DANH MỤC CÁC BẢNG 1.1 Phân bố của một số loài Trà hoa vàng ở Việt Nam 4 – 7 2.1 Đặc điểm mô tả trong nghiên cứu đặc điểm thực vật 18 2.2 Khối lượng cắn thu được của mẫu nghiên cứu 20 2.
TỔNG QUAN
Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật chi Camellia L
1.1.1 Vị trí phân loại chi Camelia L
Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan năm 2009 [48], vị trí phân loại của chi Camellia L được ghi nhận như sau:
1.1.2 Đặc điểm thực vật chi Camellia L
Theo Trần Ninh & Hakoda Naotoshi và Võ Văn Chi, đặc điểm hình thái của chi Camellia L được mô tả như sau:
Cây bụi hoặc cây nhỏ thường xanh, cành nhẵn hay có lông Lá thường có cuống; đơn mọc cách, không có lá kèm, kích thước lá thay đổi, dài từ vài cm đến 45 cm; chất lá dày mỏng khác nhau; chóp lá nhọn, có đầu nhọn hoặc kéo dài thành đuôi; gốc lá hình nêm hẹp, nêm rộng, tròn hay hình tim; mép có răng cưa nhọn hay tù Hoa đều, lưỡng tính, kích thước lớn hoặc nhỏ, mọc đơn độc hoặc tập trung 2-5 hoa ở nách lá hoặc đỉnh cành Hoa màu đỏ, trắng hay màu vàng Cuống hoa ngắn hoặc gần như không Lá bắc 2-10, mọc xoắn trên cuống hoa, tồn tại hoặc sớm rụng Lá đài 5 phiến, tồn tại hoặc sớm rụng Cánh hoa 4-19, hợp một phần ở gốc cùng với vòng nhị ngoài Nhị nhiều, những nhị ngoài thường dính nhau thành cái chén hay ống ở phía gốc; vòng nhị phía trong rời nhau; chỉ nhị dài Bầu trên, 1-5 ô; vòi nhụy 1-5, dạng sợi, rời hoặc dính nhau ở mức độ khác nhau, bầu và vòi nhụy nhẵn hay phủ lông mịn Quả nang hình cầu, hình cầu dẹt hoặc hình trứng, khi khô chẻ ô từ trên xuống thành 3, 4 hay 5 mảnh; có trụ quả hay không; vỏ quả dày hay mỏng, hoá gỗ Hạt thường 1 đến
4 nhiều hạt trong mỗi ô, hình cầu, nửa cầu hay hình nêm, vỏ hạt màu nâu, nâu hạt giẻ nhạt hoặc nâu hồng, phủ lông hay nhẵn [5], [9]
Trên thế giới, chi Camellia L có khoảng 280 loài, phân bố chủ yếu ở nhiệt đới và á nhiệt đới, có nguồn gốc ở khu miền đông và miền nam châu Á, từ phía đông dãy Himalaya tới Nhật Bản và Indonesia Hiện nay, các loài của chi này đã được phát hiện ở nhiều châu lục trên thế giới
- Châu Á: Ấn độ, Bangladesh, Đài Loan, Hàn Quốc, Indonesia, Iran, Malaysia, Myanmar, Nepal, Nhật Bản, Sri-lanka, Trung Quốc, Việt Nam
- Châu Âu: Thổ Nhĩ Kỳ, Liên Xô cũ
- Châu Phi: Burundi, Ethiopia, Kenya, Maritius, Nam Phi, Uganda
- Khu vực Nam Mỹ: Argentina, Brazil, Ecuador, Peru
- Châu Đại Dương: Australia, New-Zeland Ở Việt Nam, chi Camellia L có khoảng 58 loài [9], trong đó có hơn 40 loài có màu vàng được phân bố từ phía Bắc (Yên Bái, Thái Nguyên, Vĩnh Phúc, Quảng Ninh, Bắc Giang, v.v) vào phía Nam (Lâm Đồng, Bình Phước, v.v) (Bảng 1.1)
Bảng 1.1: Phân bố của một số loài Trà hoa vàng ở Việt Nam
STT Tên khoa học Tên thường gọi Phân bố Ghi chú
1 Camellia aurea H.T.Chang Trà hoa vàng kim
VQG Bù Gia Mập, Bình Phước
Trà đầu VQG Cát Tiên,
4 Camellia cattienensis Orel Trà Cát Tiên VQG Cát Tiên,
Trà hoa vàng Quảng Ninh, Vĩnh
Trà hoa vàng Cúc Phương
VQG Cúc Phương, Ninh Bình
Trà mi Đà Lạt Đà Lạt, Lâm Đồng
10 Camellia dongnaiensis Orel Trà hoa vàng Đồng Đồng Nai [34]
Trà gân Bắc Giang, Quảng
13 Camellia flava (Pitard) Sealy Trà hoa vàng nhạt
Ninh Bình, Hòa Bình, Nghệ An
Chè sốp Khánh Hòa, Vĩnh
16 Camellia hakodae Ninh Trà vàng
Trà hoa vàng Hàm Yên
Trà hoa vàng Hữu Lũng
21 Camellia indochinensis Merr Lạng Sơn [34]
23 Camellia kirinoi Ninh Trà hoa vàng
Trà hoa vàng da cam
25 Camellia luongii Tran et Le Thái Nguyên [34]
26 Camellia luteocerata Orel Lâm Đồng [34]
30 Camellia ninhii Luong & Le Lâm Đồng [17]
31 Camellia nitidissima C.W.Chi Phía bắc Việt
35 Camellia rosmannii Ninh Trà hoa vàng
Trà Sơn Thái Sơn Thái, Khánh
Trà hoa vàng Tam Đảo
40 Camellia tienii Ninh.T Hải đường hoa vàng
Trà hoa vàng Bắc Bộ
43 Camellia vidalii Rosmann Lâm Đồng [34]
1.1.4 Đặc điểm một số loài Trà hoa vàng phân bố ở Quảng Ninh
Quảng Ninh là một tỉnh thuộc vùng Đông Bắc Việt Nam Những năm gần đây, sản phẩm Trà hoa vàng ở Quảng Ninh đã trở thành một thương hiệu uy tín được nhiều người biết đến Hiện nay, có 3 loài trà ở Quảng Ninh đã được nghiên cứu đặc điểm hình thái và công bố trên các tạp chí khoa học nổi tiếng Không dừng lại ở đó, việc tìm hiểu các loài Trà hoa vàng ở nơi đây vẫn được tiếp tục thực hiện
Loài này được thu thập tại tỉnh Quảng Ninh vào năm 1962 bởi một nhà thực vật học Trung Quốc Hiện nay, nó được tìm thấy và trồng nhiều ở huyện Ba Chẽ Cành con mảnh, không lông Lá có phiến tròn, dài 11-14 x 4-5 cm, không lông, bìa có răng nhỏ, gân-phụ khoảng 10 cặp; cuống 6-7 mm Hoa mọc đơn độc; hoa vàng đậm; lá bắc 5; lá dài 5; cánh hoa 8-10, dài 3 cm, nhị nhiều; bầu không lông, vòi 3-4 dính nhau một phần Quả nang to 3 cm, vỏ quả dày 3 mm [8], [51] Loài này có nhiều điểm tương đồng với loài Camellia nitidissima nên năm 1994 nhà thực vật Trung Quốc Chang Hung Ta cho rằng Camellia chrysantha là đồng nghĩa của Camellia nitidissima [22] Tuy nhiên cho đến ngày nay tính tương đồng này vẫn còn gây nhiều tranh cãi
