Nguyễn thanh huyền nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm in vitro và in silico của tinh dầu một số loài thuộc chi piper l , họ piperaceae luận văn thạc sĩ dược học

TỔNG QUAN

Chi Piper L tại Việt Nam

1.1.1 Vị trí và phân loại

Vị trí phân loại của chi Piper L theo hệ thống phân loại thực vật như sau:

Họ Hồ tiêu (Piperaceae) tại Việt Nam bao gồm 5 chi: Peperomia, Zippelis, Circaeocarpus, Piper, và Lepianthes Trong đó, chi Piper L có 46 loài được ghi nhận.

Cây bụi có nhánh thẳng đứng hoặc trải rộng, cây leo với rễ mọc ở đốt bám vào thân cây khác, đôi khi có dạng thân thảo bò trên mặt đất hoặc sống bì sinh Hiếm khi, cây có dạng gỗ nhỏ và thường mang mùi đặc trưng.

Lá cây có hình dạng và kích thước đa dạng, bao gồm các dạng như hình mác, hình trứng, hình tim và hình elip Trên cùng một cây, lá có thể khác nhau về hình dạng, với lá già thường lớn hơn và nổi bật hơn Phiến lá có thể mỏng hoặc dày, nhẵn bóng, nhăn nheo hoặc thô ráp, và có thể có lông bảo vệ màu nâu hoặc trắng, đơn bào hoặc đa bào Gốc lá có thể cân đối hoặc lệch, hình tròn hoặc hình tim, trong khi cuống lá có độ dài từ vài centimet Gân lá thường tạo thành các cặp 6, xuất phát từ nhiều điểm khác nhau trên lá, và một số lá có hệ gân thứ cấp chạy dọc theo gân giữa, có hình chân vịt hoặc xẻ lông chim.

Hoa thường mọc thành cụm đối diện với lá hoặc ở nách lá, hiếm khi xuất hiện ở đỉnh cành Cụm hoa có thể vươn thẳng hoặc uốn cong nhẹ, đôi khi rủ xuống khi chín Hoa thường đơn tính hoặc lưỡng tính, không có cuống và có nhiều màu sắc như hồng, hạt dẻ, xanh xám, vàng xanh và trắng đục Lá bắc nhỏ, mọc đối diện với hoa, có hình dáng khiên, tam giác hoặc tròn, thường nhẵn hoặc có lông mịn Bộ nhị từ 2-6, với bao phấn 2 hoặc 2-4 thùy Bộ nhụy có bầu nhụy rời hoặc ôm lấy trục, với 1 ô và 1 noãn; núm nhụy có từ 2-5.

Quả là loại quả hạch có thể có hoặc không có cuống, thường có hình dạng trứng, hình cầu, hình trứng ngược hoặc hiếm khi là hình bầu dục Khi chín, quả thường có màu đỏ hoặc vàng, bề mặt nhẵn hoặc đôi khi có lông tơ Mỗi quả chứa một hạt gần hình cầu với vỏ hạt mỏng, phôi nhỏ và ngoại nhũ dạng bột, cứng.

1.1.3 Đặc điểm phân bố chi Piper L tại Việt Nam

Việt Nam có 46 loài thuộc chi Piper L., trong đó P betle L (Trầu không) và P lolot C DC (Lá lốt) phân bố rộng rãi khắp cả nước, còn P nigrum L (Hồ tiêu) phổ biến ở các tỉnh phía Nam Tây Nguyên là khu vực có sự đa dạng cao nhất với hơn 15 loài, bên cạnh đó, Vườn Quốc gia Cúc Phương (Ninh Bình) và Vườn quốc gia Ba Vì (Hà Nội) cũng ghi nhận nhiều loài thuộc chi này Các loài Piper L thường mọc trong rừng ẩm ở độ cao từ 150 đến 1500 m, phổ biến nhất ở độ cao 600 – 1000 m, và một số loài có thể xuất hiện ở độ cao trên 1700 m Một số ít loài cũng có mặt gần khu vực dân cư, ven rừng và ven đường.

1.1.4 Danh mục các loài thuộc chi Piper L ở Việt Nam

Theo tài liệu thu thập, đã xác định được 46 loài thuộc chi Piper L phân bố tại Việt Nam, và danh mục các loài này được trình bày trong bảng 1.1.

