Microsoft Word Khoaluancuoi docx ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC ĐỖ MINH HIẾU NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA TINH DẦU LOÀI VƯƠNG TÙNG (MURRAYA GLABRA (GUILLAUMIN) SWING[.]
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC ĐỖ MINH HIẾU NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA TINH DẦU LOÀI VƯƠNG TÙNG (MURRAYA GLABRA (GUILLAUMIN) SWINGLE) THU HÁI Ở SƠN LA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC Người thực hiện: Đỗ Minh Hiếu NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA TINH DẦU LOÀI VƯƠNG TÙNG (MURRAYA GLABRA (GUILLAUMIN) SWINGLE) THU HÁI Ở SƠN LA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (NGÀNH DƯỢC HỌC) Khóa : QH2015.Y Người hướng dẫn : PGS TS Phạm Thanh Huyền PGS TS Đinh Đoàn Long Hà Nội – 2020 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận này, may mắn nhận nhiều giúp đỡ quý báu vật chất, tinh thần thầy cô, bạn bè Lời đầu tiên, xin bày tỏ kính trọng lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Đinh Đồn Long - Phó Chủ nhiệm Khoa Y dược (Đại học Quốc gia Hà Nội), PGS.TS Phạm Thanh Huyền - Trưởng Khoa Tài nguyên dược liệu (Viện Dược liệu), người thầy cô trực tiếp hướng dẫn tơi, dạy tận tình suốt q trình thực nghiên cứu hồn thành khóa luận Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Phạm Thị Ngọc, ThS Nguyễn Quỳnh Nga cán Khoa Tài nguyên dược liệu (Viện Dược liệu) giúp đỡ, hỗ trợ tơi q trình làm khóa luận Trong q trình học tập làm việc đây, tơi học tập tích lũy nhiều kiến thức, kinh nghiệm truyền cảm hứng tình yêu, niềm say mê nhiệt huyết với công tác nghiên cứu thuốc.Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Bộ môn Y Dược học sở đặc biệt ThS Phạm Thị Hồng Nhung hết lòng quan tâm, giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho tơi thực nghiên cứu hồn thành khóa luận tốt nghiệp Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn yêu thương đến gia đình, người thân bạn bè, người ln bên cổ vũ, động viên tạo điều kiện giúp đỡ thời gian học tập thực đề tài khóa luận Hà Nội, ngày 09 tháng 06 năm 2020 Tác giả Đỗ Minh Hiếu DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Viết đầy đủ GC-MS Gaschromatography – mass spectrometry (sắc ký khí kết hợp khối phổ) M glabra Loài Vương Tùng (Murraya glabra) DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Bảng 2.1: Chương trình nhiệt độ Bảng 3.1: Kết phân tích tinh dầu Trang 20 30-31 Vương tùng DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang Hình 1.1: Cấu trúc số thành phần thường gặp tinh dầu chi Murraya Hình 1.2: Tổng quát Vương tùng 12 Hình 1.3: Một số hợp chất tinh dầu Vương tùng 13 Hình 1.4: Phân bố Vương tùng Việt Nam 14 Hình 2.1: Bộ dụng cụ cất tinh dầu 19 Hình 3.1: Hình thái chung Vương tùng (Murraya glabra (Guillaumin) Swingle) 21 Hình 3.2 Lá kép Vương tùng (Mặt (A), Mặt (B)) 22 Hình 3.3: Các dạng chét Vương tùng (Murraya glabra (Guillaumin) Swingle) (Mặt (A), Mặt (B)) Hình 3.4: Gân chét mặt (A); mặt (B) 22 Hình 3.5: Lỗ tiết tinh dầu bề mặt lá, Mặt (A), Mặt (B) 23 10 22 11 Hình 3.6: Lỗ tiết tinh dầu mép lá, Mặt (A), Mặt (B) 23 12 Hình 3.7: Cuống 23 13 Hình 3.8: Chùm hoa cấp (A), cấp (B), bơng hoa (C) 24 14 Hình 3.9: Giải phẫu hoa (Mặt (A), Mặt (B)) 24 15 Hình 3.10: Nhị vịng (A), nhị vịng ngồi (B) 24 16 Hình 3.11: Chùm non 25 17 Hình 3.12: Mặt cắt ngang non (A), Hạt (B) 25 18 Hình 3.13: Vi phẫu Vương tùng 26 19 Hình 3.14: Phần gân 26 20 Hình 3.15: Phần phiến 27 21 Hình 3.16: Vi phẫu thân Vương tùng 28 22 Hình 3.17: Vi phẫu