- Camellia euphlebia Merr Ex Sealy
Loài trà này được tìm thấy ở huyện Ba Chẽ, tỉnh Quảng Ninh Là loài cây gỗ nhỏ, vỏ nhẵn màu xám mốc; lá có dạng hình trứng thuôn dài, mép lá có răng cưa dài,
8 mặt trên lá nhẵn bóng, có màu xanh thẫm, mặt dưới xanh nhạt, hơi ráp Gốc lá hình nêm hay tù, đầu lá hơi nhọn, lá dài bình quân 9-15 cm, rộng 4-7 cm Mỗi bên lá có 9-12 gân, gân lá hợp cách mép lá 0,2 – 0,6cm Hoa màu vàng tươi, đường kính hoa
5 – 6 cm, hoa nở vào tháng 10 đến tháng giêng năm sau; số lượng hoa trên cây nhiều, hoa mọc ở đầu cành hay nách lá.[7]
- Camellia rosmannii Ninh Được công bố trên International Camellia Journal năm 1998, loài Trà này có nguồn gốc từ vùng núi Yên Tử, huyện Uông Bí, tỉnh Quảng Ninh Là loài cây bụi cao khoảng 3 m, cành nhẵn, tán lá hình elip, dài 10,5-13,5 cm x rộng 5-5,6 cm, có 9-11 cặp gân bên, cuống lá dài 6-7 Hoa, màu vàng mọc ở nách lá Đường kính 4,5-
5 cm, cuống ngắn (1,5 mm); lá đài 6; cánh hoa 15; nhị hoa dài 3-3,2 cm, vòng nhị ngoài dính ở gốc, noãn 3 ô, dài 2-2,2 cm, nhẵn; hạt hình cầu, hạt đơn ở mỗi vị trí, đường kính 1,8-2 cm Loài này mọc dọc theo bờ suối trong rừng thứ sinh, độ cao khoảng 150 mét Thời kỳ ra hoa, tháng 11 đến tháng 1 Quả chín vào tháng Năm Loài này gần giống với C ellphlebia Men Nhưng có những khác biệt: những bông hoa có cuống rất ngắn, các hạt có lông măng [50].
Thành phần hóa học
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học trong các loài trà thuộc chi Camellia L Đến nay người ta đã ghi nhận được hàng trăm các hợp chất trong trà và chúng được chia thành các nhóm: alcaloid nhân purin (cafein, theobromin, theophylin, xanthin), nhóm polyphenol, nhóm flavonoid (kamepferol, quercetin), saponin triterpenoid, acid hữu cơ (acid oxalic, acid nicotinamic, acid ascorbic,v.v), acid béo (acid palmitic, acid stearic, acid oleic,v.v), protein, acid amin, pectin và tinh dầu (methyl salicylat, citronellon,v.v) [12], [31], [56] Trong đó, các nhóm sau được quan tâm nhiều nhất vì có các tác dụng sinh học quan trọng quyết định tính chất của trà
Thành phần polyphenol của lá Trà rất đa dạng, bao gồm chủ yếu là các flavonoid và tanin [2], [10] Đối với lá Trà xanh, các hợp chất này có thể chiếm tới
30% sau khi sấy khô [31] Người ta đã phân lập được từ Trà xanh các chất polyphenol có nhiều tác dụng đáng chú ý là: epicatechin (EC), galocatechin (GC), epicatechin gallat (ECG), epigallocatechin gallat (EGCG) Trong đó, EGCG là thành phần chủ yếu có nhiều nghiên cứu quan trọng, làm trung gian cho hầu hết các tác dụng sinh học như giúp ổn định huyết áp, hạ đường huyết, hạ lipid máu, chống ung thư, kháng khuẩn … [40], [42], [54] Năm 2011, Lixia Song và các cộng sự đã nghiên cứu thành phần polyphenolic trong sáu loài Trà hoa vàng thu hái ở Trung Quốc: C impressinervis, C euphlebia, C microcarpa, C nitidissima, C tunghinensis và C chrysanthan, kết quả cho thấy rằng so với lá trà thường được tiêu thụ, lá Trà hoa vàng chứa các hợp chất phenolic đa dạng hơn, bao gồm: ellagitannin, proanthocyanidin, taxifolin deoxyhexose, dẫn xuất apigenin, dẫn xuất kaempferol, dẫn xuất quercetin, glucosyl isorhamnetin, (epi)cate-chin-(epi)afezelechin polymers và platphylloside [46]
Hình 1.1: Công thức cấu tạo một số loại cathechin
Flavonoid tồn tại trong trà với một lượng đáng kể và có nhiều tác dụng sinh học quan trọng Năm 2018, Nguyễn Thị Hồng Vân và cộng sự đã phân lập thành công và xác định cấu trúc hóa học của năm hợp chất flavonoid glycoside từ hoa của
Trà hoa vàng Camellia chrysantha gồm: vitexin (1), quercetin-3-O-β-D- glucopyranoside (2), quercetin-7-O-β-D-glucopyranoside (3), quercetin-3’-O-β-D- glucopyranoside (4) và quercetin-3-O-rutinose (5) [11] Trong đó hợp chất quercetin-
7-O-β-D-glucopyranoside đã được nghiên cứu là có tác dụng oxy hóa cao [54] Một nghiên cứu của Xiao Peng và các cộng sự năm 2012 cũng cho thấy được tác dụng của hợp chất flavonoid được phân lập từ hoa củaCamellia nitidissima ức chế tăng sinh tế bào ung thư hạch [55]
1.2.3 Nhóm saponin: Đến nay, một loạt các terpen và triterpenoid saponin đã được báo cáo từ lá, hạt và hoa của các loài thuộc chi Camellia L Saponin từ lá của C sinensis được
Machida nghiên cứu lần đầu tiên vào năm 1938 Do hàm lượng thấp, nó không gây được nhiều sự chú ý cho đến khi một vài saponin hoạt tính sinh học trong lá trà được tìm thấy Ví dụ, theasaponin B1, isotheasaponin B1 – B3, foliatheasaponin I-V từ C sinensis; assamsaponin J từ C sinensis var assamica; camellioside A-B từ C japonica,… [15], [56] Nghiên cứu từ các saponin này đã cho thấy nhiều tác dụng sinh học đáng quan tâm như: chống khối u, kháng khuẩn, kháng viêm, kháng nấm, chống béo phì, [47], [56].