Trong bảng 1.1, có tổng cộng 38 loài được liệt kê trong cả hai tài liệu [5] và [4] Trong số đó, 3 loài (số thứ tự 1, 24 và 27) chỉ xuất hiện trong tài liệu [5], trong khi 5 loài (số thứ tự 5, 11, 19, 21 và 39) chỉ được ghi nhận trong tài liệu [4].

Bảng 1.1 Danh lục các loài thuộc chi Piper L ở Việt Nam

TT Tên khoa học Tên

Việt Nam TT Tên khoa học Tên

1 P acre Blume Tiêu gắt 24 P leptostachuym

2 P albispicum C DC Tiêu gié trắng 25 P lolot C DC Lá lốt, Tất bạt

3 P arboricola C DC Tiêu thượng mộc 26 P longum L Tiêu lá tím

4 P baccatum Blume Tiêu phì quả 27 P majusculum Bl Tiêu to

5 P balansae C DC Tiêu đốm 28 P cf maclurei Merr Tiêu maclure

6 P bavinum C DC Tiêu ba vì 29 P massiei C DC Tiêu massie

Wall Tiêu lá gai 31 P montinum C DC Tiêu núi

9 P bonnii C DC Hàm ếch rừng 32 P mutabile C DC Tiêu biến thể

10 P brevicaule C DC Tiêu thân ngắn 33 P nigrum L Hồ tiêu

TT Tên khoa học Tên

Việt Nam TT Tên khoa học Tên

Tiêu lá bắc mập 36 P pierrei C DC Tiêu pierre

Tiêu châu đốc, Trầu rừng

16 P densum Blume Tiêu dày 39 P puberulum

Tiêu hơi có lông, Trầu lông

17 P griffithii C DC Tiêu griffithii 40 P pubicatulum C

Tiêu gié trần, Trầu không rừng

Tiêu hải nam, Trầu hải nam

20 P harmandii C DC Tiêu harmand 43 P rufescentibaccum

22 P khasianum C DC Tiêu núi khasia 45 P saxicola C DC Tiêu trên đá

23 P laosanum C DC Tiêu lào 46 P sarmentosum

1.1.5 Thành phần hóa học các loài thuộc chi Piper L ở Việt Nam

Trong chi Piper L ở Việt Nam, nhiều loài như P betle, P cubeba, P longum, P nigrum, P retrofractum và P sarmentosum đã được nghiên cứu sâu bởi các nhóm nghiên cứu trong và ngoài nước Tuy nhiên, các loài còn lại vẫn chưa được khám phá nhiều.

Bảy loại cứu ít được nghiên cứu hoặc chưa được nghiên cứu nhiều Các thành phần hóa học quan trọng trong những loài này bao gồm tinh dầu, cùng với các hợp chất alcaloid, alkanpolyenylbenzen, flavonoid và lignan.

1.1.5.1 Thành phần hóa học tinh dầu các loài thuộc chi Piper L ở Việt Nam

Tinh dầu là hợp chất đặc trưng của chi Piper L., mang lại mùi thơm đặc biệt cho các loài cây trong chi này Nhiều thành phần phổ biến trong tinh dầu của các loài thuộc chi Piper L bao gồm α-pinen, sabinen, và terpinen-4-ol.

Một số khung cấu tạo điển hình của các cấu tử tinh dầu phân lập được từ chi Piper L được thể hiện ở hình 1.1

Hình 1.1 Một số khung cấu tạo chính của thành phần tinh dầu phân lập được từ chi Piper L

Trong đó: (A): 1 - isopropyl - 4 - methylcyclohexan; (B): decahydro - 1, 4,

Khung A đại diện cho cấu trúc của hầu hết các tinh dầu thuộc nhóm monoterpen, trong khi đó, cấu trúc của tinh dầu nhóm sesquiterpen lại đa dạng hơn với hai khung điển hình là khung B và C Các tinh dầu từ chi Piper L thường chứa từ 1 đến 2 vòng 6 cạnh, có thể là no hoặc không no Đối với vòng 6 cạnh không no, thường có từ 1 đến 2 nối đôi, và hiếm khi xuất hiện 3 nối đôi, ví dụ như trong p-cymen và thymol.

