Nguyễn thanh huyền nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm in vitro và in silico của tinh dầu một số loài thuộc chi piper l , họ piperaceae luận văn thạc sĩ dược học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THANH HUYỀN NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN VÀ KHÁNG NẤM IN VITRO VÀ IN SILICO CỦA TINH DẦU MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI Piper L., HỌ PIPERACEAE LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THANH HUYỀN NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN VÀ KHÁNG NẤM IN VITRO VÀ IN SILICO CỦA TINH DẦU MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI Piper L., HỌ PIPERACEAE LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH DƯỢC MÃ SỐ: 8720208 Người hướng dẫn: PGS TS Phạm Thế Hải PGS TS Phạm Minh Quân Nơi thực nghiên cứu: Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI – 2023 LỜI CẢM ƠN Trong trình thực luận văn, em nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ động viên quý báu từ thầy cô giáo, gia đình bạn bè Em xin bày tỏ kính trọng biết ơn tới PGS.TS Phạm Thế Hải PGS.TS Phạm Minh Quân - Người định hướng, trực tiếp dẫn dắt cố vấn cho em để em hồn thành luận văn Em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới DS.NCS Nguyễn Thanh Tùng – người thầy giúp đỡ, động viên, tận tình bảo để em mở mang thêm nhiều kiến thức hữu ích, giúp em có hướng đắn suốt thời gian qua Em xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo cán công tác trường Đại học Dược Hà Nội giảng dạy, dìu dắt truyền nhiệt huyết cho em suốt trình học tập trường Em xin gửi lời cảm ơn tới nhóm nghiên cứu gồm SV Dương Quang Quý, SV Nguyễn Thạch Liên đồng hành suốt trình thực nghiên cứu Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình bạn bè ln động viên, giúp đỡ em suốt q trình thực luận văn học tập Do điều kiện chủ quan khách quan, luận văn cịn có thiếu sót Em mong nhận ý kiến đóng góp quý giá Quý Thầy Cơ hội đồng để luận văn hồn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 03 tháng 04 năm 2023 Học viên Nguyễn Thanh Huyền MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 Chi Piper L Việt Nam 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Đặc điểm thực vật 1.1.3 Đặc điểm phân bố chi Piper L Việt Nam 1.1.4 Danh mục loài thuộc chi Piper L Việt Nam 1.1.5 Thành phần hóa học lồi thuộc chi Piper L Việt Nam 1.1.6 Công dụng chi Piper L 11 1.1.7 Tác dụng sinh học chi Piper L 13 1.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm in vitro 15 1.2.1 Phương pháp khuếch tán 15 1.2.2 Phương pháp pha loãng 16 1.3 Mơ hình in silico sàng lọc tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm 17 1.3.1 In silico nghiên cứu phát triển thuốc 17 1.3.2 Quy trình xây dựng phân tích PPIN 18 1.3.3 Mô docking protein 20 Chương NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Nguyên liệu nghiên cứu 23 2.1.1 Mẫu nghiên cứu 23 2.1.2 Các chủng vi sinh vật thử nghiệm 23 2.1.3 Các sở liệu gen, tương tác protein - protein vi sinh vật thử nghiệm 23 2.1.4 Các cơng cụ tính tốn 24 2.1.5 Hóa chất, thiết bị dùng nghiên cứu 24 2.2 Nội dung nghiên cứu 26 2.3 Phương pháp nghiên cứu 26 2.3.1 Phân tích thành phần hóa học tinh dầu loài Piper betle f densum, Piper betle L., Piper pierrei C DC thuộc chi Piper L 26 2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm in vitro mẫu tinh dầu 27 2.3.3 Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm in silico số thành phần hóa học mẫu tinh dầu 29 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 33 3.1 Kết phân tích thành phần tinh dầu GC-MS 33 3.1.1 Kết phân tích tinh dầu mẫu P betle f densum