Tác dụng sinh học
1.3.1 Tác dụng chống oxy hóa
Có rất nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng hoạt động chống oxi hóa của Trà xanh (Camellia sinensis) là do hoạt tính của các nhóm hợp chất như: polyphenol, flavonoid, saponin,… Trong đó, polyphenol là nhóm có tác dụng chính [10], [12],
[31], [56] Hoạt lực của các catechin trong Trà mạnh hơn vitamin E từ 1,3 đến 32 lần Nồng độ ức chế 50% tác dụng chống oxy hóa của epigalocatechin mạnh gấp 32 lần vitamin E, của epicatechin gấp 12,8 lần Đặc biệt EGCG chiếm 32% tiềm năng chống oxy hóa [12]
Những năm gần đây, các nghiên cứu về tác dụng chống oxy hóa của Trà hoa vàng càng trở nên phổ biến [41], [46], [54], [59] Năm 2015 nghiên cứu về đặc tính và thành phần chống oxy hóa trong lá của Trà hoa vàng (Camellia chrysantha (Hu)
Tuyama) của trường đại học y Quảng Tây, Trung Quốc đã được thực hiện Kết quả là 16 biến đã được tìm thấy có hoạt động ức chế gốc DPPH (1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl) Sáu trong số chúng được xác định là catechin (1), epicatechin (5), vitexin (8), isovitexin (10), quercetin-7-ObD-glucopyranoside (12) và kaempferol
(16) và hoạt tính chống oxy hóa của chúng, tính theo tỷ lệ % ức chế DPPH trong
12 dung dịch nước được sắp xếp như sau: (12) > (1) > (5) > (16) > (8) > (10) [54] Trước đấy, vào năm 2011, nghiên cứu của Lixia Song từ chiết xuất lá của 6 loài Trà hoa vàng: C impressinervis, C euphlebia, C microcarpa, C nitidissima, C tunghinensis, and C chrysantha cũng đã ghi nhận tác dụng chống oxy hóa trong các loài này và đặc biệt là C impressinervis có mức độ oxy hóa cao nhất [46]
1.3.2 Tác dụng kháng vi sinh vật
Từ xa xưa, Trà được biết đến như là một vị thuốc có khả năng sát khuẩn tốt trong dân gian Ngày nay, các nhà khoa học đã chứng minh được tác dụng kháng vi sinh vật của Trà thông qua các nghiên cứu thực nghiệm Từ đó, người ta nhận thấy rằng polyphenol trong Trà xanh Camellia sinensis đặc biệt là EGCG đóng vai trò quan trọng trong tác dụng sinh học này [20], [23], [30], [45] Cụ thể, nghiên cứu về tiềm năng kháng khuẩn của dịch chiết nước Camellia sinensis đã cho thấy những kết quả khả quan [28] Sử dụng các phương pháp đánh giá tác dụng kháng khuẩn như: phương pháp khuếch tán đĩa thạch, phương pháp tại chỗ, xác định MIC và MBC của dịch chiết nước Camellia sinensis, … nghiên cứu đã cho thấy được tác dụng của Trà xanh lên cả vi khuẩn gram âm và vi khuẩn gram dương Đặc biệt, phát hiện quan trọng nhất của nghiên cứu này là tác dụng ức chế đối với các vi sinh vật kháng thuốc, ví dụ: MRSA và P aeruginosa [27] Tác dụng ức chế của polyphenol trong trà đối với sự phát triển và tăng trưởng của bào tử vi khuẩn được nghiên cứu Polyphenol trong trà, đặc biệt là EGCG cho thấy tác dụng kháng khuẩn mạnh mẽ đối với Bacillus stearothermophilus, là một vi khuẩn hình thành bào tử ưa nhiệt và Clostridium thermoaceticum, vi khuẩn kỵ khí hình thành bào tử Khả năng chịu nhiệt của các bào tử vi khuẩn này đã giảm nhiều hơn khi bổ sung polyphenol trong trà ở nhiệt độ cao
[45] Ngoài tác dụng kháng vi khuẩn thì Trà xanh cũng được ghi nhận là có tác dụng kháng một số loại virus và nấm như: HBV, HCV, Candida albicans,… [23], [30],
[56] Năm 2003, Masatomo Hirasawa và Kazuko Takada đã đăng tải một bài báo nghiên cứu tác dụng của catechin trà xanh khi phối hợp với các thuốc kháng nấm
13 điển hình chống lại Candida albicans Kết luận của bài báo chỉ ra rằng EGCG tăng cường tác dụng kháng nấm của amphotericin B hay fluconazole để chống lại C albicans nhạy cảm với thuốc và kháng thuốc Điều trị kết hợp với catechin cho phép sử dụng liều thấp hơn của thuốc kháng nấm nhưng vẫn có nhiều hiệu quả trong điều trị chống nấm, từ đó có thể giúp tránh các tác dụng phụ của thuốc [23]
Gần đây nhất, năm 2018, nhận thấy được tác dụng kháng khuẩn của Trà hoa vàng Camellia nitidissima trên các vi khuẩn gram (-) và gram (+) đặc biệt là Pseudomonas aeruginosa trong các nghiên cứu trước đó [21], [53], Rui Yang và các cộng sự của mình đã tiến hành nghiên cứu sâu hơn tác động các nhóm hợp chất từ
Trà hoa vàng Camellia nitidissima lên sự sản xuất pyocyanin của Pseudomonas aeruginosa Được biết rằng pyocyanin là độc tố được tiết ra từ trực khuẩn mủ xanh, quá trình tổng hợp pyocyanin chủ yếu được kiểm soát bởi quá trình QS (QS: Quorum sensing, là một dạng “ngôn ngữ giao tiếp của vi khuẩn”) Mục tiêu của nghiên cứu là phát triển những chất ức chế (QSI) có thể làm giảm các yếu tố độc nhưng không tiêu diệt vi khuẩn, do đó tránh sự kháng kháng sinh Kết quả là các hợp chất của hoa
Camellia nitidissima có thể là chất ức chế đại biểu tiềm năng của P aeruginosa [44]
Hiện nay, trên thế giới cũng như Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về tác dụng kháng vi sinh vật của các loài Trà hoa vàng Vì vậy đây cũng chính là hướng đi chính của đề tài này
- Tác dụng chống ung thư : Đây là tác dụng được tập trung nghiên cứu nhiều năm trở lại đây của các nhà khoa học Nhiều báo cáo đã chứng minh được tác dụng chống ung thư của các loài Trà nói chung và Trà hoa vàng nói riêng, đặc biệt là thành phần EGCG [15], [31], [36], [56], [59] Nghiên cứu in-vitro cũng đã cho thấy kết quả có tác dụng ức chế khối u của các flavonoid từ Trà hoa vàng [36] Tuy nhiên, chúng ta vẫn cần phải nghiên cứu sâu hơn về hoạt động cũng như cơ chế chống ung thư của loài trà này
- Tác dụng hạ đường huyết : Tác dụng này của Trà xanh đã được ghi nhận trong quyển Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam [12] Đối với Trà hoa vàng, Lai Wang và cộng sự đã tiến hành điều tra tác dụng hạ đường huyết của
Camellia chrysantha trên mô hình chuột mắc bệnh tiểu đường loại 2 So với nhóm mẫu, cả ba nhóm chiết xuất C chrysantha gồm: chiết thô, chiết ethyl acetate/dichloromethane và chiết n-butyl alcohol đều cho tác dụng hạ đường huyết, trong đó chiết xuất ethyl acetate / dichloromethane thể hiện tác dụng hiệu quả nhất
- Tác dụng hạ huyết áp : Cũng như tác dụng hạ đường huyết, tác dụng này cũng đã được ghi nhận ở nhiều nghiên cứu các loài Trà Tuy nhiên đến nay người ta cũng chưa biết rõ được cơ chế tác dụng của nó Có nhiều giả thuyết cho rằng nhờ vào tác dụng của EGCG trong việc cải thiện chức năng tim mạch mà làm giảm được huyết áp, tuy nhiên thì tác dụng này vẫn cần phải nghiên cứu thêm [40], [56].