Từ loài Piper cubeba phân bố ở Indonesia, Bos và cộng sự (2007) đã xác định sabinen (9,1%), β-elemen (9,4%), epi-cubebol (4,3%) và cubebol (5,6%) là

8 các thành phần chính của tinh dầu quả trong khi trans-sabinen hydrat (8,2%), β- caryophyllen (5,0%), epi-cubebol (4,2%), γ-cadinen (16,6%) và cubebol (4,8%) là các thành phần chính của tinh dầu lá [9]

Trong nghiên cứu tối ưu hóa quá trình chiết xuất tinh dầu từ lá trầu không, Madhumita và cộng sự (2019) đã phát hiện ra 33 hợp chất dễ bay hơi chiếm 98,41% trong tinh dầu lá tươi và 30 hợp chất bay hơi chiếm 97,34% trong tinh dầu lá đã phơi khô Các hợp chất chủ yếu được xác định bao gồm eugenol với tỷ lệ 46,02% trong tinh dầu lá tươi và 44,14% trong tinh dầu lá phơi khô, cùng với estragol chiếm 15,12% và 17,12% tương ứng.

%), linalool (11,62 % và 13,25 %), α-copaen (6,54 % và 5,34 %), và anethol (2,62

Nghiên cứu của Phạm Thế Chính và cộng sự (2009) về loài Piper betle tại Hải Dương, Việt Nam, đã chỉ ra rằng tinh dầu lá chứa các thành phần chính như chavicol (7,6 %), eugenol (77,2 %) và eugenyl acetat (8,7 %) Đồng thời, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Thiện Chí tại Hậu Giang cũng đã phân tích tinh dầu lá trầu không và phát hiện ra 9 hợp chất, trong đó 4-allyl-1,2-diacetoxybenzen chiếm tỷ lệ cao nhất với 34,55%.

Nghiên cứu của Lê Thị Hương và cộng sự đã chỉ ra rằng β-bisabolene (40,3%) là thành phần chính trong tinh dầu của loài P sarmentosum, được thu thập từ lá và thân cây ở Đà Nẵng, miền Trung Việt Nam.

Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm in vitro

Với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, nhiều phương pháp thử tác dụng kháng vi sinh vật đã ra đời Để đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của tinh dầu, có thể áp dụng các phương pháp như khuếch tán đĩa thạch và phương pháp pha loãng.

Hoạt tính kháng khuẩn được xác định thông qua nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC), cho phép tiêu diệt hơn 99% các vi khuẩn ban đầu trong các thử nghiệm in vitro.

- Phương pháp khuếch tán đĩa thạch

Phương pháp khuếch tán đĩa thạch cho phép kiểm tra nhiều mẫu một cách linh hoạt và hiệu quả, đặc biệt là với các mẫu chưa tinh khiết Trong quy trình này, vi khuẩn được điều chỉnh nồng độ và cấy đều lên bề mặt thạch bằng tăm bông tiệt trùng Sau đó, khoanh giấy tẩm mẫu thử hoặc lỗ thạch có đường kính 6 mm được đưa vào đĩa thạch Các đĩa thạch sau đó được ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp Hoạt tính kháng khuẩn được đánh giá qua đường kính vòng vô khuẩn, với đường kính càng lớn cho thấy vi sinh vật càng nhạy cảm với mẫu thử.

Phương pháp này có nhiều ưu điểm như tính đơn giản, chi phí thấp, khả năng kiểm tra số lượng vi sinh vật và chất kháng khuẩn lớn, cùng với kết quả trực quan Tuy nhiên, nó cũng có nhược điểm như không phân biệt được tác nhân diệt khuẩn hay kìm hãm vi khuẩn, không phù hợp để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC), và không thể định lượng lượng chất kháng khuẩn khuếch tán vào môi trường thạch.

- Phương pháp khuếch tán giếng thạch

Phương pháp khuếch tán giếng thạch được sử dụng rộng rãi để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của thực vật hoặc chất kháng khuẩn khuếch tán khác [24]

Quy trình khuếch tán đĩa thạch bắt đầu bằng việc cấy vi sinh vật lên toàn bộ bề mặt của đĩa thạch Sau đó, các giếng có đường kính từ 6 đến 8 mm được tạo ra, và một thể tích từ 20 đến 100 µl chất kháng khuẩn được đưa vào từng giếng Đĩa thạch sau đó được nuôi trong điều kiện thích hợp tùy thuộc vào loại vi sinh vật được thử nghiệm Chất kháng khuẩn sẽ khuếch tán trong môi trường thạch, ức chế sự phát triển của chủng vi sinh vật thử nghiệm.

Phương pháp pha loãng là cách hiệu quả nhất để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC), vì nó cho phép ước lượng chính xác nồng độ của chất kháng khuẩn trong môi trường thạch hoặc canh thang.