GCMS 33 3.1.2 Kết phân tích tinh dầu mẫu P betle GC-MS 35 3.1.3 Kết phân tích tinh dầu mẫu P pierrei GC-MS 36 3.2 Kết đánh giá hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm in vitro mẫu tinh dầu 39 3.3 Kết nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm in silico số thành phần hóa học mẫu tinh dầu 41 3.3.1 Kết nghiên cứu in silico Staphylococcus aureus 41 3.3.2 Kết nghiên cứu in silico Candida albicans 49 3.3.3 Dự đốn thơng số hóa lý, ADMET thành phần hóa học mẫu tinh dầu 56 Chương BÀN LUẬN 60 4.1 Thành phần hóa học tinh dầu 60 4.2 Hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm in vitro tinh dầu mẫu nghiên cứu 62 4.3 Hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm in silico số thành phần hóa học mẫu tinh dầu 63 4.3.1 Hoạt tính kháng Staphylococcus aureus in silico số thành phần hóa học mẫu tinh dầu 64 4.3.2 Hoạt tính kháng Candida albicans in silico số thành phần hóa học mẫu tinh dầu 66 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ADMET : Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion, Toxicity (Hấp thu, Phân bố, Chuyển hóa, Thải trừ, Độc tính) CLSI : Clinical & Laboratory Standards Institute (Viện Tiêu chuẩn lâm sàng xét nghiệm) GC-MS : Gas chromatography–mass spectrometry (Sắc ký khí ghép khối phổ) GO : Gene Ontology KEGG : Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes MIC : Minimum Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu) MBC : Minimum Bactericidal Concentration (Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu) MFC : Minimum Fungicidal Concentration (Nồng độ diệt nấm tối thiểu) MHB : Mueller Hinton Broth (Môi trường lỏng Mueller Hinton lỏng) SDA : Sabouraud Dextrose Agar (Môi trường thạch Sabouraud Dextrose) PBS : Phosphate-Buffered Saline (Dung dịch đệm phosphat pH 7.4) VSV : Vi sinh vật RI : Retention indices (Giá trị lưu giữ) PPIN : Protein-protein interaction network (Mạng lưới tương tác protein) DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang Hình 1.1 Một số khung cấu tạo thành phần tinh dầu phân Tr.7 lập từ chi Piper L Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo khung alkanpolyenylbenzen phân Tr.9 lập từ chi Piper L Hình 1.3 Một số khung cấu tạo flavonoid phân lập từ chi Piper L Tr.10 Hình 1.4 Một số khung cấu tạo alcaloid phân lập từ chi Piper L Tr.11 Hình 1.5 Sơ đồ quy trình xây dựng phân tích mạng sinh học Tr.19 Hình 1.6 Mơ docking – phương pháp nghiên cứu thuốc Tr.21 dựa cấu trúc đích phân tử Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm in Tr.32 silico số thành phần hóa học mẫu tinh dầu Hình 3.1 Sắc kí đồ GC-MS mẫu nghiên cứu Tr.33 Hình 3.2 Cơng thức cấu tạo thành phần hóa học Tr.39 tinh dầu mẫu nghiên cứu 10 Hình 3.3 Mạng lưới tương tác protein (PPIN) gen quan trọng Tr.41 vi khuẩn Staphylococcus aureus 11 Hình 3.4 Biểu đồ Venn phân tích tham số mạng tương tác Tr.42 protein Staphylococcus aureus 12 Hình 3.5 Biểu đồ nhiệt thể lượng liên kết tính tốn Tr.45 từ kết docking phân tử hợp chất tinh dầu với đích tác dụng tiềm Staphylococcus aureus 13 Hình 3.6 Hình ảnh 3D 2D mô tương tác hợp chất có lực cao trung tâm hoạt động protein MurB Tr.47 14 Hình 3.7 Hình ảnh 3D 2D mô tương tác hợp chất có Tr.48 lực cao trung tâm hoạt động protein MurE 15 Hình 3.8 Mạng lưới tương tác protein (PPIN) gen quan trọng Tr.49 nấm men Candida albicans 16 Hình 3.9 Biểu đồ Venn phân tích tham số mạng tương tác Tr.50 protein Candida albicans 17 Hình 3.10 Biểu đồ nhiệt thể lượng liên kết tính tốn Tr.53 từ kết docking phân tử hợp chất tinh dầu với đích tác dụng tiềm Candida albicans 18 Hình 3.11 Hình ảnh 3D 2D mô tương tác hợp chất Tr.54 có lực