tập trung nghiên cứu thành phần hóa học của lá cây Gai kim (Barleria prionitis Linn), bộ phận được sử dụng trong y học dân gian để điều trị nhiều bệnh như rối loạn tiêu hóa, bệnh đường tiểu, sổ mũi, sốt ở trẻ em, nổi mụn, đau răng, trĩ và đắp vết thương Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của phần trên mặt đất và toàn bộ cây, nhưng nghiên cứu về lá cây Gai kim vẫn còn hạn chế, đặc biệt là ở Việt Nam Do đó, khóa luận này nhằm làm rõ các thành phần hóa học có tác dụng sinh học, tập trung vào việc định tính các nhóm chất trong lá cây Gai kim.

Dựa trên tài liệu tham khảo và bài giảng dược liệu, khoá luận đã thực hiện định tính các nhóm chất như anthranoid, glycosid tim, alkaloid, flavonoid, coumarin, saponin, tanin, iridoid glycoside, sterol-triterpenoid, đường khử, acid hữu cơ, acid amin, carotenoid, polysaccharid, tinh dầu và chất béo thông qua phản ứng hóa học Kết quả cho thấy thành phần hóa học của lá loài.

Barleria prionitis chứa nhiều nhóm chất như alkaloid, flavonoid, coumarin, saponin, tanin, iridoid glycoside, sterol - triterpenoid, đường khử và acid amin Hầu hết các kết quả phân tích đều nhất quán với các nghiên cứu trước đây Tuy nhiên, dịch chiết không phát hiện tinh dầu, điều này khác với thông tin trong tài liệu mô tả rằng loài này có chứa tinh dầu.

[48] b Về chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất

 Về phương pháp chiết xuất cao toàn phần và cao phân đoạn

Dược liệu được chiết xuất bằng dung môi ethanol 96% là phương pháp phổ biến, nhờ vào khả năng hòa tan chọn lọc nhiều nhóm hoạt chất Ethanol có nhiệt độ sôi thấp, giúp dễ dàng thu hồi dung môi, đồng thời hạn chế sự phân hủy của các hoạt chất và ít độc hại cho sức khỏe.

Trong quá trình chiết xuất dược liệu, việc sử dụng siêu âm trước khi lọc nóng giúp tạo ra sóng siêu âm, tạo áp lực lên tế bào và làm chúng vỡ ra, từ đó giải phóng các chất có lợi Siêu âm cũng tăng cường sự xáo trộn của dược liệu, thúc đẩy quá trình khuếch tán chất tan vào dung môi, qua đó nâng cao hiệu quả chiết xuất.

 Về phương pháp phân lập các hợp chất

Khóa luận đã chọn phân đoạn EtOAc để phân lập các hợp chất dựa trên tài liệu tham khảo cho thấy hợp chất chính thường tập trung tại đây Kết quả khảo sát bằng sắc ký lớp mỏng cho thấy phân đoạn EtOAc có các vết rõ nét và tách biệt Kỹ thuật sắc ký cột được sử dụng để phân lập các hợp chất từ phân đoạn EtOAc của dịch chiết ethanol từ lá Barleria prionitis Linn, với chất nhồi cột là silica gel và RP-C18 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H NMR, 13C NMR) được áp dụng và so sánh với dữ liệu đã công bố trước đó Kết quả phân lập thu được hợp chất acid oleanolic (GE1), thuộc nhóm triterpenoid khung olean, là hợp chất phổ biến trong dược liệu dưới dạng acid tự do hoặc phần aglycol trong các saponin triterpenoid Kết quả này phù hợp với nghiên cứu trước về thành phần hóa học của Barleria prionitis Linn.

Phân đoạn ethyl acetat từ dịch chiết cloroform của lá đã xác định được các hợp chất terpenoid, alkaloid, flavonoid, saponin và phenol, chứng minh tác dụng dược lý của lá cây như bảo vệ gan, chống ung thư, chống viêm, chống oxy hóa, kháng khuẩn và chống đái tháo đường Acid oleanolic đã được xác định và phân lập từ dịch chiết toàn cây của Barleria cristata, và đây là lần đầu tiên hợp chất này được phân lập từ Barleria prionitis, góp phần bổ sung vào cơ sở dữ liệu về hóa thực vật của loài.

Barleria prionitis nói riêng và chi Barleria nói chung