Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học cây pệnh nua trồng ở viêng chăn, lào

Nhằm tìm hiểu sâu hơn về loài thực vật này, định danh chính xác và nghiên cứu về các thành phần hoá học có trong cây, định hướng tới việc xác định được các hợp chất hoá học có tác dụng d

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2021

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển, người thầy đã trực tiếp giao cho em đề tài này, định hướng, tận tình

chỉ bảo và hỗ trợ em trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu Thầy là người thầy tâm huyết, đam mê và tận tuỵ Em học được từ thầy sự đam mê, nghiêm túc trong nghiên cứu,

kỹ năng cẩn thận, chu đáo trong tác phong làm việc

Bằng tất cả sự yêu quý và biết ơn, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới chị HVCH

Lê Hương Giang, anh HVCH SENGKHAM Choumlivong chị HVCH Nguyễn Hồng Thịnh, bạn Trần Thị Lương Linh, bạn Trần Thùy Chi và bạn Nguyễn Thị Lệ đã chỉ

bảo em suốt thời gian em làm nghiên cứu khoa học tại Bộ môn Dược học cổ truyền Anh chị không chỉ truyền dạy cho em những bài học và kinh nghiệm quý giá trong quá trình nghiên cứu và học tập mà còn truyền cho em rất nhiều động lực và đam mê với khoa học Các anh chị và các bạn là những tấm gương sáng để em noi theo trong cuộc đời sinh viên học tập và nghiên cứu khoa học tại trường

Em cũng xin chân thành cảm ơn tới ThS Nghiêm Đức Trọng và ThS Phạm Thị Linh Giang công tác tại Bộ môn Thực vật – Đại học Dược Hà Nội đã chỉ bảo và giúp đỡ em rất

nhiều về mặt kiến thức chuyên môn trong quá trình thực hiện đề tài Sự hỗ trợ của các thầy

cô góp phần không thể thiếu để em hoàn thiện đề tài

Em xin gửi sự biết ơn tới toàn thể thầy cô Trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ tôi trong suốt khoảng thời gian học tập tại trường Tôi xin kính chúc thầy cô luôn mạnh khỏe

và công tác tốt

Cuối cùng, lời cảm ơn sâu sắc nhất con xin dành cho Bố và Mẹ, những người đã sinh

thành, dưỡng dục, luôn luôn quan tâm và động viên con hàng ngày và trên mọi chặng đường gian khó trong cuộc đời

Hà Nội, ngày 31 tháng 5 năm 2021

Sinh viên

Phonevilay PHOTHISAN

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮTiii

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Chi Cnidoscolus 2

1.1.1 Đặc điểm thực vật và khóa phân loại chi Cnidoscolus 2

1.1.2 Phân bố chi Cnidoscolus 2

1.2 Loài Cnidoscolus aconitifolius 2

1.2.1 Vị trí phân loại, phân bố và đặc điểm thực vật 2

1.2.2 Thành phần hóa học 5

1.3 Tác dụng sinh học 5

1.3.1 Kháng khuẩn và kháng vi sinh vật 5

1.3.2 Bảo vệ gan, thận 6

1.3.3 Tác dụng kiểu hormon 6

1.3.4 Hạ đường huyết 6

1.3.5 Tác dụng hạ huyết áp và bổ sung dinh dưỡng 6

1.4 Công dụng 7

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 9

2.1 Nguyên liệu, hoá chất, thiết bị 9

2.1.1 Nguyên liệu 9

2.1.2 Hoá chất, thiết bị 9

2.2 Nội dung nghiên cứu 10

2.2.1 Nghiên cứu về đặc điểm thực vật 10

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hoá học 10

2.3 Phương pháp nghiên cứu 10

2.3.1 Nghiên cứu về đặc điểm thực vật 10

2.3.2 Nghiên cứu về thành phần hoá học 11

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20

3.1 Kết quả nghiên cứu đặc điểm thực vật 20

3.1.1 Đặc điểm hình thái và giám định tên khoa học 20

3.1.2 Đặc điểm vi phẫu 22

3.1.3 Đặc điểm bột dược liệu 26

3.2 Kết quả nghiên cứu thành phần hoá học 27

3.2.1 Định tính các nhóm chất bằng phương pháp hoá học 27

3.2.2 Chiết xuất và phân lập các hợp chất 28

3.2.3 Kết quả phân lập một số hợp chất lá của cây Pệnh nua 29

3.3 Bàn luận 36

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ESI-MS : ElectroSpray Ionization Mass Spectroscopy

EtOAc : Ethyl acetat

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Tác dụng sinh học của dịch chiết toàn phần, phân đoạn và một

số hoạt chất phân lập từ Cnidoscolus aconitifolius

Trang 8

Bảng 3.1 Phản ứng định tính các nhóm chất trong lá mẫu nghiên cứu Trang 28 Bảng 3.2 So sánh số liệu NMR của hợp chất 1 với tài liệu tham khảo Trang 33 Bảng 3.3 So sánh số liệu NMR của hợp chất 2 với tài liệu tham khảo Trang 35

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Hình ảnh loài C.aconitifolius (Mill.) I.M.Johnst Trang 3 Hình 1.2 Mô tả đặc điểm thực vật loài C.aconitifolius (Mill.) I.M.Johnst Trang 4 Hình 2.1 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn Trang 15

Hình 3.2 Đặc điểm cơ quan sinh dưỡng Trang 21 Hình 3.3 Đặc điểm cơ quan sinh sản Trang 22 Hình 3.4 Đặc điểm vi phẫu phiến lá Trang 23 Hình 3.5 Đặc điểm vi phẫu cuống lá Trang 24

Hình 3.7 Đặc điểm bột lá cây Pệnh nua Trang 26 Hình 3.8 Đặc điểm bột thân cây Pệnh nua Trang 27 Hình 3.9 Sơ đồ chiết xuất lá của cây Pệnh nua Trang 29 Hình 3.10 Sơ đồ phân lập một số hợp chất lá của cây Pệnh nua Trang 30

Hình 3.11 Khảo sát TLC phân đoạn CE4-54 đến CE4-66 pha đảo, hệ

MeOH : Nước (1:1)

Trang 30

Hình 3.12 Công thức hoá học hợp chất CE4.1a Trang 33 Hình 3.13 Công thức hoá học hợp chất CE4.1b Trang 36