cao miền hoạt động ARO1epsps protein ARO1 19 Hình 3.12 Hình ảnh 3D 2D mô tương tác hợp chất Tr.55 có lực cao trung tâm hoạt động protein MET6 20 Hình 4.1 Biểu đồ thành phần hóa học tinh dầu mẫu nghiên cứu Tr.60 DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 1.1 Danh lục loài thuộc chi Piper L Việt Nam Tr.5 Bảng 2.1 Hóa chất thí nghiệm Tr.25 Bảng 2.2 Dụng cụ, thiết bị sử dụng nghiên cứu Tr.25 Bảng 3.1 Thành phần hóa học tinh dầu mẫu P betle f densum phân Tr.34 tích GC-MS Bảng 3.2 Thành phần hóa học tinh dầu mẫu P betle phân tích Tr.36 GC-MS Bảng 3.3 Thành phần hóa học tinh dầu mẫu P pierrei phân tích Tr.37 GC-MS Bảng 3.4 Thành phần hóa học mẫu tinh dầu Tr.38 Bảng 3.5 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm mẫu tinh dầu Tr.40 chủng VSV thử nghiệm Bảng 3.6 Các đích tác dụng tiềm Staphylococcus aureus Tr.44 10 Bảng 3.7 Các đích tác dụng tiềm Candida albicans Tr.52 11 Bảng 3.8 Một số đặc điểm hoá lý thành phần hóa học Tr.56 mẫu tinh dầu 12 Bảng 3.9 Quy tắc giống thuốc thành phần hóa học Tr.57 mẫu tinh dầu 13 Bảng 3.10 Các tính chất dược động học (ADMET) thành phần hóa học mẫu tinh dầu Tr.58 Phụ lục 11 Kết phân tích cụm (MCODE) protein trung tâm mạng tương tác protein Candida albicans Thực phân tích cụm (cluster) thuật tốn MCODE trực quan hóa phần mềm Cytoscape Từ xác định cụm từ 82 đích trung tâm Kết phân tích cụm (MCODE) protein trung tâm mạng tương tác protein C albicans trình bày hình PL11.1 Hình PL11.1 Phân tích cụm 82 đích trung tâm Candida albicans Chú thích: cụm (xanh dương), cụm (đỏ), cụm (xanh lá), cụm (tím), cụm (vàng) Phụ lục 12 Kết phân tích làm giàu GO đích trung tâm mạng tương tác protein Candida albicans Để hiểu rõ chức đích phân tử, phân tích giải chức gen GO (Gene Ontology) 82 protein trung tâm tiến hành Các trình chức phân tử xếp theo giá trị giảm dần Fold Enrichment, màu sắc thể giá trị FDR (false discovery rate – tỷ lệ dương tính giả), kích thước điểm đại diện cho số gen tham gia vào đường Kết trình bày bảng PL12.1 hình PL12.1, PL12.2, PL12.3 Bảng PL12.1 Kết phân tích làm giàu GO 82 đích trung tâm mạng tương tác protein Candida albicans Pathway Số gen FDR Fold Enrichment Gen GO - Chức phân tử (MF) Single-stranded binding dna 0.01642 250.00 MGM101 Carbon-carbon activity lyase 0.01642 156.25 FBA1 Zinc ion binding 0.00334 62.50 FBA1, MET6 Methyltransferase activity 0.02862 62.50 MET6 Lyase activity 0.02862 62.50 FBA1 0.02862 59.52 MET6 0.02862 56.82 MDM34 0.00362 49.02 FBA1, MET6 Metal ion binding 0.01642 15.53 FBA1, MET6 Cation binding 0.01642 15.34 FBA1, MET6 Binding 0.00164 10.20 MDM34, MGM101, FBA1, MET6 Ion binding 0.02903 8.45 FBA1, MET6 Transferase transferring groups activity, one-carbon Lipid binding Transition binding metal ion GO - Quá trình sinh học (BP) Mitochondrionendoplasmic reticulum membrane tethering 0.00039 357.14 MDM34, MDM10 Mitochondrial maintenance genome 1.80E05 267.86 MDM34, MDM10 Attachment of microtubules kinetochore spindle to 0.00068 204.08 SPC19,DAD3 Membrane docking 0.00068 204.08 MDM34, MDM10 Organelle localization by membrane tethering 0.00068 204.08 MDM34, MDM10 Phospholipid transport 0.00082 178.57 MDM34, MDM10 Lipid transport 0.00131 119.05 MDM34, MDM10 Spindle organization 0.00131 119.05 SPC19, DAD3 Mitotic organization 0.00131 119.05 SPC19, DAD3 Lipid localization 0.00131 119.05 MDM34, MDM10 Microtubule cytoskeleton organization 0.00131 109.89 SPC19, DAD3 Microtubule-based process 0.00131 109.89 SPC19, DAD3 Organophosphate transport ester 0.00131 109.89 MDM34, MDM10 Microtubule cytoskeleton organization involved in mitosis 0.00131 109.89 SPC19, DAD3 Reg of defense