thân Vương tùng phóng to 28 23 Hình 3.18: Vi phẫu rễ Vương tùng 29 24 Hình 3.19: Vi phẫu rễ phóng to 30 25 Hình 3.20: Kết sắc ký khí Vương tùng 30 26 Hình 3.21: Một số thành phần chủ yếu tinh dầu Vương tùng Murraya glabra (Guillaum.) Swingle 31 Mục lục ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1.Tình hình nghiên cứu giới 1.1.1.Chi Murraya 1.1.2.Cây Vương tùng - Murraya glabra (Guillaumin) Swingle 1.2.Tình hình nghiên cứu Việt Nam 10 1.2.1.Chi Murraya 10 1.2.2.Các nghiên cứu loài Vương tùng - Murraya glabra (Guillaumin) Swingle 11 1.3.Giới thiệu phương pháp sắc ký khí khối phổ 14 1.3.1.Nguyên tắc 14 1.3.2.Ứng dụng kiểm nghiệm tinh dầu 14 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1.Vật liệu nghiên cứu 16 2.1.1.Đối tượng nghiên cứu 16 2.1.2.Hóa chất sử dụng 16 2.1.3.Thiết bị sử dụng 16 2.2.Nội dung nghiên cứu 16 2.3.Phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1.Phương pháp khảo cứu, kế thừa tài liệu 17 2.3.2.Phương pháp hình thái so sánh 17 2.3.3.Phương pháp nghiên cứu giải phẫu 17 2.3.4.Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học 18 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 21 3.1.Xác định tên khoa học loài Vương tùng thu hái Sơn La 21 3.2.Đặc điểm hình thái 21 3.3.Đặc điểm giải phẫu 26 3.3.1.Lá 26 3.3.2.Thân 28 3.3.3.Rễ 29 3.4.Thành phần hóa học tinh dầu 30 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33 4.1.Kết luận 33 4.2.Kiến nghị 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nước có khí hậu nóng ẩm mưa nhiều Đây điều kiện thuận lợi cho loài thực vật sinh trưởng phát triển, tạo nên thảm thực vật vô phong phú đa dạng với nhiều ứng dụng lĩnh vực Đặc biệt số họ Cam với gần 30 chi, 140 loài trải rộng khắp Việt Nam Các họ không mọc hoang mà cịn trồng để lấy như: Cam, bưởi, quýt, chanh, … hay làm cảnh Cam canh, quất, … làm gia vị hồng bì, sẻn, chanh, … Đặc biệt có số loài thường dùng làm thuốc ba chạc, bưởi, chanh, hoàng bá, kim sương, phật thủ, cửu lý hương, … Trong số chi thuộc họ Cam, có chi biết đến với với khả chiết suất tinh dầu cao từ Đặc biệt Murraya Glabra, hay gọi Vương tùng Từ năm 1965, cụ Đào Đình Khuê sử dụng tinh dầu Vương tùng để chữa cảm mạo, sốt rét, đau nhức Không thế, tinh dầu Vương tùng cịn có cơng thức cao xoa Lam Sơn (Cơng ty dược phẩm Thanh Hóa) dầu xoa Thăng Long xuất (Viện Dươc liệu Xí nghiệp dược phẩm trung ương kết hợp sản xuất) Cho đến nay, loài ghi nhận phân bố Việt Nam Tuy có nhiều ứng dụng Vương tùng chưa nghiên cứu cách cụ thể Vì chúng tơi thực hiên đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật thành phần hóa học tinh dầu loài Vương tùng (Murraya glabra (Guillaumin) Swingle) thu hái Sơn La” nhằm mục đích: Xác định đặc điểm hình thái đặc điểm vi phẫu Vương tùng (Murraya glabra (Guillaumin) Swingle Xác định thành phần hóa học tinh dầu Vương tùng (Murraya glabra (Guillaumin) Swingle CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tình hình nghiên cứu giới 1.1.1 Chi Murraya 1.1.1.1 Vị trí phân loại Qua nghiên cứu tài liệu [2, 41, 47, 58] chi Murraya, tác giả thống xác định vị trí phân loại chi Murraya theo hệ thống phân loại A Takhtajan (1997) [46] sau: Giới Thực Vật (Plantae) Ngành Thực Vật Hạt Kín (Magnoliophyta) Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) Phân Lớp Hoa Hồng (Rosidae) Bộ Cam (Rutales) Họ Cam (Rutaceae) Chi Murraya 1.1.1.2 Đặc điểm thực vật Theo tác giả Dianxiang Zhang Thomas G Hartley trình bày Thực vật chí Trung Quốc [53] tài liệu đầy đủ chi Murraya nay, chi Murraya mô tả J Koenig ex