Giá trị MIC (Minimum Inhibitory Concentration) là nồng độ thấp nhất có khả năng ức chế sự phát triển của vi sinh vật, thường được đo bằng g/ml hoặc mg/l Phương pháp này được ưa chuộng trong nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của thực vật, cho phép sử dụng một lượng nhỏ hợp chất hoặc chiết xuất thực vật, đồng thời dễ dàng thử nghiệm nhiều mẫu trong cùng một môi trường nuôi cấy.

Phương pháp pha loãng canh trường thường được thực hiện trong ống nghiệm hoặc đĩa 96 giếng, với chất kháng khuẩn được pha loãng theo gấp đôi nối tiếp trong môi trường lỏng chứa vi khuẩn Sau khi nuôi trong điều kiện quy định, độ đục hoặc quan sát bằng mắt thường sẽ được sử dụng để xác định nồng độ ức chế tối thiểu.

- Pha loãng trong môi trường thạch

Phương pháp pha loãng thạch là quá trình kết hợp các nồng độ chất kháng khuẩn vào môi trường thạch nóng Thường áp dụng dãy pha loãng gấp đôi nối tiếp, sau đó tiến hành cấy vi sinh vật đã xác định lên bề mặt thạch.

17 đĩa thạch Giá trị MIC được ghi nhận là nồng độ chất kháng khuẩn thấp nhất ức chế hoàn toàn sự phát triển trong điều kiện nuôi thích hợp

Ngoài ra, có nhiều phương pháp khác để đánh giá khả năng kháng khuẩn của chất kháng khuẩn, bao gồm phương pháp sắc ký lớp mỏng, phương pháp tiếp xúc động để xác định khả năng kháng khuẩn theo thời gian và nồng độ, cùng với phương pháp định lượng ATP bằng phát quang sinh học.

Mô hình in silico trong sàng lọc tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm

1.3.1 In silico trong nghiên cứu và phát triển thuốc

Sàng lọc ảo dựa trên cấu trúc đã cách mạng hóa quy trình nghiên cứu và phát triển thuốc (R&D), được áp dụng rộng rãi trong mọi giai đoạn từ tìm kiếm hợp chất hóa học có tác dụng sinh học đến tối ưu hóa cấu trúc để nâng cao hoạt tính sinh học, giảm độc tính và cải thiện tính chất dược động học Phương pháp này, được gọi là “in silico”, khác biệt với các phương pháp in vivo, in situ và in vitro, đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng.

So với các phương pháp thực nghiệm truyền thống như in vivo, in situ và in vitro, phương pháp in silico nổi bật với khả năng giải thích bản chất phân tử của các tương tác thuốc, điều mà các thí nghiệm khác không thể thực hiện Phương pháp này cho phép dự đoán hoạt tính sinh học thông qua mô hình toán học, giúp xác định cơ chế tác dụng và độc tính của các hợp chất, đồng thời tiết kiệm thời gian và chi phí trong quá trình phát triển thuốc mới.

Trong quá trình phát triển thuốc mới, việc tìm kiếm ứng viên thuốc có khả năng can thiệp vào nhiều con đường sinh học của vi sinh vật gây bệnh là ưu tiên hàng đầu Việc tác động vào nhiều con đường này không chỉ giảm thiểu tỷ lệ kháng thuốc mà còn tăng hiệu quả điều trị và kiểm soát tác dụng phụ Do đó, dược lý học hệ thống đóng vai trò quan trọng trong việc phát triển các loại thuốc mới.

Dược lý học hệ thống được xây dựng trên nguyên tắc rằng thuốc không chỉ tác động qua một tương tác thuốc-protein cụ thể mà còn thông qua một mạng lưới tương tác phức tạp giữa thuốc, protein, gen, và các quá trình sinh lý khác Quá trình này bao gồm hai bước chính: xác định cơ chế đa đích và tìm kiếm các hợp chất hóa học có khả năng tác động đa đích.

Trong quá trình xác định cơ chế đa đích, mạng tương tác protein (PPIN) đóng vai trò quan trọng trong việc sàng lọc các đích mới và hiểu rõ cơ chế tác dụng của thuốc PPIN bao gồm các nút đại diện cho protein và các cạnh thể hiện sự tương tác giữa chúng Những tương tác này liên quan đến các quá trình sinh học như truyền tín hiệu, tổng hợp và vận chuyển Việc loại bỏ một nút trong mạng giúp xác định tầm quan trọng của protein thông qua sự thay đổi cấu trúc của PPIN Từ đó, có thể phát hiện các đích phân tử và các con đường sinh học quan trọng của vi sinh vật gây bệnh, hỗ trợ cho việc tìm kiếm thuốc có khả năng can thiệp vào nhiều con đường sinh học trọng yếu.