response 0.00142 89.29 FBA1, MET6 Mitochondrion organization 0.00065 49.83 MDM34, MDM10 MGM101, Organelle organization 0.00006 22.18 MDM34, MGM101, DAD3 SPC19, MDM10, Cellular organization 0.00039 13.13 MDM34, MGM101, DAD3 SPC19, MDM10, spindle component MGM101, Cellular process 0.00019 6.14 MDM34, MGM101, MDM10, DAD3 SPC19, FBA1, MET6, GO - Thành phần tế bào (CC) Condensed chromosome outer kinetochore 7.32E05 357.14 SPC19, DAD3 Intrinsic component of mitochondrial outer membrane 7.32E05 357.14 MDM34, MDM10 ERMES complex 7.32E05 357.14 MDM34, MDM10 DASH complex 7.32E05 357.14 SPC19, DAD3 Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane 7.32E05 357.14 MDM34, MDM10 Outer mitochondrial membrane protein complex 7.32E05 357.14 MDM34, MDM10 Organelle contact site membrane 0.00010 285.71 MDM34, MDM10 Condensed nuclear chromosome, centromeric region 0.00015 204.08 SPC19, DAD3 Condensed chromosome 0.00015 204.08 SPC19, DAD3 Microtubule 0.00021 158.73 SPC19, DAD3 Cytoplasm 7.32E05 8.87 MDM34, SPC19, MGM101, FBA1, MDM10, DAD3 Intracellular membranebounded organelle 9.81E05 7.41 MDM34, SPC19, MGM101, MDM10, MET6, DAD3 Intracellular 7.32E05 6.93 MDM34, MGM101, MDM10, DAD3 nuclear SPC19, FBA1, MET6, Membrane-bounded organelle 0.00013 6.81 MDM34, SPC19, MGM101, MDM10, MET6, DAD3 Organelle 0.00015 6.55 MDM34, SPC19, MGM101, MDM10, MET6, DAD3 Cellular anatomical entity 7.32E05 5.59 MDM34, MGM101, MDM10, DAD3 SPC19, FBA1, MET6, Hình PL12.1 Kết làm giàu GO – Chức phân tử 82 đích trung tâm C.albicans Hình PL12.2 Kết làm giàu GO – Thành phần tế bào 82 đích trung tâm C albicans Hình PL12.3 Kết làm giàu GO – Q trình sinh học 82 đích trung tâm C albicans Phụ lục 13 Kết phân tích KEGG pathway Candida albicans Bảng PL13.1 Kết phân tích KEGG pathway Candida albicans ID Con đường (Pathway) Gen Tỷ lệ dương tính giả cal03010 Ribosome MRP20, MRPL33, A0A1D8PKF3, MRPL6, MRPL8, MRPL40, RSM10 2.83E-09 cal00190 Oxidative phosphorylation A0A1D8PDI3, QCR8, COX9, COX8, ATP14, ATP17, ATP7, ATP4, COX5 0.0023 cal00400 Phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis ARO2, ARO7, ARO1, TYR1 0.0122 cal01230 Biosynthesis of amino acids ILV5, ARO2, MET6, ARO7, HOM6, ARO1, TYR1, FBA1 0.0177 Hình PL13.1 KEGG pathway cấu trúc ribosome C albicans Hình PL13.2 KEGG pathway q trình phosphoryl hóa oxy hóa C albicans Hình PL13.3 KEGG pathway sinh tổng hợp acid amin thơm C albicans Hình PL13.4 KEGG pathway sinh tổng hợp acid amin C albicans Phụ lục 14 Kết docking phân tử hợp chất mẫu tinh dầu đích phân tử tiềm Candida albicans Tinh dầu LD36 T6 DN8 ARO1 epsps -2.24 -2.57 -2.47 ARO1 dhqs -0.71 -1.09 -0.81 ARO1 sk -2.10 -2.07 -2.14 ARO1 dhsd -2.50 -2.77 -2.52 3-Allyl-6methoxyphenyl acetate 4-Allyl-1,2diacetoxybenzene Chavicol acetate Eugenol Caryophyllene -4.42 -3.28 -3.40 -5.07 -4.28 -3.57 -4.43 -3.08 β-Pinene Linalool trans-Sesquisabinene hydrate α-Pinene Caryophyllene D-Limonene Hợp chất β-Pinene Sabinene α-Pinene MET6 FBA1 -3.39 -3.23 -3.36 -2.38 -2.78 -2.68 -3.59 -4.33 -3.85 -3.06 -4.17 -5.01 -4.42 -2.77 -2.29 -0.83 -3.04 -3.16 -3.02 -3.44 -3.12 -3.39 -4.67 -3.44 -3.84 -3.62 -3.45 -3.17 -2.24 -3.76 -5.24 -0.71 -2.78 -2.15 -2.10 -2.29 -2.21 -2.50 -3.18 -3.85 -3.39 -2.63 -4.29 -2.38 -3.57 -3.98 -2.47 -3.08 -3.86 -0.81 -0.83 -1.20 -2.14 -3.02 -2.49 -2.52 -3.39 -2.63 -3.36 -3.84 -2.15 -2.68 -3.17 -2.44 Phụ lục 15 Tương tác 2D 11 hợp chất mẫu tinh dầu với đích tác dụng tiềm Candida albicans α-Pinen Sabinen β-Pinen Hợp chất ARO1epsps MET6 Chavicol acetat 4-Allyl-1,2-diacetoxybenzen 3-Allyl-6-methoxyphenyl acetat Linalool Caryophyllen Eugenol D-Limonen trans-Sesquisabinen hydrat