Linnaeus vào năm 1771, có đặc điểm chung sau: Cây gỗ nhỏ nhỡ, khơng có gai, khơng có lơng tơ hay vảy ngọn, chồi nách cụm hoa non Lá mọc so le, kép lông chim lẻ Cụm hoa ở nách, kiểu chùm kép cắt giảm thành xim hai ngả xim ngả Hoa lưỡng tính, hình bầu dục tới hình trứng nụ Đài 5, rời hàn liền đến nửa chiều dài chúng Tràng hoa 5, tiền khai hoa kiểu vặn lợp Nhị từ đến 10, rời, không giống chiều dài, nhị mảnh mảnh, thẳng khơng thẳng Đĩa hình nhẫn, phồng lên hình cột Bộ nhụy 2-5 nỗn, hàn liền, vách ngăn thẳng từ trung tâm trở ra, nỗn chứa 1-2 nỗn Vịi nhụy 3-7 cho bầu nhụy, rụng đồng loạt rụng không hết tạo Quả mọng với thịt nhầy, khơng có khoảng trống quả, vỏ mọng nước Hạt có lớp vỏ mỏng dầy, nội nhũ ít, mầm thẳng, mầm hình elip, bên lồi 50% tinh dầu hợp chất sesquiterpene phong phú, đáng ý t-caryophyllene y-elemene Ngược lại, ba loài từ phân chi Murraya cho loại dầu chủ yếu hoàn toàn Sesquiterpene Hợp chất (30%) từ M alata xác định l-gurjunene 50% dầu M exotica caryophyllene Tinh dầu từ M paniculata chứa y-elemene thành phần (30%) với nerolidol t-caryophyllene đóng góp 10% [29] Nghiên cứu cho thấy thành phần dễ bay chi Murraya cung cấp đặc điểm hóa học khác để phân biệt phân chi chi Năm 2015, Chun-xue You cộng sử dụng phương pháp sắc ký khí khối phổ để xác định số thành phần tinh dầu chi Murraya (trong bao gồm Murraya tetramera, Murraya euchrestifolia, Murraya koenigii, Murraya kwangsiensis, Murraya exotica, Murraya alata) nghiên cứu Từ mẫu cành mang chúng, thu hái tỉnh Quảng Tây Vân Nam Trung Quốc vào tháng 5,6,7 năm 2014, tinh dầu thu cách cất kéo nước với hàm lượng không cao, đạt từ 0,03 đến 0,23 % Tất 36 thành phần xác định GC-MS từ mẫu tinh dầu Các thành phần có hàm lượng tương đối cao bao gồm α-cedrene (4,22 - 21,82%), β-caryophyllene (8,15 - 27,73%), γ-elemene (4,38–12,65%), γ-selinene (3,80– 21,09%), αselinene (2,60–10,68%), α-zingiberene (2,08–12,68%), spathulenol (3,08– 11,80%), caryophyllene oxit (1,58–10,59%), β-eudesmol (1,33–25,32%), vv Hơn nữa, tám hợp chất , công nhận thành phần quan trọng tinh dầu M tetramera M kwangsiensis, phân lập xác định αterpinene, β-caryophyllene, α-caryophyllene, alloaromadendrene, spathulenol, β-eudesmol, camphene oxit caryophyllene [51] Hình 1.1: Cấu trúc số thành phần thường gặp tinh dầu chi Murraya Alkaloid Năm 1986, Yun-Cheung Kong cộng tiến hành phân tích lồi chi phát chúng có chứa alkaloid phận [28] Hầu hết alkaloid chi thuộc nhóm Carbazole alkaloid có phần nhỏ thuộc nhóm indo alkaloid Đặc biệt carbazole alkaloid phân lập từ M koenigii, M euchrestifolia nguồn carbazole dồi Rất nhiều cacbazole phân lập từ loài [18] Người ta phát Yuehchukene – indol alkaloid loài thuộc chi Murraya M paniculata, M paniculata var omphalocarpa (Hay.) Tanaka, M exotica M alata Drake Ở số lồi cịn lại gần khơng thấy thành phần [52] Flavonoid Flavonoid tìm thấy số lồi thuộc chi Murraya điển lá, M paniticula [20, 27, 39]; M koenigii [21, 22]; lá, thân M tetramerrra [54], M.exotica [25] Tuy có số nghiên cứu flavonoid thuộc chi người ta không vào sâu mà nghiên cứu qua cấu tạo vài tác dụng sinh học flavonoid Courmarin Cũng Flavonoid Courmarin tìm thấy hầu hết loài thuộc chi Murraya như: M paniculata[43], M koenigii [45], M exotica [15], Murraya siamensis [24], M alata [31] M tetramera [50] 1.1.1.6 Tác dụng Kháng khuẩn Mini Priya Rajendran cộng nghiên cứu tinh dầu M koenigii vào năm 2014 nhận khả kháng khuẩn thấy mạnh với chủng Corynebacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pyogenes, Klebsiella pneumonia