1.3.2 Quy trình xây dựng và phân tích PPIN

Quy trình xây dựng và phân tích PPIN nói chung gồm 3 bước cơ bản:

Bước 1: Thu thập dữ liệu gen, tương tác protein - protein (interactome)

Hầu hết các tương tác giữa các protein đã biết đều nằm trong các cơ sở dữ liệu sinh học như STRING và BioGRID

Bước 2: Xây dựng cấu trúc PPIN

Thông qua việc phân tích các nút, đại diện cho protein tham gia vào cơ chế bệnh sinh, cùng với các cạnh thể hiện sự tương tác giữa các protein, chúng ta có thể xây dựng một mạng lưới tương tác phức tạp giữa các protein.

19 protein dạng đồ thị (Graph) Để phân tích cấu trúc và hiển thị có thể dử dụng một số công cụ tin sinh học như CYTOSCAPE, IGRAPH, GEPHI, NETWORK X [27]

Bước 3: Phân tích cấu trúc mạng PPIN

Xác định các nút hub (nút bậc cao) là bước quan trọng để phát hiện các đích tác dụng thuốc tiềm năng Hai phương pháp phân tích phổ biến được sử dụng trong quá trình này là phân tích trung tâm và phân tích cụm.

Hình 1.5 Sơ đồ quy trình xây dựng và phân tích mạng sinh học

Bước 4: Phân tích làm giàu

Phân tích làm giàu gen giúp đánh giá mối liên hệ giữa cụm gen và các quá trình sinh học trong cơ thể, từ đó làm rõ chức năng của cụm gen Các phương pháp phổ biến trong phân tích làm giàu bao gồm phân tích Gene Ontology (GO) và đường dẫn KEGG.

Gene Ontology (GO) là một hệ thống bản thể học được sử dụng rộng rãi trong khoa học, nhằm mô tả các khái niệm và mối quan hệ giữa chúng một cách có cấu trúc và dễ hiểu cho máy tính Bản thể học này hỗ trợ việc chú thích thuật ngữ một cách hệ thống, giúp xử lý thông tin hiệu quả trong nhiều lĩnh vực khác nhau Đối với GO, mỗi thuật ngữ được xác định dựa trên ba phương diện chính: chức năng, quá trình và thành phần tế bào.

Kỹ thuật phân tích Gene Ontology (GO) giúp xác định 20 phân tử chức năng, quá trình sinh học và thành phần tế bào liên quan đến một cụm gen Hệ thống chú thích của GO được sử dụng để phân tích và hiểu rõ hơn về vai trò của các gen trong các quá trình sinh học khác nhau.

- KEGG pathway: KEGG là viết tắt của Kyoto Encyclopedia of Genes and

Genomes là một bách khoa toàn thư về gen và bộ gen, được phát triển bởi Trường Đại học Kyoto, nhằm mục đích nghiên cứu chức năng cơ thể từ thông tin ở mức độ phân tử Một trong những cơ sở dữ liệu quan trọng của KEGG là con đường KEGG, bao gồm các sơ đồ sinh học thể hiện thông tin về quá trình chuyển hóa, thông tin gen và tương tác với môi trường.

Kết quả từ việc áp dụng PPIN cho thấy các protein bậc cao đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì cấu trúc tổng thể của PPIN Tiếp theo, chúng tôi sẽ áp dụng phương pháp Protein docking để xác định thuốc phù hợp và khả thi nhất nhằm tiêu diệt các protein bậc cao đã được phát hiện.

Phương pháp Protein docking, ra đời từ những năm 1980, đã trở thành công cụ quan trọng trong thiết kế thuốc dựa trên cấu trúc Phương pháp này cho phép dự đoán chính xác sự hình thành liên kết giữa các phân tử và receptor trong túi liên kết, góp phần nâng cao hiệu quả trong nghiên cứu và phát triển dược phẩm.

Protein docking không chỉ xác định các liên kết quan trọng mà còn định lượng khả năng tương tác thông qua các hàm tính điểm, giúp phân hạng các liên kết mạnh và yếu Với ưu điểm thực hiện trên máy tính với tốc độ ngày càng nhanh và chính xác, protein docking ngày càng được xem là bước khởi đầu quan trọng cho nghiên cứu thiết kế thuốc hiện đại.