ĐẶT VẤN ĐỀ

Pệnh nua là một loài cây được dùng phổ biến trong đời sống hàng ngày ở Lào Người

Lào sử dụng lá cây Pệnh nua như gia vị món ăn bởi nó có vị ngọt tương tự vị mì chính, vị

ngọt này không làm tăng đường huyết trong máu nên có thể sử dụng cho các bệnh nhân tiểu

đường

Trên thế giới, cây Pệnh nua còn có tên gọi là Chaya, phân bố chủ yếu ở Trung và Nam

Mỹ như Mexico, Brazil Các nghiên cứu về cây này chủ yếu tiến hành trên lá, chỉ ra thành

phần hoá học chính bao gồm alkaloid, saponin, phenolic, tannin, flavonoid, anthraquinone,

phlobatannin và triterpene Lá cây còn chứa đa dạng các chất dinh dưỡng như protein, chất

béo, các nguyên tố đa – vi lượng và các vitamin, đặc biệt là vitamin C Các tác dụng sinh

học bao gồm kháng khuẩn, chống oxi hoá, bảo vệ gan thận, hạ đường huyết,…[4], [5], [11],

[20], [24], [26], [30]

Qua khảo sát sơ bộ ở Viêng Chăn – Lào, nhóm nghiên cứu thấy cây Pệnh nua mọc tự

nhiên và được trồng một cách rộng rãi, là loài cây vô cùng quen thuộc như một loại “rau

thảo dược” Tuy nhiên, nghiên cứu về cây này chưa được tiến hành trước đó tại Lào, trong

khi cách sử dụng và các tài liệu trên thế giới đều cho thấy đây là một loài có tiềm năng phát

triển và khai thác Nhằm tìm hiểu sâu hơn về loài thực vật này, định danh chính xác và

nghiên cứu về các thành phần hoá học có trong cây, định hướng tới việc xác định được các

hợp chất hoá học có tác dụng dược lý, từ đó phát triển loài “rau thảo dược” này thành dược

liệu có giá trị kinh tế và đóng góp vào dữ liệu thực vật học tại Lào cũng như trên thế giới,

đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học cây Pệnh nua trồng ở Viêng

Chăn, Lào” được thực hiện với các mục tiêu sau:

1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật cây Pệnh nua (Cnidoscolus aconitifolius) trồng ở

Viêng Chăn, Lào

2 Nghiên cứu thành phần hoá học gồm định tính và phân lập một số hoạt chất có trong

dịch chiết lá cây Pệnh nua (Cnidoscolus aconitifolius) trồng ở Viêng Chăn, Lào

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Chi Cnidoscolus

1.1.1 Đặc điểm thực vật và khóa phân loại chi Cnidoscolus

Chi Cnidoscolus thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), được mô tả như sau: Cây thảo

(cây bụi) hoặc cây gỗ, sống lâu năm, đơn tính cùng gốc; thân có đốt; mủ trắng Lá tồn tại hoặc rụng lá, lá đơn, mọc so le, có cuống, có tuyến tại đỉnh lá, có lá kèm Mép lá lượn sóng, gân lá dạng chân vịt Cụm hoa lưỡng tính dạng xim 2 ngả, nhị bội; không tồn tại lá bắc Cuống hoa ngắn Hoa đực: lá đài 5, màu trắng, hình cánh hoa, xếp chồng lên nhau, hàn liền 1/2; có tuyến mật hình khuyên; nhị hoa [8–] 10 [–25] xếp thành 2 đến 6 vòng, vòng xoắn bên trong không có nhị lép hoặc nhị lép ở đỉnh trụ nhị, không có bộ nhụy Hoa cái: lá đài

5, màu trắng, hình cánh hoa, đài hoa rời; không có tràng hoa; tuyến mật hình khuyên; bộ

nhụy 3 lá noãn, mẫu 3 Quả hình ovan Hạt hình trứng [2], [29]

1.1.2 Phân bố chi Cnidoscolus

Chi Cnidoscolus có khoảng hơn 70 loài (Webster, 1994; Gordillo và cộng sự, 2002)

phân bố chủ yếu tại Trung và Nam Mỹ (Mexico và Brazil) Tại Brazil người ta tìm thấy 42 loài phân bố tại các vùng địa lý khác nhau Một số loài được sử dụng như thảo dược

C.aconitifolius, C.chayamansa Mc Vaugh, C.multilobus (Pax) Johnst., C.quercifolius Pohl

(tên đồng nghĩa C.phyllacanthus (Mart.) Pax và Hoffm), C.urens (L.) Arthur, C.infestus Pax và Hhofman, C.pubescens Pohl và C.osouzae Mc Vaugh dùng cho giảm đau, chống

viêm, kháng sinh, thấp khớp, nhiễm trùng tiết niệu, lợi tiểu, bệnh dạ dày, bệnh gan và chống ung thư [3], [4], [9], [11], [12], [15], [17], [19], [21], [26], [27]

1.2 Loài Cnidoscolus aconitifolius

1.2.1 Vị trí phân loại, phân bố và đặc điểm thực vật

1.2.1.1 Vị trí phân loại

Loài C.aconitifolius (Mill.) I.M.Johnst thuộc chi Cnidoscolus, họ Euphorbiaceae

[27], [28] Vị trí phân loại của loài được tóm tắt như sau:

Giới Thực vật (Plantae)

Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)

Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)

Họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) Phân lớp Thầu dầu (Euphorbioideae)

Chi Cnidoscolus Welzen, P.C van & F.J Fernández-Casas Loài C.aconitifolius (Mill.) I.M.Johnst

1.2.1.2 Phân bố

Loài C.aconitifolius (Mill.) I.M.Johnst có nguồn gốc ở Mexico và Trung Mỹ, nhưng

thực tế có phân bố rộng hơn (Howard, 1989) [31], [32]

1.2.1.3 Đặc điểm thực vật

Hình 1.1 Hình ảnh loài C.aconitifolius (Mill.) I.M.Johnst [32]

Loài C.aconitifolius (Mill.) I.M.Johnst được mô tả lần đầu năm 1923 [32] Cây bụi,

có thể cao tới 2,5 m Thân nhẵn hoặc có lông tơ, có các mấu lồi Có lông tơ ngắn, thưa Thân non có bọc nước, để lại sẹo dày, mọng nước Lá đơn, mọc so le, tập trung ở ngọn; cuống lá dài 6,2–13,5 cm; phiến lá có 5 thùy, hình trứng, kích thước11–21 x 9–18,5 cm,

các thùy chồng lên nhau, đối xứng, gốc lá rộng hình mác, mép lá có răng cưa thưa ở phần thùy đỉnh, đỉnh của các thùy lá nhọn; gân lá hình dải phân thùy, gân phụ thắt lại và chạm vào gần rìa