Enterobacter aerogenes [37] Các carbazole alcaloid từ M koenigii cho thấy khả ức chế mạnh mẽ chống lại vi khuẩn kháng kháng sinh Staphylococcus aureus, Psedomonas aeruginosa, Klebsiella , Escherchia coli dòng tế bào ung thư [35] Cả lồi M exotica có khả kháng khuẩn mạnh, so sánh với số kháng sinh gentamicin, erythromycin nystatin [19] Dựa nghiên cứu tính kháng khuẩn tinh dầu M paniculata với loại vi khuẩn Staphylococcus aureus , Escherichia coli, Salmonella typhimurium Enterococcus faecallis cho thấy hoạt động kháng khuẩn yếu Staphylococcus aureus kháng khuẩn trung bình cho tất chủng vi khuẩn khác với kết MIC 1,0;0,5;0,5;0,5 (mg/mL) [42] Kháng nấm Cũng thử nghiệm kháng khuẩn tinh dầu M paniculata người ta thực kiểm tra khả kháng nấm với loại nấm Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus, Aspergillus parasiticum Fusarium Solani thu MIC 0,2;0,2;0,1;0,2 (mg/ml) Từ thấy khả kháng nấm mạnh tinh dầu [33] Theo nghiên cứu khác, dịch chiết methanol M koenigii có khả ức chế tăng trưởng sợi nấm với Rhizoctonia solani (70%) Fusarium oxysporum (58%), cịn dịch chiết ethanol Fusarium oxysporum (61,07%) Rhizoctonia solani (53,77%) Trong tinh dầu M koenigii có khả ức chế trung bình với loại nấm Fusarium oxysporum (55,69%) Rhizoctonia solani (48,38%) [38] Chống viêm Tác dụng nhóm hợp chất khác: Yuehchukene – indol alcaloid phát bốn số chín lồi thuộc chi Murraya phân tích (M paniculata , M paniculate var omphalocarpa, M exotica M alata) với hoạt tính chống viêm bật [17, 52] Các thử nghiệm chuột chứng minh dịch chiết M koenigii có khả chống viêm, giảm đau [23], có tác dụng có khả chứa nguồn alkaloid carbazole phong phú [14] Ngồi M koenigii cịn có lồi M paniculate [36] M exotica [48] có khả giảm đau chống viêm đáng kể Chống oxi hóa Năm 2015, Tejal K Gajaria, Dipak K Patel, Ranjitsinh V Devkar cộng dịch chiết M koenigii ngăn chặn trình oxy hóa, cải thiện khả sống tế bào điện màng ty thể tế bào điều trị Ox-LDL Sự gia tăng Ox-LDL cân oxy hóa nội bào, ngưng tụ nguyên tử chết rụng tế bào ngăn chặn cách hiệu nhờ dịch chiết M koenigii có chất chống oxy hóa gốc tự coi diện flavonoid có chiết xuất Điều cung cấp chứng sơ tiềm chống xơ vữa động mạch đảm bảo làm sáng tỏ xác nhận thêm cho việc sử dụng in-vivo hữu ích thực phẩm chức bổ sung loại thuốc thay để ngăn chặn trình oxy hóa LDL độc tính gây oxy hóa LDL [21] Năm 2016, Davinder Kaur, Arvinder Kaur Saroj Arora sử dụng UHPLC để xác định để kiểm tra thành phần dịch chiết M exotica Họ nhận dịch chiết từ phân đoạn ethyl acetat có khả chống gốc tự tốt giảm khả đột biến gen [25] Diệt côn trùng Từ mẫu loài thuộc chi Murraya: Murraya tetramera, Murraya euchrestifolia, Murraya koenigii, Murraya kwangsiensis, Murraya exotica Murraya alata, thành phần tinh dầu chúng phân tích chứng minh tác dụng chống lại Tribolium castaneum [51] Lá M koenigii làm giảm buồn nơn, khó tiêu, nơn mửa Ngồi ra, người ta cịn ăn phương thuốc chữa tiêu chảy kiết lỵ [17] Lá M paniculata có chứa nhóm chất kích thích có tác dụng làm se sử dụng điều trị tiêu chảy, kiết lỵ bệnh nướu; phịng chống bệnh thấp khớp, ho hysteria, cịn chứng minh có khả kháng khuẩn vừa phải kháng nấm mạnh [42] Nghiên cứu so sánh tinh dầu M paniculate M exotica chứng minh β-caryophyllene có lồi có tác dụng gây tê cục so với procaine Ngồi cịn có tác dụng chống viêm giảm đau viêm [30] Một số nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn, chống tiểu đường, chống oxy hóa, chống tiết, chống ung thư từ M paniculata [33, 40] Hoạt tính chống viêm coumarin