Một số phương pháp thử tác dụng kháng khuẩn
Ngày nay với sự phát triển của khoa học, có rất nhiều phương pháp thử tác dụng kháng vi sinh vật đã ra đời Tuy nhiên, không phải phương pháp nào cũng thực sự phù hợp với các sản phẩm có nguồn gốc từ thực vật Sau đây là một số phương pháp nên được sử dụng để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết từ thực vật 1.4.1 Phương pháp khuếch tán đĩa thạch (Agar disk diffusion assay)
Thử nghiệm khuếch tán đĩa Agar được phát triển vào năm 1940, được sử dụng rộng rãi để thử hoạt động kháng khuẩn của chiết xuất thực vật mặc dù có nhiều sự hạn chế
Nguyên lý: Hoạt chất có trong chế phẩm thử khuếch tán vào môi trường dinh dưỡng có VSV chỉ thị tại các vùng ức chế tỷ lệ thuận với logarid nồng độ Mẫu thử được cho vào các giếng thạch đã được đục sẵn trong đĩa môi trường nuôi cấy Sau thời gian nuôi cấy thích hợp (18h), đo đường kính vùng ức chế để đánh giá khả năng ức chế VSV của mẫu nghiên cứu [6], [14], [16], [32], [43]
1.4.2 Phương pháp pha loãng thạch (Agar dilution assay)
Là một phương pháp được các nhà nghiên cứu sử dụng để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của kháng sinh Đây là phương pháp pha loãng được sử dụng thường xuyên nhất để kiểm tra hiệu quả của kháng sinh mới khi một vài loại kháng sinh được thử nghiệm trên một nhóm lớn các vi khuẩn khác nhau
Nguyên lý: Phương pháp pha loãng thạch bao gồm việc kết hợp các nồng độ khác nhau của chất chống vi trùng vào thạch tan chảy, pha loãng hai lần nối tiếp, sau đó cấy vào môi trường cấy vi khuẩn xác định trên bề mặt đĩa thạch Điểm cuối MIC được ghi nhận là nồng độ thấp nhất của chất chống vi trùng ức chế hoàn toàn sự tăng trưởng trong điều kiện ủ thích hợp [14], [32]
1.4.3 Một sô phương pháp khác
1.4.3.1 Phương pháp pha loãng trên 96 đĩa giếng (Broth microdilution) Đây là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất để thực hiện thử nghiệm này tại Hoa Kỳ
Nguyên lý: Trong quá trình thử nghiệm, nhiều đĩa microtiter chứa đầy nước dùng gồm Brucella và chất bổ sung máu Nồng độ khác nhau của mẫu thử và vi khuẩn được kiểm tra sau đó được thêm vào đĩa Sau đó, tấm được đặt vào lò ấp không CO2 và được nung nóng ở nhiệt độ 35°C trong 16 đến 20 giờ Sau thời gian quy định, tấm được lấy ra và kiểm tra sự phát triển của vi khuẩn Nếu nước dùng trở nên đục hoặc một lớp tế bào hình thành ở đáy, thì sự phát triển của vi khuẩn đã xảy ra Các kết quả của phương pháp vi lọc nước dùng được báo cáo nồng độ ức chế tối thiểu (MIC), hoặc nồng độ kháng sinh thấp nhất đã ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn [16], [32]
1.4.3.2 Phương pháp sinh học tự động (Bioautography)
Năm 1946, Goodall và Levi đã kết hợp phương pháp sắc ký giấy (PC) với phương pháp sinh học tiếp xúc để phát hiện các loại penicillin khác nhau Sau đó, Fischer và Lautner đã giới thiệu phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) Kỹ thuật này
16 kết hợp TLC với cả phương pháp phát hiện sinh học và hóa học Một số nghiên cứu đã được thực hiện trên sàng lọc các chất chiết xuất hữu cơ, chủ yếu là chiết xuất từ thực vật, cho hoạt động kháng khuẩn và kháng nấm bằng phương pháp sinh học TLC Phương pháp này bao gồm 3 kỹ thuật: khuếch tán agar, sinh học trực tiếp và xét nghiệm lớp phủ agar [14], [16], [32]
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu, thiết bị
Các mẫu Trà hoa vàng thu hái tại Ba Chẽ (Quảng Ninh) ngày 11/02/2020 được giám định tên khoa học và lưu giữ mẫu tại Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược
Hà Nội Mã số tiêu bản: HNIP/18617/20
Phương pháp xử lý mẫu:
- Mẫu nghiên cứu đặc điểm thực vật (hình thái và làm tiêu bản mẫu khô): mẫu tươi cành mang lá, hoa
- Mẫu nghiên cứu tác dụng sinh học: mẫu lá tươi sau khi thu hái một ngày được làm sạch bằng cách rửa kĩ với nước, sau đó sấy khô ở 55°C, nghiền nhỏ
Thiết bị nghiên cứu đặc điểm thực vật:
- Kính lúp soi nổi Leica EZ4
- Kính hiển vi A Kruss Optronic GmbH
- Máy ảnh kỹ thuật số Canon EOS 60D + Canon 100mm f2.8 Macro
Thiết bị nghiên cứu tác dụng sinh học:
- Cân phân tích AC ADAPTER
- Tủ ấm nuôi cấy VSV
- Tủ an toàn sinh học cấp II
- Nồi hấp tiệt trùng HIRAYAMA HV50
- Các dụng cụ thủy tinh được rửa, tiệt trùng ở 121ᴼC trong 30 phút trước và sau khi làm thí nghiệm
- Các dụng cụ khác bằng nhựa và kim loại được tiệt trùng bằng cồn 90ᴼ sau mỗi lần tiến hành thực nghiệm
- Dung môi: ethanol, DMSO, nước cất, HCl, NaOH
- Hóa chất: cao nấm men, pepton, NaCl, agar, glucose, cao Malt, xanh methylene, đỏ son phèn, acid acetic, nước javen
- Các chủng VSV kiểm định: Bacillus subtilus (ATCC 6633), Candida albicans (ATCC 10231), Escherichia coli (ATCC 8739), Pseudomonas aeruginosa
(ATCC 9027), Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Shigella flexneri
- Kháng sinh đối chứng dương: Penicillin G, Gentamicin, Nystatin (kháng sinh thương phẩm)
Nội dung, phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái
Mô tả phân tích đặc điểm hình thái của các mẫu nghiên cứu theo phương pháp mô tả phân tích [1], [3] Trong nghiên cứu các đặc điểm được mô tả thuộc các nhóm: Dạng sống, thân, lá, hoa (Bảng 2.1)
Bảng 2.1 Đặc điểm mô tả trong nghiên cứu đặc điểm thực vật
STT Cơ quan Các đặc điểm mô tả
1 Dạng sống Dạng sống, chiều cao
2 Thân Hình dạng thân già, bề mặt cành non
3 Lá Cách mọc của lá, cuống lá, hình dạng phiến, hình dạng mép, số cặp gân chính, kích thước, bề mặt trên, bề mặt dưới
4 Hoa Kiểu cụm hoa, số hoa mỗi cụm, lá bắc, đài (hịnh dạng, bề mặt), tràng (hình dạng, tràng phụ), bộ nhị (số lượng, hình
19 dạng, kích thước, liền/rời), bộ nhụy (hình dạng kích thước lá noãn, vòi nhụy)
2.1.1.2 Nghiên cứu đặc điểm vi học
- Đặc điểm vi phẫu: Lá (bánh tẻ) và cành ngâm trong cồn 70°, được làm theophương pháp tiêu bản thực vật thông thường, bao gồm: cắt, tẩy và nhuộm kép Tiêu bản được soi và chụp ảnh qua kính hiển vi Kruss ở các vật kính x4, x10, x40 sử dụng máy ảnh kỹ thuật số Các đặc điểm cấu tạo giải phẫu của thân và lá được mô tả và phân tích theo nguyên tắc nghiên cứu tiêu bản vi phẫu [1]
- Đặc điểm bột: Dược liệu sau khi thu hái được sấy khô, nghiền mịn thành bột, rây cho bột có kích thước thích hợp Tiếp theo Bột dược liệu được đặt trên phiến kính có sẵn giọt nước cất, đậy lá kính và quan sát các đặc điểm dưới kính hiển vi Tiến hành chụp ảnh và mô tả các đặc điểm của bột dược liệu [4]
2.1.1.3 Giám định tên khoa học
Tên khoa được xác định dựa trên khóa luận phân loại và mô tả loài trong các tài liệu về thực vật trong và ngoài nước “Cây cỏ Việt Nam” [8], “Các loài trà ở Vườn Quốc Gia Tam Đảo” [9] và “Flora of China” [49]
2.2.2 Nghiên cứu tác dụng sinh học
Lá trà sau khi rửa sạch, sấy khô ở 55°C, xay thành bột dược liệu, rây (355 –
1400) được chiết trong 3 dung môi: H2O, Ethanol 50% và Ethanol 96% Cân chính xác thành 3 phần bột dược liệu, mỗi phần 30 g Thấm ẩm mỗi phần với mỗi dung môi ở trên trong 1h
- Với dung môi là H2O: Thêm dung môi đến 250 ml, đun sôi trong 1h, lọc lấy dịch chiết Tiếp tục chiết lần 2, 3 với thể tích dung môi mỗi lần là 200ml
- Với dung môi là Ethanol 50% và Ethanol 96%: Thêm dung môi đến 250ml, chiết siêu âm trong 30 phút, lọc lấy dịch chiết Tiếp tục chiết lần 2, 3 với thể tích dung môi mỗi lần là 150ml
Lọc, gộp dịch chiết của 3 lần chiết và cô cách thủy 80°C đến cắn, sấy khô ở 45°C đến khối lượng không đổi Cân khối lượng cắn thu được, kết quả trong Bảng 2.2
Bảng 2.2 Khối lượng cắn thu được của mẫu nghiên cứu
Lượng dược liệu trong 1g cao (g) 5,6300 9,1491 9,705
2.2.2.2 Thử tác dụng kháng VSV bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch
- Nguyên tắc : hoạt chất có trong chế phẩm thử khuếch tán vào môi trường dinh dưỡng có VSV chỉ thị tại các vùng ức chế tỷ lệ thuận với logarid nồng độ Mẫu thử được cho vào các giếng thạch đã được đục sẵn trong đĩa môi trường nuôi cấy Sau thời gian nuôi cấy thích hợp (18h), đo đường kính vùng ức chế để đánh giá khả năng ức chế VSV của mẫu nghiên cứu [6]
+ Mẫu thử tác dụng kháng VSV:
• Mẫu 1: Hòa tan 0,2g cắn của dịch chiết H2O trong 2ml DMSO 2%
• Mẫu 2: Hòa tan 0,2g cắn của dịch chiết Ethanol 50% trong 2ml DMSO 2%
• Mẫu 3: Hòa tan 0,2g cắn của dịch chiết Ethanol 96% trong 2ml DMSO 2% + Môi trường nuôi cấy:
• Môi trường Luria-Bertani thạch (nuôi cấy vi khuẩn):
• Môi trường Luria-Bertani dịch thể:
• Môi trường Yeast-Malt thạch (nuôi cấy vi nấm):
Thạch agar 16 g/l Nước cất vừa đủ
• Môi trường Yeast-Malt dịch thể:
Nước cất vừa đủ + Chủng VSV kiểm định: Các chủng VSV dùng để thử nghiệm và kháng sinh sử dụng làm chứng dương được trình bày trong Bảng 2.3
Bảng 2.3 Chủng VSV và kháng sinh sử dụng làm chứng dương
STT Chủng VSV sử dụng Đối chứng dương sử dụng
• Cân đầy đủ các hóa chất môi trường cho vào bình nón, lắc đều cho hóa chất tan hoàn toàn Điều chỉnh pH về 7,0 bằng HCl và NaOH 1N Hấp tiệt trùng tại 121 ᴼ C trong 20 phút
• Chuẩn bị đĩa thạch: Đổ môi trường thạch vào các hộp petri (20ml/hộp)
• Các chủng VSV được nuôi trong môi trường dịch thể ở 37 ᴼ C đối với vi khuẩn và 32 ᴼ C đối với nấm men trong 18h trước khi thử hoạt tính.Pha loãng môi trường dịch thể chứa VSV đến khi đạt độ đục trong khoảng 0,5 độ McFarland Dùng tăm bông vô trùng cấy VSV lên bề mặt môi trường thạch chứa trong đĩa petri
• Trên đĩa môi trường thạch, tạo các giếng có đường kính 6 mm sau đó nhỏ vào mỗi giếng 100 μl mẫu thử Đối chứng dương: Penicillin G (2,5 μg/giếng), Gentamicin (5 μg/giếng), Nystatin (2,5 μg/giếng), đối chứng âm: 100 μl DMSO 2%
• Các đĩa được ủ ở 37 ᴼ C đối với vi khuẩn và 32 ᴼ C đối với nấm men
• Đánh giá hoạt tính kháng VSV sau 18h: quan sát đĩa thạch xem có vòng vô khuẩn hay không Nếu có, đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước kẹp Panmer có độ chính xác ± 0,1 mm
• Thí nghiệm được lặp lại 3 lần
• Đường kính vòng vô khuẩn được xác định bằng phương pháp thống kê
D: đường kính trung bình vòng vô khuẩn
𝐷̅: trung bình cộng các đường kính vòng vô khuẩn của mẫu thử 𝑆𝐷: độ lệch chuẩn
𝐷𝑖: đường kính vòng vô khuẩn thứ i (i: 1→ n, n Є N*)