Cụm hoa hướng trục, dạng phân nhánh; cuống cụm hoa dài tới 23,5 cm, có một vài lông ngắn, đặc biệt là các lông ở đỉnh; lá bắc hình tam giác kích thước 1,2 x 0,8 mm, đỉnh

lá bắc nhọn, bên ngoài có lông tơ; lá bắc con,hơi nhỏ hơn nhưng đầu nhọn biến thành tuyến; hoa trung tâm là hoa cái, nhiều hoa bên là hoa đực Hoa mẫu 5; đài hoa hàn liền một phần, đài hoa 5, hình cánh hoa, màu trắng, không có tràng hoa Ống đài hoa dài 4,7 mm, các thùy hình trứng, kích thước 2,5 x 2 mm; nhị 10, chỉ nhị hàn liền với vòi nhuỵ thành trục nhị - nhuỵ, 5 nhị vòng ngoài có chỉ nhị ngắn hơn, 5 nhị vòng trong có chỉ nhị dài hơn, bao phấn đính lưng; trên đỉnh trục nhị - nhuỵ có vòi nhụy Hoa cái dài 10 –11 mm; cuống ngắn

có lông tơ, đài hoa tồn tại đến khi tạo quả, bao bọc quanh bầu nhụy và các nhụy Đài hoa

5, phần dưới hàn liền, phần trên chia 5 thùy, màu trắng; nhị lép 10, bầu noãn 3 lá noãn hàn liền tạo 3 ngăn, mỗi ngăn 1 noãn; vòi nhụy dài 3,3 mm, phân đôi 2–3 lần Quả hình cầu, chứa 3 hạt [32]

1.2.2 Thành phần hóa học

Dịch chiết nước lá C.aconitifolius chứa các hợp chất nhóm alkaloid, saponin,

phenolic, tanin, flavonoid, anthraquinone, phlobatannin và triterpene (trong đó hàm lượng alkaloid cao nhất (2,75%) [8], [22], [28] Phân đoạn ethyl acetat từ dịch chiết nước đã xác định được các hợp chất chính bao gồm coumaric acid, flavonoid nhóm amentoflavone (một

biflavonoid có trong lá Bạch quả (Ginkgo biloba), cây Lá kim (Chamaecyparis obtusa), cây Ban Âu (Hypericum perforatum) ), hesperidin, protocatechuic acid, kaempferol,

dihydromyricetin, quercetin và rutin Dịch chiết lá bằng methanol cũng cho dương tính với các hoạt chất alkaloid, tanin, saponin, flavonoid và glycosid tim, không phát hiện steroid, phlobatannin and terpenoid

Các nghiên cứu đã chỉ ra lá C.aconitifolius chứa hàm lượng cao các chất dinh dưỡng

và nguyên tố vi lượng, bao gồm protein, chất béo, các nguyên tố đa – vi lượng, [11], [24]

1.3 Tác dụng sinh học

1.3.1 Kháng khuẩn và kháng vi sinh vật

Nghiên cứu của Fagbohun và cộng sự (2021) chỉ ra dịch chiết methanol có tác dụng

kháng vi sinh vật, trong đó tác dụng kháng khuẩn đối với Klebsiella pneumonia,

Psuedomonas, Escherichia coli thông qua thử nghiệm vòng vô khuẩn và tác dụng kháng

nấm thông qua thử nghiệm tăng trưởng sợi nấm ở các nồng độ dịch chiết khác nhau (31,25 mg/ml → 500mg/ml) [11], [19]

1.3.2 Bảo vệ gan, thận

Nghiên cứu của Adaramoye và Aluko (2011) cho biết sử dụng đồng thời chiết xuất

methanol của lá C aconitifolius với ethanol làm giảm sự gia tăng trong tổn thương peroxy

hóa lipid, phục hồi trạng thái chống oxy hóa (gamma-glutamyltransferase, glutathione, superoxide dismutase và hoạt động của catalase), các chất đánh dấu tổn thương thận và các chỉ số bài tiết nước tiểu ở những động vật này Ngoài ra nghiên cứu cũng chứng tỏ dịch

chiết C.aconinifolus có tiềm năng trong việc điều trị rối loạn chức năng gan và thận gây ra

bởi ethanol [4], [26]

1.3.3 Tác dụng kiểu hormon

Nghiên cứu của Yakubu và cộng sự (2008) về tác dụng trên tuyết nội tiết chuột cái

cho thấy dịch chiết nước C.aconitifolius có tác dụng làm tăng đáng kể nồng độ prolactin và

giảm nồng độ estradiol, progesteron, FSH và LH huyết tương [28]

1.3.4 Hạ đường huyết

Nhóm nghiên cứu của Samuel và cộng sự (2014) của phân đoạn chloroform của

C.aconitifolius so với glibenclamide ở chuột Wistar đái tháo đường do alloxan gây ra cho

thấy 100-200 mg/kg phân đoạn chloroform có khả năng hạ đường huyết đáng kể, cụ thể liều 100, 150 và 200 mg/kg phân đoạn thử nghiệm đã làm giảm đường huyết của bệnh nhân

tiểu đường lần lượt là 41,76, 71,11 và 73,46% Dịch chiết methanol lá C.aconitifolius chứa

các hợp chất chính là acid dodecanoic -1, 2, 3- propanetriyl este, cyclotetradecan, acid eicosanoid; acid octadecanoic, 4-nitrosophenyl-beta-phenyl propionat, acid benzen acetic, acid phenyl malonic và 3-oxo-4-phenylbutyronitril Sự hiện diện của các hợp chất này trong

dịch chiết thực vật có thể gợi ý về một trong những đặc tính dược lý của C aconitifolius và

do đó được khuyến cáo là thực vật có tầm quan trọng về dược phẩm [27]

1.3.5 Tác dụng hạ huyết áp và bổ sung dinh dưỡng

Trong một nghiên cứu của Oyagbemi và Odetola (2013) cũng đã điều tra sự và tác dụng hạ cholesterol máu của chế độ ăn bổ sung này đối với tổn thương gan và tổn thương thận liên quan đến suy dinh dưỡng năng lượng protein Các kết quả của những nghiên cứu

ẩn và có thể mang lại lợi ích to lớn như bổ sung chế độ ăn uống để giảm bớt tình trạng thiếu máu do suy dinh dưỡng năng lượng protein Hơn nữa, các tác giả đã chứng minh rằng tổn thương gan và thận có liên quan đến năng lượng protein bị suy dinh dưỡng có thể được cải

thiện với việc bổ sung 10% và 20% C.aconitifolius khi thiếu protein ăn kiêng [20]