benzocoumarin chiết xuất từ loài M alata chứng minh [31] Tác dụng khác Ngoài việc sử dụng để chữa bệnh số lồi chi Murraya thường sử dụng làm gia vị, cảnh hương liệu 1.1.2 Cây Vương tùng - Murraya glabra (Guillaumin) Swingle Trên giới có số tài liệu đề cập đến M glabra tiêu chí để phân biệt chưa thấy có tài liệu chi tiết đặc điểm thực vật, vi phẫu, tinh dầu loài [41] Lồi cịn cho có tên khoa học Micromelum glabrum Guillaumin Nó mơ tả lần đầu năm 1910 thực vật chí Đơng dương Guillaumin sau: Cây bụi nhỏ mét Cành hoàn toàn đẹp, với tuyến thơm Lá dài 12-46 cm; chét xen kẽ từ 3-9, nhẵn, hình ovan thn dài (kích thước 5-17 cm x 2-9 cm) khơng phình gốc, nhọn đỉnh, khơng có cưa; gân 6-9 đôi, nhô bên dưới, tĩnh mạch không chặt khơng nhơ bên dưới; cuống hình trụ, nhẵn, dài 3-4 mm; cuống hình trụ, nhẵn, tuyến Cụm hoa ngắn lá, có lơng ngắn; cuống nhỏ dài hoa, cung cấp gốc phần thấp với nhánh nhỏ; Hoa dài mm, màu trắng Tràng với đài hợp nhất, giống nhau, ngắn Cánh hoa dài 4-6 mm, nhẵn, hình mũi mác Nhị 8, gồm nhị dài nhị ngắn; nhị mở rộng có lơng; bao phấn đính lưng, hình bầu dục, có số lơng Đĩa ngắn Bầu hình trụ, nhiều nốt sần, khơng có lơng; vịi nhụy dài bầu, đỉnh nhụy hình cầu [55] Tuy nhiên tên khơng chấp nhận sau lồi Walter T Swingle nhắc đến lần đầu báo "A new taxonomic arrangement of the orange subfamily, Aurantioideae" đăng lần đầu vào ngày 3/11/1938 tạp chí Journal Of The Washington Academy Of Sciences [44] Theo tác giả Tyozaburo Tanaka M glabra có nhị dài có lơng mịn Lá kép gồm 5-11 chét, lớn, làm cho khác với loại khác [56] Ngồi ra, thành phần hóa học M glabra dự đoán chứa carbazole [28] 1.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 1.2.1 Chi Murraya 1.2.1.1 Đặc điểm thực vật Cây bụi gỗ nhỏ, khơng có gai Lá kép lơng chim lẻ, chét mọc cách, cuống đơi có cánh Cụm hoa xim hình ngù, mọc đỉnh nách Nụ hoa hình trụ hay trứng-thn Đài gồm 5(4) thùy, dính gốc Tràng 5(4) cánh hoa, có tuyến tinh dầu ; tiền khai hoa lợp Bộ nhị có 10(8) nhị, nhị hình sợi dài, rời ; bao phấn nhỏ ; triển mật rõ Các noãn dính hồn tồn ; bầu 2-5 ơ, có 1-2 nỗn ; vịi nhụy dài bầu, nhẵn, tồn tại; đầu nhụy phồng; cuống bầu ngắn khơng có Quả mọng,khơng có lơng hình túi mọng nước (tép) ; vỏ hạt nhẵn có lơng dài, màu trắng, mềm ; mầm màu xanh sẫm, có tuyến tinh dầu [2] 1.2.1.2 Phân loại Hiện nay, chi Murraya ghi nhận lồi có Việt Nam Trong luận văn nghiên cứu phân loại loài họ Cam – Rutaceae, TS Bùi Thu Hà phân loại chi Murraya họ sau : 1a Cuống có cánh M alata 1b Cuống cánh 10 2a Số lượng hoa cụm hoa ít, cánh hoa dài 1,5cm M paniculata 2b Số lượng hoa cụm hoa nhiều, cánh hoa ngắn 1cm 3a Số lượng chét từ 17-31………………………M koenigii 3b Số lượng chét từ 5-9………………………… M glabra 1.2.2 Các nghiên cứu loài Vương tùng - Murraya glabra (Guillaumin) Swingle 1.2.2.1 Đặc điểm thực vật Đặc điểm thực vật Vương tùng mô tả nhiều sách, cụ thể là: Theo Danh lục thực vật Việt Nam Nguyễn Tiến Bân làm chủ biên Vương tùng dạng bụi nhỏ, cao 1-1,5m Mọc rải rác núi đá vôi Theo Những thuốc vị thuốc Việt Nam Đỗ Tất Lợi (2004) đặc điểm thực vật Vương tùng nhỏ mọc thành bụi, cao 1-2m, đặc biệt cao từ 3-4m Lá kép lông chim lẻ gồm 5-9 chét có cuống dài 57mm, màu tía, cuống chét dơi có đốt, phiến hình trứng dài 46,5cm, rộng 1,8-3,8cm mặt màu xanh xám, mặt xanh nhạt, rõ mặt dưới, mép có rang cưa giả túi tiết tinh dầu gợn lên Hoa nở vào mùa xuân, mọc thành chum xim, hoa nhỏ Quả chin già vào tháng 8-9, to hạt ngô Vỏ chứa nhiều tinh dầu Lá, vỏ thơm, mùi dễ chịu Theo Sách đỏ Nguyễn Tiến Bân làm chủ tịch hội đồng