Docking là một bài toán tối ưu nhằm xác định vị trí và cấu hình tối ưu cho cơ chất gắn kết lên protein Mục tiêu chính của quá trình này là tìm ra cấu hình với năng lượng tự do thấp nhất, tương ứng với cấu hình bền nhất khi phối tử liên kết với protein.

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu nghiên cứu

Các mẫu nghiên cứu được thu thập từ nhiều địa điểm và thời gian khác nhau, và đã được các nhà thực vật học tại Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam cùng Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật – Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam giám định tên khoa học.

Vào tháng 10 năm 2017, toàn cây loài Piper betle f densum (2 kg) đã được thu thập tại Vườn quốc gia Bidoup Núi Bà Mẫu nghiên cứu này được giám định tên khoa học bởi TS Nguyễn Thế Cường, thuộc Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật Hiện tại, tiêu bản được lưu trữ tại Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam với mã số TN17/C04-LD036.

Toàn cây loài Piper betle L (2 kg) được thu tại Văn Điển, Hà Nội vào tháng

Vào tháng 6 năm 2022, mẫu nghiên cứu đã được giám định tên khoa học bởi ThS Bùi Văn Hướng Tiêu bản mẫu hiện đang được lưu giữ tại Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam với mã số NTT-2022-T6.

Toàn cây loài Piper pierrei C DC (2 kg) được thu tại Vườn quốc gia Tà Đùng vào tháng 05 năm 2019 Mẫu nghiên cứu được giám định tên khoa học bởi

TS Đỗ Văn Trường, tiêu bản mẫu được lưu tại Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam với mã số tiêu bản TN17/C04-DN8

2.1.2 Các chủng vi sinh vật thử nghiệm

Các chủng vi sinh vật kiểm định chuẩn quốc tế ATCC: 1 chủng vi khuẩn Gram (+) Staphylococcus aureus ATCC 25923, 1 chủng vi khuẩn Gram (-)

Escherichia coli ATCC 25922, 1 chủng nấm men Candida albicans ATCC 10231

2.1.3 Các cơ sở dữ liệu về gen, tương tác protein - protein của vi sinh vật thử nghiệm

DEG (http://www.essentialgene.org/) là một cơ sở dữ liệu quan trọng, lưu trữ các bộ gen thiết yếu của vi khuẩn và sinh vật nhân thực Dữ liệu này được tổng hợp từ nhiều nguồn khác nhau, cung cấp thông tin cần thiết cho nghiên cứu và ứng dụng trong sinh học phân tử.

24 liệu khác nhau bởi Trường đại học Tianjin, Trung Quốc Trong đó có dữ liệu về

31 vi khuẩn với hơn 12 000 gen thiết yếu của vi khuẩn Có thể truy cập miễn phí và được cập nhật thường xuyên [33]

STRING (https://string-db.org/) là cơ sở dữ liệu sinh học cung cấp thông tin về các tương tác protein-protein đã được biết và dự đoán Cơ sở dữ liệu này tích hợp dữ liệu từ nhiều nguồn khác nhau, bao gồm dữ liệu thử nghiệm, phương pháp dự đoán tính toán và bộ thu thập dữ liệu công cộng STRING hoàn toàn miễn phí và thường xuyên được cập nhật Phiên bản mới nhất 10.0 hiện có thông tin về khoảng 9,6 triệu protein từ hơn 2000 sinh vật khác nhau.

2.1.4 Các công cụ tính toán

Các phần mềm (off-line) phục vụ mô phỏng và phân tích dữ liệu:

- Phần mềm lưu trữ, hiệu chỉnh số liệu: Microsoft® Excel 2016

- Phần mềm xây dựng cấu trúc hóa học: ChemDraw Pro bản 15.0

- Phần mềm biểu diễn và phân tích mạng tương tác protein PPIN: Cytoscape 3.6.0, các phần mềm plug-in MCODE bản 1.3.1 (phân tích cụm) (http://baderlab.org/Software/MCODE)

- Phần mềm mô phỏng Docking: MOE bản 2015.10

- Phần mềm phân tích và biểu diễn tương tác: BOVIA Discovery

- Các công cụ trực tuyến ADMETlab 2.0 (https://admetmesh.scbdd.com/), SwissADME (http://www.swissadme.ch/index.php)

Các bản phần mềm trong nghiên cứu sử dụng cho học thuật, không dưới mục đích thương mại