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Kết quả thực nghiệm
3.1.1 Kết quả nghiên cứu đặc điểm thực vật
3.1.1.1 Đặc điểm hình thái của Trà hoa vàng Ba Chẽ, Quảng Ninh
Cây gỗ nhỏ, cành nhẵn, không có lông Lá đơn, mọc so le, không có lá kèm Cuống lá dài 1,5 – 2 cm, nhẵn, lõm ở mặt trên Phiến lá hình elip, nhẵn, dài 9,5 – 17,5 cm, rộng 2,5 – 4,6 cm, cứng, dày và dai, mặt trên màu xanh thẫm, nhẵn bóng, mặt dưới màu xanh nhạt, nhẵn, có nhiều điểm tuyến màu đen Gốc lá có hình nêm Đỉnh lá nhọn, dài từ 0,7 – 1 cm Mép lá có răng cưa, khía răng nông nhỏ, tương đối đều, phía gốc gần như không có răng cưa Gân chính nổi rõ, lóm ở mặt trên, lồi ở nặt dưới, có 8 – 10 cặp gân bên, không có lông, gân lá hình lông chim, hợp cách mép lá 0,2 – 0,5 cm
Hoa đều, lưỡng tính, mọc đơn độc ở nách lá Đường kính hoa khi nở từ 3,5 –
4 cm Cuống hoa nhẵn, dài 1 cm Lá bắc 5 – 8, hình móng, màu xanh, mặt ngoài nhẵn, mặt trong có lông mịn, dài 0,2 – 0,9 cm Lá đài 5, màu vàng hơi xanh, mặt ngoài nhẵn, mặt trong có lông trắng mịn, kích thước 0,6 – 1,2 cm Tràng hoa 11, màu vàng, nhẵn, dài 2,3 – 4 cm, rộng khoảng 1,5 – 2,5 cm Tràng hoa phía trong dính với nhau và dính vào vòng nhị ngoài ở gốc 1 cm Bộ nhị nhiều, có khoảng 300 chỉ nhị, chỉ nhị nhẵn, dài 2 – 3,2 cm, chỉ nhị vòng ngoài dính nhau ở gốc, chỉ nhị vòng trong rời, bao phấn 2 ô Bộ nhụy 3 – 4 lá noãn hợp thành bầu 3 – 4 ô, mỗi ô chia 2 ngăn, đính noãn trung trụ, vòi nhụy 3 – 4 , rời, không có lông, dài khoảng 2,5 cm Quả và hạt chưa thu hái được
Dựa trên các đặc điểm hình thái, đối chiếu với khóa phân loại trong Thực vật chí Trung quốc [50] xác định được tên khoa học của mẫu là: Camellia nitidissima
Hình 3.1: Đặc điểm hình thái Trà hoa vàng
1 Cành mang hoa 5 Gốc lá 8 Cấu tạo hoa 11 Bầu cắt ngang
2 Lá 6 Mép lá 8a+8b Tràng hoa 12 Hoa
3 Mặt trên và mặt dưới lá 7a Lá bắc 9 Bộ nhụy
4 Đỉnh lá 7b Lá đài 10 Bộ nhị
3.1.1.2 Đặc điểm vi phẫu a Vi phẫu lá
Hình 3.2: Vi phẫu lá Trà hoa vàng
1 Biểu bì dưới 4 Mô cứng 7 Mô dày trên 10 Mô giậu
2 Mô dày 5 Libe 8 Biểu bì trên 11 Mô khuyết
3 Mô mềm dưới 6 Mạch gỗ 9 Thể cứng 12 Tinh thể calci oxalat
Mặt cắt ngang phiến lá gồm 2 phần: Gân và phiến lá
Phần gân lá lồi cả 2 mặt, mặt dưới lồi rõ Từ dưới lên trên gồm các phần: Biểu bì dưới (1) gồm một lớp tế bào hình chữ nhật dẹt kích thước không đều, có phủ một lớp cutin mỏng Kế biểu bì là mô dày (2) gồm 3-4 lớp tế bào hình đa giác, thành dày ở góc bắt màu đỏ đậm, kích thước không đều, xếp sít nhau Mô mềm dưới (3) gồm các lớp tế bào hình tròn, kích thước không đều nhau, thành mỏng, xếp lộn xộn Mô cứng (4) gồm 2-5 lớp tế bào hình đa giác kích thước không đều nhau, có vách dày
27 bắt màu xanh đậm sắp xếp tạo thành một cung bao quanh bó libe-gỗ Bó libe-gỗ xếp thành hình cung có gỗ ở trên, libe phía dưới; libe (5) gồm nhiều lớp tế bào hình đa giác kích thước đều, xếp lộn xộn thành từng đám; mạch gỗ (6) hình đa giác hay tròn xếp thành dãy xen lẫn với mô mềm gỗ (tế bào hình vuông hay đa giác) có vách dày hóa gỗ, tỉ lệ giữa chiều dài của bó libe – gỗ xấp xỉ 2 Nằm rải rác trong mô mềm là thể cứng (9) kích thước lớn nhánh nhọn, đa hình dạng và các tinh thể calci oxalate
(12) hình cầu gai Mô dày trên (3-5 lớp tế bào) (7) và biều bì trên (1 lớp tế bào) (8) có cấu tạo tương tự mô dày dưới và biểu bì dưới
Phần phiến lá: Biểu bì (1), (8) gồm một lớp tế bào hình chữ nhật tương tự gân lá, lỗ khí có thể quan sát được ở biểu bì dưới Mô giậu (10) gồm các tế bào thuôn dài xếp xít nhau Mô khuyết (11) gồm các lớp tế bào đa giác hoặc tròn, sắp xếp lộn xộn b Vi phẫu thân
Mặt cắt ngang thân cây có thiết diện gần tròn, gồm những bộ phận sau:
Biểu bì (1) gồm một lớp tế bào hình chữ nhật tương đối đều nhau, phía ngoài có phủ lớp cutin Mô mềm vỏ (2) gồm nhiều lớp tế bào đa giác, kích thước không đều, sắp xếp lộn xộn Vòng mô cứng (3) gồm 3 – 4 lớp tế bào sợi, kích thước không đều, thành dày hóa gỗ, bắt màu xanh, kích thước không đều nhau Bó libe gỗ cấp hai có libe ở ngoài, gỗ nằm phía trong Libe cấp hai (5) gồm các tế bào hình tròn, kích thước không đều, xếp thành dãy xuyên tâm Trong libe xuất hiện rải rác các thể cứng
(4) và các tinh thể calci oxalat (8) với kích thước khác nhau Gỗ cấp hai (6) liên tục, mạch gỗ hình đa giác hoặc vuông tròn, kích thước không đều Mô mềm ruột (7) gồm các lớp tế bào hình tròn, kích thước không đều nhau
Hình 3.3: Vi phẫu thân Trà hoa vàng
1 Biểu bì 3 Mô cứng 5 Libe 7 Mô mềm ruột
2 Mô mềm vỏ 4 Thể cứng 6 Mạch gỗ 8 Tinh thể calci oxalat
Bột lá có màu nâu vàng, mùi thơm nhẹ, vị chát Quan sát dưới kính hiển vi thấy các đặc điểm sau: các mảnh biểu bì mang lỗ khí (1); lỗ khí hình hạt đậu có kích thước khoảng 35 àm (2); mảng mụ mềm gồm cỏc tế bào hỡnh chữ nhật xếp khớt nhau
(3); tinh thể calci oxalat hỡnh cầu gai cú kớch thước 20 àm (4); thể cứng dài khoảng
100 àm (5); mảnh biểu bỡ mang mạch xoắn (6); mạch xoắn cú kớch thước 95 – 100 àm (7)
Hình 3.4: Một số đặc điểm của bột lá Trà hoa vàng