- Lá chứa hàm lượng cao vitamin C, ꞵ-carotene, và protein, giàu calcium, phospho, sắt, thiamin, riboflavin và niacin [24]

- Hàm lượng vitamin C theo khối lượng trong lá C.aconitifolus cao gấp 10 lần trong

quả cam [24]

1.4 Công dụng

Loài C.aconitifolius được sử dụng từ xa xưa với các công dụng như chắc móng và

làm đen tóc bạc chữa nghiện rượu, mất ngủ, gút, bọ cạp đốt, cải thiện trí não và thị lực, ổn định huyết áp, ổn định màng hồng cầu trong bệnh suy dinh dưỡng protein năng lượng, đặc tính chống tiểu đường, kháng khuẩn, bảo vệ gan, chống viêm và giảm đau [14], [17], [24], [25], [29]

Bảng 1.1 Tác dụng sinh học của dịch chiết toàn phần, phân đoạn và một số hoạt

chất phân lập từ Cnidoscolus aconitifolius

Dịch chiết, phân

đoạn, hoạt chất

Mô hình Liều/hàm lượng Tác dụng sinh học TLTK

Phân đoạn

Cloroform In vivo

5, 10, 50, 100,

150, 200 mg/kg Hạ huyết áp [27] Thực phẩm bổ

sung In vivo 10, 20%

Kháng vi sinh vật Bảo vệ gan Bảo vệ tế bào thần kinh

[20]

Dịch chiết EtOH In vivo 100, 500 và

Dịch chiết EtOH In vitro 20mg/ml Kháng vi sinh vật [10]

Dịch chiết EtOH In vitro 10 đến 2000µg/ml Diệt côn trùng [18] Dịch chiết nước In vivo 100, 200mg/kg Ức chế thụ thể gây đau

Dịch chiết nước In vivo 100, 250, 500 và

Dịch chiết nước In vitro Hoạt tính chống oxi hoá [15]

Dịch chiết MeOH In vivo 100, 200mg/kg

Bảo vệ tế bào khỏi độc tính gây ra bởi EtOH đường uống

[5]

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, hoá chất, thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu

Nguyên liệu nghiên cứu bao gồm cơ quan sinh dưỡng (rễ, thân, lá) và cơ quan sinh sản (cụm hoa) của cây Pệnh nua thu hái ngày 07/3/2021 tại Viêng Chăn – Lào, đã được

giám định tên khoa học là Cnidoscolus aconitifolius (Mill.) I M Johnst Tiêu bản thực

vật hiện đang được lưu giữ tại Phòng tiêu bản cây thuốc - Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội (Số hiệu HNIP/18631/21) (Phụ lục 2) Dược liệu được rửa sạch, cắt nhỏ, phơi sấy ở 55oC đến độ ẩm dưới 10%, cho vào túi PE kín để bảo quản tại nơi thực hiện khoá luận (Bộ môn Dược học cổ truyền)

2.1.2 Hoá chất, thiết bị

2.1.2.1 Hoá chất thí nghiệm

- Bản mỏng tráng sẵn pha thường silicagel F254 (Merck), pha đảo RP18 F254s (Merck), chất hấp phụ silica gel pha thường (cỡ hạt 63-200 µm, Merck), pha đảo RP18 (30 - 50 µm, Merck)

- Dung môi, thuốc thử: ethanol (EtOH), n-hexan, ethyl acetat (EOA), dichloromethan (CH2Cl2), methanol (MeOH), nước cất (RO)

- Các hoá chất dùng trong nghiên cứu đặc điểm thực vật: Javen, acid acetic 5%, xanh methylen, đỏ son phèn

- Các hoá chất định tính: Alkaloid( Mayer, Dragendorff, Bouchardat), thuốc thử glycosid tim: Legal, Baljet, Keddle, Liebermanm-Burchard), Diazo mới pha, FeCl35%, gelatin 1%, chì acetat 10%, Fehling A và B, Ninhydrin,

2.1.2.2 Thiết bị nghiên cứu

- Sắc ký cột dùng chất hấp phụ là silica gel F254 cỡ hạt 60 - 200 µm (Merck), sephadex LH-20

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR), Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam (VAST)

- Kính hiển vi Nikon DS-Fi2, máy ảnh kỹ thuật số Canon, Bộ môn Thực vật - Trường Đại học Dược Hà Nội

- Máy cô quay 5 lít và 20 lít của BÜCHI, Thụy Sĩ

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu về đặc điểm thực vật

- Lẫy mẫu, mô tả đặc điểm hình thái, giám định tên khoa học

- Mô tả đặc điểm vi phẫu thân, lá

- Mô tả đặc điểm bột thân, bột lá

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hoá học

- Định tính các nhóm chất chính của bột lá bằng phản ứng hóa học thường quy

- Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hoá học của một số hợp chất trong lá

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu về đặc điểm thực vật

2.3.1.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái thực vật

- Quan sát tại thực địa và mô tả đặc điểm hình thái thực vật

- Lấy mẫu: Lấy mẫu cây, ép tiêu bản và lưu giữ tiêu bản: Tên khoa học được giám định bằng phương pháp so sánh hình thái, dựa trên các tài liệu thực vật phân loại loài, so sánh với bộ tiêu bản online của các phòng tiêu bản trong và ngoài nước [3], [13], [14], [25], với

sự giúp đỡ của chuyên gia phân loại thực vật

- Xác định tên khoa học của mẫu nghiên cứu dựa vào khóa phân loại tới họ, chi và loài trong tài liệu Đối chiếu với mô tả trong các tài liệu chuyên sâu về thực vật So sánh đối chiếu với mẫu tiêu bản tại một số phòng tiêu bản mẫu khô

2.3.1.2 Nghiên cứu đặc điểm vi học

- Chọn bộ phận làm vi phẫu:

• Đối với vi phẫu thân, phần thân được chọn là đoạn thân bánh tẻ (cách khoảng 20 – 25cm tính từ ngọn xuống ở thân chính)

• Đối với lá, lựa chọn các lá mọc ở phần thân cách ngọn 20 – 30cm Vị trí cắt vi phẫu

là phần phiến lá chứa gân chính, ở khoảng 1/2 – 1/3 phía dưới gốc lá

Các bộ phận thân, lá của mẫu nghiên cứu được cắt, tẩy, nhuộm kép theo phương pháp làm tiêu bản vi học thực vật, lên tiêu bản bằng phương pháp giọt ép Quan sát vi phẫu dưới kính hiển vi và xác định các đặc điểm vi phẫu