biên soạn Vương tùng gỗ nhỏ, thường mọc thành bụi, cao - 4m Ngọn cành cuống non màu đỏ tím Lá kép hình lơng chim, mọc so le, dài 10 - 25cm, có - chét Lá chét hình mũi mác, dài 3,5 - 7,5cm, rộng 1,5 - 3,5cm, đầu thuôn hẹp tạo thành mũi nhọn, cuống dài - 5mm Mặt phiến bóng, soi lên ánh sáng thấy rõ nhiều túi tiết tinh dầu Mép nguyên, có nhiều túi tiết nằm sát mép trơng có cưa nhỏ Cụm hoa chùm xim đầu cành, mang nhiều hoa nhỏ màu trắng, mùi thơm Hoa mẫu Cánh hoa dài 6mm, rộng 1,5mm Nhị 8, bốn nhị dài 5mm, bốn nhị dài 4mm Bộ nhuỵ dài khoảng 3mm, bầu sần sùi Quả hình cầu hay bầu dục, đường kính 9mm, chứa - hạt; vỏ có nhiều túi tiết tinh dầu, chín màu đỏ Cịn theo Bùi Thu Hà Vương tùng gỗ nhỏ, thường mọc thành bụi, cao - 4m Ngọn cành cuống non màu đỏ tím Lá kép hình lơng chim, mọc so le, dài 10 - 25cm, có - chét Lá chét hình mũi mác, dài 3,5 - 7,5cm, rộng 1,5 - 3,5cm, đầu thuôn hẹp tạo thành mũi nhọn, cuống dài - 5mm Mặt phiến bóng, soi lên ánh sáng thấy rõ nhiều túi tiết tinh dầu Mép 11 nguyên, có nhiều túi tiết nằm sát mép trơng có cưa nhỏ Cụm hoa chùm xim đầu cành, mang nhiều hoa nhỏ màu trắng, mùi thơm Hoa mẫu Cánh hoa dài - 6mm, rộng 1,5mm Nhị 8, bốn nhị dài 5mm, bốn nhị dài 4mm Bộ nhuỵ dài khoảng 3mm, bầu sần sùi Quả hình cầu hay bầu dục, đường kính - 9mm, chứa - hạt; vỏ có nhiều túi tiết tinh dầu, chín màu đỏ Mùa hoa tháng 3-4, chín vào tháng 9-10 Tái sinh hạt Ưa sáng chịu hạn Hình 1.2: Tổng quát Vương tùng ([3]) 1.2.2.2 Thành phần hóa học Theo Đỗ Tất Lợi, Vương tùng có nhóm hợp chất: tinh dầu, imperatozin, dentatin, nondetatin [3] Đa số nghiên cứu Việt Nam loài thường tập trung vào tinh dầu có nhiều tiềm để nghiên cứu phần lại Đây thành phần hóa học phân bố chủ yếu già chét, cuống cành hàm lượng tinh dầu khơng đáng kể Hàm lượng tinh dầu M glabra giàu menthon isomenthon (85-95%) [13] 12 Năm 1989, Lê Tùng Châu cộng sử dụng số phương pháp sắc ký khí, sắc ký khí chế tạo, đo phổ khối tử ngoại, hồng ngoại, cộng hưởng từ piroson, sắc ký khí khối phổ, sắc ký khí hồng ngoại làm phản ứng hóa học xác định tinh dầu Vương tùng có chứa menthon, isomenthon, limonen, p.cymen hydroxymenthon [5, 6] Menthon Isomenthon Limonen P cymene Hydroxymenthon Hình 1.3: Một số hợp chất tinh dầu Vương tùng 1.2.2.3 Tác dụng dược lý ứng dụng Lê Tùng Châu cộng cơng bố tạp chí dược học (1989) tinh dầu Vương tùng có tác dụng diệt khuẩn mạnh, diệt nhiễm trùng vi khuẩn nồng độ 50 L/ml môi trường nuôi cấy xác định phương pháp khuếch tán phương pháp nồng độ Ngoài tác giả cịn nhận thấy tinh dầu cịn chữa cảm cúm, thấp khớp,nhức xương [6] Theo tài liệu khác Vương tùng có khả chữa cảm cúm, sốt rét, đau khớp, nắn bó gãy xương Rễ chữa tê thấp, phù thũng [5, 12] 1.2.2.4 Phân bố Theo Sách đỏ Việt Nam – Phần 2: Thực vật Nguyễn Tiến Bân làm chủ biên phân bố loài Vương tùng là: Thế giới: Trung Quốc (Vân Nam) [8, 10] Việt Nam: Quảng Ninh, Hải Phòng (Cát Bà), Hà Nam, Hồ Bình, Ninh Bình, Thanh Hố, Quảng Trị, Đà Nẵng [2, 3, 8-10] 13 Hình 1.4: Phân bố Vương tùng Việt Nam ([10]) 1.3 Giới thiệu phương pháp sắc ký khí khối phổ Tinh dầu hợp chất chứa chất thơm dễ bay [16] Vì vậy, để phân tích thành phần tinh dầu, người ta thường dùng sắc ký khí khối phổ, vốn phương pháp tạo nhằm xác định thành phần chất dễ bay 1.3.1 Nguyên tắc Sắc ký khí phương pháp tách dựa phân bố khác chất hai pha không trộn lẫn vào nhau, đủ pha động chất khí (khí mang) qua pha tĩnh chứa cột Sắc ký khí áp dụng để tách chất dẫn xuất chúng mà hóa nhiệt độ phân tích Phương pháp sắc ký khí dựa chế hấp phụ, phân bổ loại