1 Biểu bì mang lỗ khí; 2 Lỗ khí; 3 Mô mềm; 4 Tinh thể calci oxalate;
5 Thể cứng; 6 Mảnh biểu bì mang mạch xoắn; 7 Mạch xoắn
3.1.2 Kết quả nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn
Các kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn được trình bày trong Bảng 3.1
Bảng 3.1 Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn
Chủng VSV thử tác dụng Đường kính vòng vô khuẩn (mm) ( 𝐷̅ ± SD)
Kháng sinh đối chứng dương
Chú thích: (-): âm tính; (+/-): tác dụng chưa rõ ràng
Hình 3.5: Vòng vô khuẩn của kháng sinh và các mẫu thử trên các chủng vi khuẩn
Chú thích: 1 Mẫu thử cắn của dịch chiết H 2 O; 2 Mẫu thử cắn của dịch chiết Ethanol 50%; 3 Mẫu thử cắn của dịch chiết Ethanol 96%; KS Kháng sinh đối chứng dương
Mẫu thử của cắn ethanol 50% (100 mg/ml) có tác dụng ức chế trên 4 chủng vi khuẩn gram (+) và vi khuẩn gram (-) bao gồm: B subtilis, S aureus, P aeruginosa,
S flexneri Trong đó, đường kính vòng vô khuẩn của mẫu thử với 2 chủng gram (-) là P aeruginosa và S flexneri tương đương đường kính của kháng sinh đối chứng (gentamicin, 5 μg/giếng) Đối với 2 chủng vi khuẩn gram (+) là B subtilis và S aureus, đường kính vòng vô khuẩn của mẫu thử lần lượt bằng khoảng 2/3 và 1/3 so với đối chứng (penicillin G, 2,5 μg/giếng)
Mẫu thử của cắn H2O (100 mg/ml) có tác dụng trên 3 chủng gồm: B subtilis,
S aureus, P aeruginosa Đường kính của các vòng vô khuẩn không chênh lệch nhiều so với mẫu của cắn Ethanol 50 Mẫu thử của dịch chiết nước cũng có tác dụng đối với S flexneri nhưng không rõ, đường kính vòng vô khuẩn nhỏ (~7-8 mm).
Mẫu thử của cắn Ethanol 96% (100 mg/ml) không có tác dụng rõ đối với các chủng vi sinh vật kiểm định
Các mẫu thử đều không thể hiện tác dụng đối với chủng E coli và nấm C albicans.
Bàn luận
Về đặc điểm hình thái, mẫu Camellia thu hái tại vùng Đạp Thanh, Ba Chẽ,
Quảng Ninh được xác định tên khoa học là Camellia nitidissima C.W.Chi, Theaceae
Loài này được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1948, phân bố tập trung chủ yếu ở phía tây nam tỉnh Quảng Tây, Trung Quốc và phía bắc Việt Nam [60] Tuy nhiên đến nay người ta vẫn chưa phát hiện được loài này ở các vùng núi phía bắc của Việt Nam như Tam Đảo (Vĩnh Phúc), VQG Cúc Phương hay Ba Chẽ (Quảng Ninh) Việc xác định được tên khoa học và mô tả hình thái của loài Trà hoa vàng này trong đề tài đã góp phần bổ sung dữ liệu vào việc phân loại chi Camellia L., từ đó là cơ sở cho các đề tài nghiên cứu về Trà hoa vàng sau này
So sánh giữa 2 loài Camellia nitidissima ở Quảng Tây, Trung Quốc [21], [58] và vùng núi Đạp Thanh, Ba Chẽ, Quảng Ninh, ta nhận thấy vẫn có sự khác biệt nhỏ giữa 2 loài này: chiều dài cuống lá, số lá bắc, chiều dài chỉ nhị, đặc biệt lá của loài ở Quảng Tây, Trung Quốc thì có lông trong khi lá được thu hái ở Quảng Ninh, Việt Nam thì nhẵn Lý giải cho sự khác biệt này thì có thể cho rằng chúng là 2 thứ hay giống khác nhau của cùng một loài, hoặc sự khác biệt này là do vùng sinh trưởng khác nhau (Bảng 3.2) Tuy nhiên, vẫn cần có sự nghiên cứu kĩ hơn về vấn đề này Năm 1994, tại Hội nghị chuyên đề quốc tế về Camellia chrysantha tại Nam Ninh, Trung Quốc, nhà thực vật Chang Hung Ta đã đưa ra ý kiến rằng Camellia chrysantha là tên đồng nghĩa của Camellia nitidissima [22] Từ thời điểm đó, Camellia chrysantha đã được chính thức công nhận là một từ đồng nghĩa của Camellia nitidissima Tuy nhiên, đến ngày nay vẫn còn sự tranh cãi về tính đồng nghĩa, quyền ưu tiên và tính hợp lệ của từng loài dẫn đến sự không thống nhất giữa 2 loài này trong các nghiên cứu Vì vậy, chúng tôi cũng tiến hành so sánh đặc điểm hình thái của 2 loài Camellia nitidissima và Camellia chrysantha [10] (ở đây chúng tôi sử dụng kết quả mô tả hình thái của loài Camellia chrysantha được thu hái ở Ba Chẽ, Quảng Ninh trong luận văn năm 2016 “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, xác định hàm lượng polyphenol và EGCG, thử độc tế bào và chống oxy hóa của Trà hoa vàng tại Ba Chẽ
- Quảng Ninh” của thạc sĩ Ngô Thị Thảo ) và nhận thấy rắng tuy có nhiều sự tương đống nhưng vẫn có những sự khác biệt đặc trưng giữa 2 loài là: chiều dài cuống lá, kích thước phiến lá, chiều dài cuống hoa, đường kình hoa nở và cách mọc của hoa (Bảng 3.2) Vì chưa thu hái được quả và hạt nên sự so sánh ở trên chưa đủ, cần thu hái lại và tiến hành nghiên cứu sâu hơn
Bảng 3.2 So sánh đặc điểm hình thái của 3 loài Trà hoa vàng Camellia nitidissima (vùng Quảng Tây, Trung Quốc), Camellia nitidissima (vùng Ba
Chẽ, Quảng Ninh) và Camellia chrysantha (vùng Ba Chẽ, Quảng Ninh)
(vùng Quảng Tây, Trung Quốc)
(vùng Ba Chẽ, Quảng Ninh)
(vùng Ba Chẽ, Quảng Ninh) Cuống lá
Chiều dài 7 -11 mm 15 – 20 mm 6 – 7 mm Đặc điểm Nhẵn Nhẵn
Phiến lá Kích thước phiến lá dài 11 – 16 cm, rộng 2,5 – 4,5 cm, đỉnh nhọn dài 9,5 – 17,5 cm, rộng 2,5 – 4,6 cm, đỉnh nhọn
Dài 9,8 – 16 cm, rộng 3,5 – 7,5 cm, đỉnh nhọn
Hình dạng Hình elip, hình thuôn hoặc hình trứng thuôn, có lông
Hình elip, nhẵn Hình elip, nhẵn
Hoa Cách mọc Nách Nách Đầu cành hay nách lá