2.1.5 Hóa chất, thiết bị dùng trong nghiên cứu

Danh sách hóa chất thí nghiệm chính được trình bày ở Bảng 2.1 như sau:

Bảng 2.1 Hóa chất thí nghiệm Tên hóa chất Nguồn gốc Tên hóa chất Nguồn gốc

Glucose Trung Quốc Triamoni nitrat Trung Quốc

Pepton Trung Quốc Acetat natri Trung Quốc

Cao thịt Trung Quốc Natri clorid Trung Quốc

Cao nấm men Trung Quốc MgSO4.7H2O Trung Quốc

K2HPO4 Trung Quốc MnSO4.4H2O Trung Quốc

Thạch agar Trung Quốc Dimethyl sulfoxid

Các hóa chất khác sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích

Danh sách dụng cụ, thiết bị chính và một số vật tư thí nghiệm tiêu hao được trình bày ở bảng 2.2 như sau:

Bảng 2.2 Dụng cụ, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Workstation Dell Precision 7710 Intel® Xeon E3-1545M v5

Bộ dụng cụ định lượng tinh dầu DĐVN V Trung Quốc

Hệ thống GC-MS GC In tuvo 9000 / MSD 5977 (Agilent

Tủ cấy vô khuẩn BioAir - Italy

Cân kĩ thuật Satorius – Đức

Pipet đa kênh AHN – Đức

Nội dung nghiên cứu

Xuất phát từ 3 mục tiêu, đề tài triển khai các nội dung như sau:

- Với mục tiêu 1: Phân tích thành phần hóa học của tinh dầu các loài Piper betle f densum, Piper betle L., Piper pierrei C DC thuộc chi Piper L., bao gồm

+ Thu mẫu, làm nhỏ mẫu

+ Định lượng tinh dầu sử dụng bộ dụng cụ theo Dược điển Việt Nam V, thu tinh dầu

+ Phân tích thành phần hóa học của tinh dầu

- Với mục tiêu 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm in vitro của các mẫu tinh dầu thu được, bao gồm 2 nội dung tương ứng:

+ Xác định MIC của các mẫu tinh dầu

+ Xác định MBC, MFC của các mẫu tinh dầu

Mục tiêu 3 của nghiên cứu là khám phá hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm in silico của một số thành phần hóa học chính trong các mẫu tinh dầu Nghiên cứu này bao gồm ba nội dung chính tương ứng với các thành phần khác nhau.

+ Phân tích dự đoán protein quan trọng của vi khuẩn, nấm

+ Nghiên cứu docking của các hợp chất trong tinh dầu trên đích dự đoán + Dự đoán thông số hóa lý, ADMET của các hợp chất được chọn.

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phân tích thành phần hóa học của tinh dầu các loài Piper betle f densum,

Piper betle L., Piper pierrei C DC thuộc chi Piper L

Toàn cây được cắt nhỏ với kích thước 10 mm và sau đó được tiến hành cất bằng phương pháp kéo hơi nước Quy trình này sử dụng bộ dụng cụ định lượng tinh dầu theo tiêu chuẩn của Dược điển Việt Nam.

V [34] Tinh dầu thu được bảo quản trong lọ kín, tránh ánh sáng và giữ trong tủ mát chờ phân tích thành phần hóa học

Tinh dầu được pha loãng trong cloroform với tỷ lệ 1:100 (v/v) và phân tích sắc ký khí được thực hiện trên hệ thống Sắc ký khí ghép nối khối phổ, bao gồm hệ thống sắc ký khí In tuvo 9000 và khối phổ MSD 5977B (Agilent Technologies, Mỹ) Cột sắc ký sử dụng là cột HP-5MS với kích thước 30m x 0,25 mm x 0,25 µm Chế độ tiêm mẫu là chia dũng với tỷ lệ 50:1 Chương trình nhiệt độ bắt đầu ở 50 °C trong 3 phút, sau đó tăng 4,5 °C/phút đến 225 °C và giữ trong 2 phút Năng lượng ion hóa được thiết lập ở mức 70 eV, và detector khối phổ hoạt động ở chế độ full scan để quét các ion phân mảnh từ 40-450 amu.