theo kích thước (dùng rây phân từ) [1] Nguyên tắc MS: Chất phân tích chuyển sang thể khí ion hóa, tạo thành ion dương âm Phương pháp phổ khố dựa việc đo trự tiếp tỉ số m/z, tỉ số khối lượng m điện tích z ion phân tích Từ phổ khối ta có thơng tin khối lượng phân tử cấu trúc mảnh thu giúp định tính hay định lượng [1] 1.3.2 Ứng dụng kiểm nghiệm tinh dầu Sắc ký khí- khối phổ kĩ thuật phân tích đại ngày ứng dụng rộng rãi, đặc biệt lĩnh vực kiểm nghiệm tinh dầu ưu điểm 14 độ phù hợp Bất chấp thiết bị đắt tiền tốn nhiều thời gian so với số kĩ thuật khác Hiếm có kỹ thuật có độ xác phân tích tinh dầu sắc ký khí khối phổ[16] Sự phù hợp sắc ký khí kiểm nghiêm tinh dầu: Do thành phần tinh dầu chủ yếu terpenoid, dễ bay hơi, nên đặc biệt phù hợp để sử dụng sắc ký khí phân tích Sau qua cột sắc ký tinh dầu phức tạp cho peak chồng chất, đó, khối phổ trở nên hiệu nhận peak chồng chất [32] Tóm lại, loại tinh dầu thường hỗn hợp phức tạp nhiều chất khác nhau, số chất có cấu trúc hóa học tương tự Do khả phân tách tốt hỗn hợp chứa thành phần dễ bay tinh dầu nên GC-MS thường ưu tiên sử dụng phân tích tinh dầu 15 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Mẫu thực vật tươi khô thu hái Bản Lụa, Phường Chiềng An, TP Sơn La Mẫu cung cấp khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu 2.1.2 Hóa chất sử dụng Hóa chất sử dụng nghiên cứu đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích bao gồm: - Hóa chất làm tiêu bản: nước cất, nước Javen, acid acetic, dd xanh methylene 0,05%, dd đỏ carmin 0,5% - Dung môi chiết xuất: cloroform, ether dầu hỏa, EtOH 96%, nước cất - Dung mơi pha lỗng tinh dầu: n-hexan - Pha động GC-MS: Heli 2.1.3 Thiết bị sử dụng Nghiên cứu đặc điểm thực vật: - Chụp ảnh mẫu nghiên cứu máy ảnh Canon IXY 30S - Kim mũi mác, dao lam, chổi lơng, phiến kính, lamen, … - Kính hiển vi soi Nikon SMZ 745T kết nối camera Nikon DSFi2 máy tính - Kính hiển vi Nikon Eclipse Ci kết nối camera Nikon DS-Fi2 máy tính - Tủ sấy WiseVen Nghiên cứu thành phần hóa học: - Cân kỹ thuật Sartorius Cân phân tích số Shimadzu AY 220 Máy sắc ký khí khối phổ GC-MS-QP2010 Shimadzu (Nhật Bản), 2.2 Nội dung nghiên cứu - Xác định tên khoa học mẫu thu thập Mô tả chi tiết đặc điểm hình thái Vương tùng thu hái Sơn La Mô tả đặc điểm vi phẫu loài Vương tùng thu hái Sơn La 16 - Nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu loài Vương tùng thu hái Sơn La 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 - - Phương pháp khảo cứu, kế thừa tài liệu Tham khảo tài liệu để nắm thơng tin về: + Vị trí phân loại danh pháp loài + Nguồn gốc vùng phân bố(ở Việt Nam giới) + Đặc điểm hình thái sinh thái lồi + Giá trị sử dụng loài + Một số thành phần tinh dầu Kế thừa tài liệu phương pháp nghiên cứu: + Kế thừa số liệu, kết từ báo, nghiên cứu nước Tải FULL (50 trang): https://bit.ly/3SCG4Th Dự phòng: fb.com/TaiHo123doc.net + Các phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái, nghiên cứu vi phẫu, tách chiết tinh dầu 2.3.2 Phương pháp hình thái so sánh Sử dụng phương pháp phân loại so sánh hình thái theo Nguyễn Nghĩa Thìn (2007) [7] để xác định tên khoa học, nghiên cứu đặc điểm hình thái phân loại taxon lồi thu thập Phương pháp khơng đồi hỏi thiết bị phức tạp, dễ tiến hành, đảm bảo độ xác phù hợp với điều kiện nước Đối chiếu mẫu thu với mẫu lưu trữ phòng tiêu Dược liệu Viện Dược liệu ảnh type mẫu Bảo tàng Lịch sử tự nhiên Quốc gia Pháp 2.3.3 Phương pháp nghiên cứu giải phẫu Nghiên cứu giải phẫu phần lá, thân, rễ mẫu thu theo phương pháp nghiên cứu Nguyễn Bá [4], Trần Văn Ơn [11] Các bước thực hiện: Cắt mẫu tẩy nội chất - Cố định mẫu dụng cụ cắt vi phẫu cầm tay microtome cắt dao lam Sử dụng phẫu thức cắt ngang Cắt lát mỏng qua rễ, 17 thân, Thân cắt ngang, phần gần ngọn; rễ cắt rễ chính, có thiết diện phù hợp; cắt ngang thân phần phiến hai bên, đoạn 1/3 kể từ cuống lá, chọn bánh tẻ không già non, khảo sát nhiều để ghi nhận, mô tả đặc điểm chung Mẫu tươi cắt trực tiếp không qua xử lý Tuy nhiên để lưu mẫu vật cho việc kiểm định sau này, mẫu ngâm dung dịch Carnoy I 24h sau chuyển sang dung dịch bảo quản gồm cồn 700 + glycerin tỷ lệ 1:1 - Ngâm mẫu sau cắt dung dịch Cloramin B 5% dung dịch natri hypoclorit (nước Javen) 20-30 phút Rửa mẫu qua nước - Ngâm mẫu dung dịch acid acetic 1% 10-15 phút để tẩy Cloramin cịn sót lại Rửa qua mẫu với nước - Nhuộm mẫu + Nhuộm xanh methylene 0,05% khoảng phút đến bám màu xanh rửa nước + Nhuộm đỏ Carmin 0,5% 15 phút thấy bám màu đỏ rửa nước - Gắn mẫu lên lam kính Tải FULL (50 trang): https://bit.ly/3SCG4Th Dự phòng: fb.com/TaiHo123doc.net - Đậy lamen - Soi mẫu: Tiến hành soi mẫu kính hiển vi thị kính 10x, vật kính 5x,10x chụp lại máy ảnh 2.3.4 Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học 2.3.4.1 Phương pháp định lượng tinh dầu dược liệu Bộ cất tinh dầu thể hình 2.1 Cho thể tích dung mơi cất theo quy định vào bình cất, thêm vài mành đả bọt lắp ngưng cất vào Thêm nước qua phễu N tới mức B Mở khóa K ‘ dùng pipet cho vào ml xylen (TT) trừ có dẫn khác (tựa đầu pipet vào phía cuối nhánh K) Đóng khóa K’ cho lỗ thơng trùng khớp Đun bình sơi, sau khơng có dẫn khác điều chỉnh tốc độ cất cho cất ml/min đến ml/min Xác định tốc độ cất sau: Mở vòi nhánh M để hạ mức dịch cất ống đến vạch (a) bầu (J), khóa vịi M lại xác định thời gian cần thiết để cất đến vạch (b) 18 Hình 2.1: Bộ dụng cụ cất tinh dầu Chú thích: Bộ cất tinh dầu theo Dược điển Việt Nam Bộ cất tinh dầu phịng thí nghiệm Hóa Phân tích tiêu chuẩn - Viện Dược liệu Mở vòi M tiếp tục cất, điều chỉnh nhiệt độ đun để có tốc độ cất theo quy định, cất 30 Ngừng cất, đọc thể tích xylen ống hứng chia độ nhiệt độ ống hứng trở nhiệt độ phòng Cho vào bình cất lượng mẫu theo qui định tiếp tục cất với thời gian tốc độ cất quy định chuyên luận riêng Ngừng cất, đọc thể tích hỗn hợp tinh dầu xylen ống hứng chia độ nhiệt độ ống hứng trở nhiệt độ phịng Thể tích đọc lần trừ thể tích xylen cho thể tích tinh dầu lượng mẫu định lượng [1] Tinh dầu sau cất đem thực sắc ký khí khối phổ để xác định thành phần 2.3.4.2 Phương pháp phân tích thành phần hóa học tinh dầu Thực hiện: - Làm khan mẫu thử tinh dầu Vương tùng Na2SO4 - Hút xác 0,1 ml mẫu thử tinh dầu Vương tùng làm khan, pha loãng 10 lần n-hexan (Merck) thu dung dịch mẫu thử (A) có nồng độ 0,1 ml tinh dầu/ml dung dịch - Lặp lại q trình pha lỗng lần (10x10x10 = 1000 lần) để thu dung dịch mẫu thử (B) có nồng độ 0,1µl/ml dung dịch phù hợp cho phân 19 8313908 ... học mẫu thu thập Mơ tả chi tiết đặc điểm hình thái Vương tùng thu hái Sơn La Mô tả đặc điểm vi phẫu loài Vương tùng thu hái Sơn La 16 - Nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu lồi Vương tùng thu. .. dụng Vương tùng chưa nghiên cứu cách cụ thể Vì chúng tơi thực hiên đề tài ? ?Nghiên cứu đặc điểm thực vật thành phần hóa học tinh dầu lồi Vương tùng (Murraya glabra (Guillaumin) Swingle) thu hái Sơn. ..ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC Người thực hiện: Đỗ Minh Hiếu NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA TINH DẦU LOÀI VƯƠNG TÙNG (MURRAYA GLABRA (GUILLAUMIN) SWINGLE) THU