Cuống hoa 7 – 10 mm 10 mm Rất ngắn, gần như không thấy Đường kính khi nở
Lá bắc 5, hình trứng rộng, dài 2 – 3 mm
Lá đài 5, dài 4 – 8 mm, 5, dài 6 – 12 mm
Tràng 8 – 12, dài 1,5 – 3 cm, rộng 1,2 – 2 cm dính ở gốc với chỉ nhị ngoài
11, dài 2,3 – 4 cm, rộng khoảng 1,5 – 2,5 cm, dính ở gốc với chỉ nhị ngoài và dính với nhau
8 – 10, dài 3 cm, dính ở gốc với chỉ nhị ngoài và dính với nhau
Bộ nhị Chiều dài chỉ nhị
Nhẵn, dài 1,2 cm Nhẵn, dài 2 –
Những năm gần đây, loài Trà hoa vàng Camellia nitidissima ở Trung Quốc đang bị đe dọa trước nguy cơ tuyệt chủng do tác động của con người đến môi trường sống của loài thực vật này [60] Việc tìm thấy loài Trà này ở Việt Nam giúp cho việc bảo tồn và nhân giống dễ dàng thực hiện hơn Vì vậy, ngoài việc mở rộng nghiên cứu, chúng ta cũng cần có những biện pháp để bảo vệ loài Trà hoa vàng này
Về đặc điểm giải phẫu, các đặc điểm cấu tạo giải phẫu thân và lá của Camellia nitidissima ở vùng Ba Chẽ, Quảng Ninh mang nhiều đặc điểm đặc trưng của chi Camellia L như đặc điểm có vòng mô cứng hình cung bao quanh bó libe – gỗ ở gân lá, có nhiều thể cứng tương đối lớn, rải rác ở cả cành và lá, trong mô mềm của gân lá có rất nhiều tinh thể calci oxalat hình cầu gai
Về đặc điểm của bột, khi soi bột của mẫu dưới kính hiển vi ta có thể thấy được có rất nhiều thể cứng, tinh thể calci oxalat hình cầu gai và lỗ khi được tìm thấy, ngoài ra còn có các mô mềm, biểu bì, … đều phù hợp với đặc điểm cấu tạo giải phẫu của lá được mô tả Ngoài ra, khi quan sát tính chất của bột, ta thấy được mùi thơm và vị chát đặc trưng của Trà
3.2.2 Về tác dụng kháng khuẩn
Nghiên cứu tác dụng kháng vi sinh vật bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch là phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn cho các dịch chiết từ dược liệu được sử dụng phổ biến hiện nay với các ưu điểm đơn giản, chi phí thấp, nhanh chóng, khả năng kiểm tra số lượng lớn vi sinh vật và chất kháng vi sinh vật, dễ dàng giải thích kết quả Tuy nhiên phương pháp này không hiệu quả để định lượng hoạt tính sinh học, không phân biệt được tác dụng diệt khuẩn và kìm khuẩn Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) không thể xác định được Nhìn chung, đây là phương pháp thường được
36 sử dụng để sàng lọc sơ bộ, như là các xét nghiệm định tính Khả năng kháng VSV được thể hiện qua đường kính vòng vô khuẩn [14], [16], [32], [43] Ngoài ra, Trà hoa vàng trước đó chưa có nhiều nghiên cứu về thử tác dụng sinh học nên cũng gặp khó khăn ban đầu trong việc xác định nồng độ để thử tác dụng
Test sơ bộ cho thấy mẫu lá Trà hoa vàng nghiên cứu có tác dụng kháng khuẩn trên cả vi khuẩn gram (+) và vi khuẩn gram (-) Đặc biệt là có tác dụng trên những chủng vi khuẩn gây ra các bệnh nhiễm trùng nghiêm trọng cho động vật và con người: trực khuẩn mủ xanh P aeruginosa là nguyên nhân gây ra các bệnh viêm phổi, nhiễm trùng huyết,…, tụ cầu vàng S.aureus có thể gây viêm phổi, viêm tủy xương, viêm cơ tim,…, và , S flexneri là tác nhân chính gây bệnh kiết lị [4] Trong đó, mẫu thử từ dịch chiết của dung môi Ethanol 50% và H2O cho thấy tác dụng kháng khuẩn còn mẫu thử từ dịch chiết của dung môi còn lại là Ethanol 96% cho tác dụng không rõ ràng Có thể là do dịch chiết H2O và Ethanol 50% gần với kinh nghiệm dân gian là nước sắc
Thế giới đã có nhiều nghiên cứu chi tiết về tác dụng kháng khuẩn của chi
Camellia L cụ thể là Trà xanh Camellia sinensis, từ xác định tác dụng của các dịch chiết, thậm chí là các hợp chất có trong lá Trà đến xác định MIC trên các chủng vi khuẩn Kết quả cho thấy được Trà xanh với dịch chiết H2O và dịch chiết Ethanol cho tác dụng tốt trên nhiều chủng vi khuẩn gram (+) và gram (-), kể cả các chủng đa kháng thuốc, và nó cũng tác dụng trên cả các chủng vi khuẩn được nghiên cứu trong đề tài: B.subtilis, S.aureus, P.aeruginosa, S flexneri, E.coli [18], [24], [26], [27] So sánh với kết quả nghiên cứu của mẫu Trà hoa vàng trong đề tài này, ta thấy mẫu nghiên cứu không có tác dụng trên khuẩn E.coli như Trà xanh Đối với nấm, Trà xanh cũng được ghi nhận có tác dụng trên một số chủng là: C tropicalis, C albicans,
C parapsilosis, C cruzei [25], trong khi đó loài Trà hoa vàng này không có tác dụng trên chủng nấm C albicans Như vậy, ta thấy được phổ tác dụng trên các chủng VSV của Trà xanh Camellia sinensis rộng hơn so với loài Trà hoa vàng Camellia
37 nitidissima đang nghiên cứu, do sự hạn chế về thời gian nên đề tài mới chỉ có thể nghiên cứu trên 5 chủng khuẩn và 1 chủng nấm, vì vậy nên tiếp tục mở rộng nghiên cứu trên các chủng khuẩn và nấm khác để thu thập được nhiều dữ liệu hơn làm tiền đề cho việc nghiên cứu sâu hơn về tác dụng này Ngoài ra, trong đề tài này, chúng tôi chưa thể so sánh được tác dụng kháng khuẩn của Trà hoa vàng Camellia nitidissima có tốt hơn Trà xanh Camellia sinensis do chưa có điều kiện để xác định
MIC, đồng thời cũng chưa thể so sánh tác dụng giữa các bộ phận khác nhau trong cùng một cây do chưa thu hái được quả và hạt