• Soi bột: Bộ phận dùng được phơi khô, nghiền thành bột, lên tiêu bản, quan sát dưới

kính hiển vi xác định và chụp ảnh những đặc điểm của bột qua kính hiển vi

2.3.2 Nghiên cứu về thành phần hoá học

mỏ dung tích 100 ml Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào một ống nghiệm, thêm một giọt chì acetat Nếu xuất hiện tủa thì ngừng lọc, thêm khoảng 1 ml chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy đều, lọc lại, và tiếp tục thử đến khi dịch lọc không còn tủa với chì acetat

Chuyển toàn bộ dịch lọc vào bình gạn dung tích 125 ml Lắc kỹ 2 lần với cloroform, mỗi lần 8 ml Gạn dịch chiết cloroform vào cốc có mỏ, loại nước bằng natri sulfat khan Chia đều dịch chiết vào 4 ống nghiệm nhỏ đã được sấy khô và đem bốc hơi trên nồi cách thuỷ đến khô Cắn thu được đem tiến hành các phản ứng sau:

• Phản ứng của khung steroid

- Phản ứng Liebermann – Bouchardat: Cho vào ống nghiệm chứa cắn 1 ml anhydrid

acetic, lắc đều cho tan hết cắn Nghiêng ống nghiệm 45o Cho từ từ theo thành ống 0,5 ml

H2SO4 đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Phản ứng dương tính nếu ở giữa hai lớp chất lỏng thấy xuất hiện vòng màu tím đỏ Lớp chất lỏng phía dưới có màu hồng, lớp trên có màu xanh lá

• Phản ứng của vòng lacton 5 cạnh

- Phản ứng Baljet: Hoà tan cắn trong ống nghiệm bằng 0,5 ml ethanol 90% Lắc đều

cho tan hết cắn Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha (gồm 1 phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%) Phản ứng dương tính nếu ống nghiệm thấy xuất hiện màu đỏ đến tím, so sánh màu sắc với ống chứng là ống không có cắn

- Phản ứng Legal: Hoà tan cắn trong ống nghiệm bằng 0,5 ml ethanol 90% Nhỏ 1

giọt thuốc thử natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10% Lắc đều, phản ứng dương tính nếu ống nghiệm thấy xuất hiện màu đỏ cam, so sánh màu sắc với ống chứng là ống không có cắn

• Phản ứng của phần đường

- Phản ứng Keller - Kiliani: Hoà tan cắn trong ống nghiệm bằng 0,5 ml ethanol 90%

Lắc đều cho tan hết cắn Nhỏ vào giọt dung dịch FeCl3 5% trong acid acetic, lắc đều Nghiêng ống nghiệm 45o Cho từ từ theo thành ống 0,5 ml H2SO4 đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Nếu có glycosid tim thì mặt tiếp xúc ở giữa hai lớp chất lỏng thấy xuất hiện vòng màu tím đỏ Lắc nhẹ, lớp chất lỏng phía trên sẽ có màu xanh lá

b Định tính alkaloid

Cân khoảng 3 gam bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 ml Thêm 20 ml dung dịch H2SO4 1N, đun sôi, để nguội Lọc dịch lọc vào bình gạn 100 ml Kiềm hoá dịch lọc bằng NH3 6N đến pH 9-10 Chiết alkaloid base bằng cloroform 3 lần, mỗi lần 5 ml Gộp dịch chiết cloroform, loại nước bằng Na2SO4 khan, dịch chiết lắc với H2SO4 1N 2 lần, mỗi lần 5 ml Gộp các dịch chiết nước thu được vào 3 ống nghiệm:

+ Ống 1: 1ml dịch chiết + 2 giọt thuốc thử Mayer

Phản ứng dương tính nếu ống nghiệm xuất hiện kết tủa trắng

+ Ống 2: 1ml dịch chiết + 2 giọt thuốc thử Dragendorff

Phản ứng dương tính nếu ống nghiệm xuất hiện kết tủa vàng

+ Ống 3: 1ml dịch chiết + 2 giọt thuốc thử Bouchardat

Phản ứng dương tính nếu ống nghiệm xuất hiện kết tủa nâu

c Định tính flavonoid

Cân khoảng 10 gam dược liệu (đã được sấy khô và chia nhỏ) cho vào bình nón, thêm

50 ml ethanol 90o Đun cách thuỷ vài phút, lọc nóng Dịch lọc thu vào các ống nghiệm dùng

để tiến hành các phản ứng định tính flavonoid

- Phản ứng Cyanidin: Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết, thêm một ít bột

magnesi kim loại (khoảng 10 mg) Nhỏ từng giọt HCl đặc (3-5 giọt) Để yên 1-2 phút Phản ứng dương tính khi dung dịch chuyển từ màu vàng sang đỏ

- Phản ứng với kiềm: Nhỏ 1-2 giọt dịch chiết lên một mảnh giấy lọc Sấy khô rồi để

lên miệng lọ amoniac đặc đã được mở nắp Phản ứng dương tính nếu màu vàng của dịch chiết tăng lên, có thể so sánh với giọt dịch chiết đối chứng

- Phản ứng với dung dịch FeCl 3 5%: Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết, thêm

vài giọt dung dịch FeCl3 5% Phản ứng dương tính nếu dung dịch xuất hiện màu xanh đen

d Định tính coumarin

Cân khoảng 10 gam dược liệu (đã được sấy khô và chia nhỏ) cho vào bình nón, thêm

50 ml ethanol 90o Đun cách thuỷ vài phút, lọc nóng Dịch lọc thu vào các ống nghiệm dùng

để tiến hành các phản ứng định tính coumarin

- Phản ứng mở đóng vòng lacton:

Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1 ml dịch chiết:

+ Ống 1: thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10%

+ Ống 2: để nguyên

Đun cách thuỷ cả 2 ống đến sôi, để nguội, quan sát hiện tượng Nếu có coumarin sẽ quan sát thấy ống 1 xuất hiện tủa đục màu vàng, ống 2 dung dịch vẫn trong Thêm vào cả

2 ống nghiệm mỗi ống 1 ml nước cất Lắc đều rồi quan sát thấy:

+ Ống 1: dung dịch trong suốt

+ Ống 2: tủa đục

Acid hoá ống 1 bằng vài giọt HCl đặc, ống 1 sẽ trở lại đục như ống 2

- Phản ứng diazo hoá: Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết, kiềm hoá bằng dung

dịch NaOH 10%, đun cách thuỷ đến sôi rồi để nguội, thêm vài giọt thuốc thử diazo mới pha, lắc đều Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu đỏ

e Định tính saponin

- Khả năng tạo bọt: Cho vào ống nghiệm lớn 0,1 gam bột dược liệu, thêm 5 ml nước

Lắc mạnh theo chiều dọc trong 1 phút (30 lần lắc) Để yên và quan sát hiện tượng tạo bọt Nếu lớp bọt bền vững sau 15 phút thì sơ bộ kết luận dược liệu có saponin

- Phản ứng Salkowski: Cho 2 gam bột dược liệu vào ống nghiệm, thêm 10 ml ethanol

90%, đun sôi cách thuỷ, lọc nóng Lấy 1 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm nhỏ, thêm vài giọt H2SO4 đậm đặc nhỏ theo thành ống nghiệm Phản ứng dương tính nếu mặt phân cách xuất hiện màu đỏ hoặc tím đỏ, lắc thấy đồng nhất

f Định tính tanin

Cân khoảng 5 gam bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml Thêm 50 ml nước cất, đun sôi cách thuỷ 20 phút, lọc nóng Dịch lọc để nguội làm các phản ứng định tính tanin như sau:

- Phản ứng với dung dịch FeCl 3 5%: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết nước, thêm

2-3 giọt dung dịch FeCl3 5% Phản ứng dương tính nếu xuất hiện kết tủa màu xanh đen

- Phản ứng với dung dịch chì acetat 10%: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết nước,

thêm 2-3 giọt dung dịch chì acetat 10% Phản ứng dương tính nếu xuất hiện kết tủa bông

- Phản ứng với dung dịch gelatin 1%: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết nước, thêm

2-3 giọt dung dịch gelatin mới pha Phản ứng dương tính nếu xuất hiện kết tủa bông trắng

g Định tính đường khử

Cân khoảng 5 gam bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml Thêm 50 ml nước cất, đun sôi cách thuỷ 20 phút, lọc nóng Dịch lọc để nguội, lấy 2 ml cho vào ống nghiệm, thêm 0,5 ml thuốc thử Fehling A và 0,5 ml thuốc thử Fehling B, đun cách thuỷ 10 phút Phản ứng dương tính nếu xuất hiện kết tủa đỏ gạch

h Định tính acid hữu cơ

Cân khoảng 5 gam bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml Thêm 50 ml nước cất, đun sôi cách thuỷ 20 phút, lọc nóng Dịch lọc để nguội, lấy 3 ml cho vào ống nghiệm, thêm một ít bột Na2CO3 Phản ứng dương tính nếu xuất hiện bọt khí bay lên

i Định tính acid amin

Cân khoảng 5 gam bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml Thêm 50 ml nước cất, đun sôi cách thuỷ 20 phút, lọc nóng Dịch lọc để nguội, lấy 2 ml cho vào ống nghiệm,

thêm 0,5 ml thuốc thử Ninhydrin 3%, đun cách thuỷ vài phút Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu tím

2.3.2.2 Phương pháp chiết xuất cao toàn phần và cao phân đoạn

Theo phương pháp chiết các phân đoạn theo độ phân cực tăng dần của dung môi

Lá được tách riêng khỏi các phần dược liệu khác, sẽ được cắt nhỏ, sấy ở nhiệt độ 65oC để đạt độ ẩm <10%, sau đó được xay thô bằng thuyền tán, được chiết bằng phương pháp chiết siêu âm với dung môi ethanol 96%; cất thu hồi dung môi được cắn, hòa cắn vào nước vừa

đủ, lần lượt lắc phân đoạn với dung môi có độ phân cực tăng dần (lần lượt theo thứ tự là hexan; ethyl acetat) Cất thu hồi dung môi các phân đoạn thu được cắn n-hexan (cắn Hexan);

n-cắn ethyl acetate (n-cắn EtOAc); n-cắn nước (n-cắn H2O)

Hình 2.1 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn

Quy trình cụ thể như sau:

a) Chiết xuất cao toàn phần:

Bước 1: Xử lý nguyên liệu:

- Lá được tách riêng khỏi các phần dược liệu khác, sẽ được cắt nhỏ, sau đó dải đều lên khay cho vào tủ sấy ở nhiệt độ 65oC Trong quá trình sấy, đảo nguyên liệu cứ 1h một

Phân đoạn nước

Cắn nước

Cắn

n-hexan

Cắn ethyl acetat

Thu hồi dung môi

- Lắc với ethyl acetat (3 lần)

(3 lần)

lần cho tới khi kiểm tra độ ẩm nguyên liệu < 10% Sử dụng thuyền tán làm nhỏ nguyên liệu

lá đã được sấy khô

- Với phần lá sau khi được nghiền nhỏ, được cho vào các bình thủy tinh dung tích 10L, cho vào khoảng 4/5 bình lá, sau đó bổ sung ethanol 96% sao cho đảm bảo phần lá trong bình đã ngập trong dung môi chiết và để những bình này ở nhiệt độ phòng 24h

Bước 2: Ngâm ấm và chiết siêu âm:

- Ngâm ấm: Sau khi các bình lá đã ngấm dung môi và mực dung môi thấp hơn mực nguyên liệu trong bình thì bổ sung thêm ethanol đảm bảo dung môi ngập trên lá Ngâm bình nguyên liệu trên vào bếp gia nhiệt, đặt nhiệt độ 45oC và ngâm liên tục trong 24h

- Siêu âm: Các bình sau khi ngâm ấm đủ ít nhất 24h, sẽ được siêu âm 3 lần liên tục, mỗi lần 30 phút, mỗi lần siêu âm cách nhau 30 phút Ngay sau lần siêu âm cuối, bình sẽ được mang chiết nóng thu dịch lọc, thu dịch lọc, còn cắn thì cho lại vào bình và bổ sung ethanol 96% vừa đủ cho ngập lá

Bước 3: Lặp lại bước 2 thêm 2 lần

- Dịch chiết thu được của 3 lần chiết siêu âm được gộp lại, rồi đem cô quay thu hồi dung môi, cắn thu được sau cô quay là cao toàn phần

b) Chiết xuất cao phân đoạn:

Bước 1: Cao toàn phần sau khi bay hơi hết dung môi, được xác định khối lượng cao

toàn phần Chia cao thành các phần có khối lượng khoảng 109,11 g Sử dụng bình gạn 2 lít, cho khoảng 109,11 g cao vào bình gạn, thêm nước cất cho được khoảng 1,5 lít cao và nước Lắc mạnh để cao có thể phân bố đều vào nước

Bước 2: Bổ sung khoảng 500ml dung môi n-hexan Lắc bình gạn trong 20 phút Để lắng

hỗn hợp tự phân lớp trong khoảng 24h Sau đó chiết lấy phần dịch n-hexan phía trên đem thu hồi dung môi được cắn n-hexan, phần dịch chiết nước phía dưới tiếp tục cho vào bình gạn

Bước 3: Lặp lại bước 2 thêm 2 lần nữa Cắn thu được trong 3 lần chiết được gộp vào

thành cắn n-hexan

Bước 4: Lần lượt chiết 3 dịch chiết nước bằng ethyl acetat, tương tự theo quy trình chiết

bằng dung môi n-hexan các bước số 2,3 Sau cùng ta thu được cắn n-hexan, cắn ethyl acetat

Các phân đoạn được phân lập bằng sắc ký cột silica gel pha thường (Merck), sắc ký cột silica gel pha đảo RP-18 và HPLC điều chế Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn 60 GF254 (Merck), RP-18 (Merck) Sắc ký lớp mỏng dùng để theo dõi vết các chất

từ các phân đoạn Sắc ký đồ được quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365

nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol

a) Phân lập bằng sắc ký cột

Nguyên tắc: Sắc ký cột hấp phụ dựa trên sự phân bố khác nhau của các thành phần

trong mẫu với hai pha không trộn lẫn, trong đó pha động là chất rửa giải, pha tĩnh là chất hấp phụ dạng bột mịn được nhồi trong cột thủy tinh Có thể triển khai liên tục với các hệ dung môi khác nhau có độ phân cực thay đổi từ yếu đến mạnh Chất nhồi cột là silica gel pha thường hoặc silica gel pha đảo

• Cột thủy tinh: chọn cột thủy tinh thành dày thích hợp, chiều dài cột gấp 3 lần thể tích silica gel cần thiết cho quá trình phân lập

• Pha tĩnh: lựa chọn pha tĩnh phụ thuộc vào độ phân cực của mẫu cần tách

➢ Phân lập bằng sắc ký cột silica gel pha thường (Merck)

Cách tiến hành:

Bước 1: Xác định khối lượng cao cần lên cột

Bước 2: Khảo sát hệ dung môi lựa chọn lên cột bằng cách chấm TLC pha thường

với các tỷ lệ dung môi khác nhau Lựa chọn một hệ dung môi thích hợp ban đầu để lên cột

Bước 3: Cân một lượng silicagel pha thường bằng 3 lần lượng mẫu cao cần lên cột

Lựa chọn cột sao cho lượng silicagel sau khi cho vào cột sẽ cao khoảng 20cm Hòa lượng silicagel trên vào khoảng 1000 ml dung môi đã được lựa chọn để lên cột ban đầu thu được hỗn dịch dung môi - silicagel Đồng thời cao mẫu cần đưa lên cột sẽ dược phối hợp với một lượng silicagel tối thiểu để cho hỗn hợp cao – silicagel tơi xốp, hỗn hợp này được đem vào

tủ sấy 50o C, sấy trong 8h

Bước 4: Lót bông dưới cột đã chọn, cho hỗn dịch dung môi - sicagel lên cột, mở

khóa, thu dung môi, chạy luyện cột 2-3 lần bằng lượt dung môi thu được Ngâm silicagel trong dung môi trên cột trong 24h trước khi cho cao lên cột

Bước 5: Cho mẫu cao lên cột: Hỗn hợp cao - silicagel được nghiền nhẹ trước khi bổ

sung lên cột Sau khi cho hỗn hợp cao-silicagel lên cột hoàn toàn thì bổ sung dung môi được lựa chọn ban đầu lên từ từ cho tới khi thấm ướt hoàn toàn cao - silicagel

Bước 6: Hứng và gom dịch rửa giải: quá trình rửa giải, dịch rửa được hứng bằng

ống thủy tinh Trong quá trình thì dung môi sẽ được thay đổi tỷ lệ phù hợp Dịch rửa giải trong các ống được gom lại dựa vào kết quả phân tích sắc ký lớp mỏng

➢ Phân lập bằng sắc ký cột silica gel pha đảo RP-18

Cách tiến hành:

Bước 1: Xác định khối lượng cao cần lên cột

Bước 2: Khảo sát hệ dung môi lựa chọn lên cột bằng cách chấm TLC pha đảo với

các tỷ lệ dung môi khác nhau Thông thường sử dụng là MeOH và Nước thì có thể khảo sát các hệ MeOH:Nước, sau đó lựa chọn được hệ dung môi ban đầu để lên cột

Bước 3: Dùng hệ dung môi để lên cột ban đầu luyện cột, sao cho lượng dung môi

chạy hết 2 lần silicagel trên cột

Bước 4: Cho cao lên cột: khóa cột khi dung môi trên cột vừa chạy hết trên bề mặt

silicagel Hòa tan lượng cao cần lên cột với một lượng tối thiểu methanol, bổ sung hết lượng dịch trên lên cột Sau đó mở khóa cột, ngay khi lượng dịch cao thấm hết vào silicagel thì

bổ sung một lượng nhỏ dung môi lên cột ban đầu lên Sau khi lượt dung môi này di chuyển hết vào silicagel thì bổ sung từ từ dung môi chạy cột ban đầu lên cột và bắt đầu hứng dịch rửa giải Bổ sung dung môi với tỷ lệ phù hợp trong các lần sau

Bước 5: Hứng và gom dịch rửa giải: quá trình rửa giải, dịch rửa được hứng bằng

ống thủy tinh Dịch rửa giải trong các ống được gom lại dựa vào kết quả phân tích sắc ký lớp mỏng

Bước 6: Rửa cột: Sau khi xác định hết chất trên cột bằng TLC, tiến hành rửa cột

bằng dung dịch MeOH-acid và MeOH

2.3.3.3 Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)

Được sử dụng để thăm dò hệ dung môi tách và theo dõi quá trình rửa giải

Nguyên tắc: dựa trên cơ chế hấp phụ Chất phân tích sau khi chấm lên bản mỏng sẽ di

chuyển trên một lớp chất hấp phụ mịn, theo một chiều nhất định Quá trình chạy sắc ký phụ

thuộc vào hệ dung môi pha động và khả năng hấp phụ của thành phần trong chất phân tích

2.3.3.4 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất

Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa vào các tính chất hóa lý (trạng thái, màu sắc, độ quay cực, ), dữ liệu phổ khối (ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H NMR, 13C-NMR) và so sánh các dữ liệu thu được từ thực nghiệm với các tài liệu đã công

bố [23]

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết quả nghiên cứu đặc điểm thực vật

3.1.1 Đặc điểm hình thái và giám định tên khoa học

Cây thân gỗ, mọc thẳng đứng, cao tới 2 - 3m, thân phân nhánh, toàn cây có nhựa mủ trắng Thân có đốm trắng rải rác, khi trưởng thành hoá thành sẹo, bề mặt nhẵn, không có lông Thân có thiết diện tròn, đường kính có thể lên tới 25 - 30cm Mặt cắt ngang thân quan sát thấy vòng nhựa mủ Lõi thân chứa mô mềm xốp Lá đơn, mọc vòng xung quanh thân,

lá tập trung nhiều ở ngọn, lá già rụng để lại sẹo lồi ở thân Cuống lá dài, có thể tới 50cm Gân lá dạng chân vịt Phiến lá hình tam giác, xẻ sâu tới cuống, tạo 7 thuỳ xuất phát từ cuống Mỗi thuỳ lại xẻ lần 2 Mép lá không có răng cưa Mặt trên và mặt dưới lá đều nhẵn, không có lông, màu xanh

Hình 3.1 Hình thái và dạng sống

(Ghi chú: 1 Toàn cây; 2 Rễ cây; 3 Thân cây; 4 Thân cắt ngang; 5 Thân chẻ dọc; 6 Lá

và cụm hoa)

Hình 3.2 Đặc điểm cơ quan sinh dưỡng

(Ghi chú: 1 Cành và cách mọc lá; 2 Thân; 3 Thân cắt ngang; 4,5 Lá kèm và dấu vết khi rụng; 6 Ngọn chứa cụm hoa non, 7 Cách phân nhánh ở thân; 8 Gốc lá; 9,10 Lá (mặt

trên và mặt dưới); 11 Cụm hoa)

Cụm hoa dạng xim 2 ngả Trục cụm hoa dài 50 – 70cm Hoa lưỡng tính, mẫu 5 Đài hình ống, hàn liền ở gốc, màu trắng – trắng ngà, hình cánh hoa Cánh đài hình trứng Nhị hoa 10, chia thành 2 vòng nhị 5 + 5, vòng ngoài chỉ nhị ngắn hơn nằm bên trong ống đài, vòng trong chỉ nhị dài, nhô cao lên hơn ống đài Chỉ nhị vòng trong hàn liền 1 phần Bao phấn đính lưng, hình thận dài, nứt dọc, màu trắng Vòi nhuỵ dài, phần dưới hàn liền, phần trên tách thành 3 vòi nhuỵ phụ Nhuỵ hình cầu Bầu nhuỵ 3 ô, noãn 3, hình trứng Quả hình trứng, màu xanh, có 6 gân dọc là dấu hiệu của lá noãn hàn liền, trong chứa 3 hạt, hình trứng

Hình 3.3 Đặc điểm cơ quan sinh sản

(Ghi chú: 1 Cụm hoa; 2,3,4,5 Cách phân nhánh trục cụm hoa; 6 Hoa nhìn ngang; 7

Hoa nhìn từ trên xuống; 8 Hoa bổ dọc; 9 Mặt ngoài đài hoa; 10 Mặt trong đài hoa; 11

Bộ nhị - nhuỵ; 12 Quả; 13 Quả bổ ngang; 14.15 Hạt)

3.1.2 Đặc điểm vi phẫu

a) Đặc điểm vi phẫu lá

Gân lá: Đi từ dưới lên trên, vi phẫu gân lá gồm các bộ phận: Biểu bì dưới (1) gồm lớp

tế bào hình chữ nhật xếp thành một hàng đều đặn, sát nhau, trên biểu bì không có lông Tiếp theo là mô dày góc (2) gồm 4 - 5 hàng tế bào hình đa giác có góc dày lên, sắp xếp sát nhau, bắt màu hồng đậm, nằm xen kẽ bên trong có các tinh thể canxi oxalat hình cầu gai Mô mềm vỏ (3) chiếm phần lớn diện tích thiết diện gân chính, gồm các tế bào hình đa giác kích thước không đều nhau có thành tế bào mỏng, sắp xếp lộn xộn và sát nhau, chỉ để hở khoảng gian bào rất nhỏ Trong mô mềm có chứa các đám tế bào mô mềm libe (7) và các tế bào tiết

lớn chứa nhựa mù Bó libe – gỗ với libe phía ngoài (4) có thành mỏng bằng cellulose, bắt màu đỏ, tạo thành 1 vòng bao quanh gỗ (6) ở trong, bắt màu xanh của thuốc nhuộm Mô dày góc trên (8) tập trung ở trung tâm gân lá, nằm dưới biểu bì trên (9)

Phiến lá hướng lên Từ dưới lên trên: Biểu bì dưới (10) là một hàng tế bào hình chữ

nhật, kích thước không đồng đều Tiếp theo là mô xốp (11) gồm các tế bào sắp xếp lộn xộn, hình dạng không đồng đều, nằm ngay trên biểu bì dưới Mô giậu (12) nằm vuông góc với biểu bì trên, gồm một hàng tế bào hình chữ nhật sắp xếp đều đặn, và sát nhau, mang nhiều

hạt diệp lục, nằm dưới biểu bì trên (13) Các đặc điểm lá được mô tả trong Hình 3.3

Hình 3.4 Đặc điểm vi phẫu phiến lá

(Ghi chú: Gân lá: 1 Biểu bì dưới; 2 Mô dày góc dưới; 3 Mô mềm vỏ; 4 Libe; 5 Tế bào

tiết; 6 Gỗ; 7 Mô mềm libe; 8.Mô dày góc trên; 9 Biểu bì trên

Phiến lá: 10 Biểu bì dưới; 11 Mô xốp; 12 Mô giậu; 13 Biểu bì trên)

Cuống lá: Mặt cắt ngang vi phẫu cuống lá hình tròn đối xứng tâm Từ ngoài vào trong

gồm: Biểu bì (1) là một lớp tế bào hình chữ nhật xếp xít nhau có vách dày hoá cutin Dưới biểu bì là 3 – 4 lớp tế bào mô dày phiến (2) chứa các tế bào tiết (3) nằm rải rác, hình trứng,