Giá trị lưu giữ RI (retention indices) của các thành phần trong mẫu tinh dầu được xác định thông qua dãy đồng đẳng alkans (C8-C20) dưới cùng một điều kiện phân tích Việc nhận diện các thành phần dựa vào việc so sánh phổ khối và giá trị RI tính toán với dữ liệu từ phần mềm NIST 14, sử dụng NIST MS search 2.0 và các thông tin từ cơ sở dữ liệu NIST Chemistry WebBook cùng tài liệu của Adams Tỷ lệ phần trăm các thành phần được tính toán dựa trên diện tích pic trong sắc ký.

Trong đó: RTx: Thời gian lưu của chất phân tích

RTn: Thời gian lưu của alkan liền trước thành phần phân tích

RTn+1: Thời gian lưu của alkan liền sau thành phần phân tích n: số nguyên tử carbon của alkan liền trước pic phân tích

2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm in vitro của các mẫu tinh dầu

2.3.2.1 Phương pháp xác định MIC với các đối tượng vi sinh vật

Nồng độ tối thiểu ức chế VSV (MIC) của tinh dầu được xác định bằng

Có 28 phương pháp vi pha loãng trong môi trường lỏng được áp dụng cho vi khuẩn và C albicans, sử dụng canh thang MHB hoặc Sabouraud-dextrose, theo khuyến nghị của Viện Tiêu chuẩn lâm sàng và xét nghiệm Hoa Kỳ (CLSI).

Tinh dầu được pha loãng trong nước với 4% Tween 80, bắt đầu từ nồng độ 1 và tiếp tục pha loãng đến nồng độ làm việc phù hợp Các mẫu tinh dầu được pha loãng theo tỷ lệ 1:1 trên đĩa 96 giếng, từ cột 1 đến cột 10, tạo ra dãy nồng độ giảm dần theo cấp số nhân Nồng độ MIC được biểu diễn dưới dạng 1/pha loãng hoặc theo phần trăm (%), ví dụ như 1/1024 tương đương với nồng độ tinh dầu khoảng 0,1%.

Hỗn dịch vi sinh vật có độ đục 0,5 McFarland được chuẩn bị trong PBS từ các khuẩn lạc trên đĩa thạch TSA cho vi khuẩn hoặc SDA cho C albicans, được ủ ở 37 °C qua đêm Sau đó, hỗn dịch này được pha loãng 100 lần.

MHB hoặc Sabouraud-dextrose được sử dụng để nuôi cấy C albicans, tạo ra hỗn dịch làm việc với nồng độ 1,5x10^6 vi khuẩn/ml và 10^4 vi nấm/ml Hỗn dịch này sau đó được bổ sung vào các giếng trong đĩa, ngoại trừ các giếng ở cột 12, đóng vai trò là chứng âm Chứng dương được thiết lập với giếng chứa môi trường và vi sinh vật Ngoài ra, chất tham chiếu được sử dụng với S aureus để so sánh.

E coli, chất tham chiếu là meropenem, giá trị MIC thường qui là 0,016 mg/L, với

C albicans chất tham chiếu là itraconazol, giá trị MIC thường qui là 0,016 mg/L

Các đĩa được đậy kín và ủ ở nhiệt độ 37 ℃ trong 20 giờ Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) được xác định là mức thấp nhất mà không thấy sự phát triển của vi sinh vật Tất cả các thử nghiệm được thực hiện độc lập ít nhất hai lần.

2.3.2.2 Phương pháp xác định MBC, MFC

Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) và nồng độ diệt nấm tối thiểu (MFC) được xác định thông qua các xét nghiệm MIC Quá trình này bao gồm việc cấy truyền từ các giếng không mọc lên thạch TSA cho vi khuẩn và thạch SDA cho nấm men,

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã đếm số khuẩn lạc xuất hiện và xác định rằng MBC là nồng độ thấp nhất cần thiết để tiêu diệt hơn 99,9% vi sinh vật so với lượng ban đầu Tỉ lệ MBC/MIC được sử dụng như một phương pháp để đánh giá tính kháng khuẩn và kháng nấm của các hợp chất.

2.3.3 Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm in silico của một số thành phần hóa học chính trong các mẫu tinh dầu

2.3.3.1 Phân tích dự đoán protein quan trọng của S aureus và C albicans

- Bước 1: Thu thập và xử lý cơ sở dữ liệu

+ Dữ liệu gen quan trọng của S aureus:

Từ ngân hàng dữ liệu DEG (https://tubic.org/deg/public/index.php/index), tìm kiếm và thu thập 351 gen quan trọng của vi khuẩn

Sử dụng công cụ BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) để lọc các protein không tương đồng với vật chủ (người) của S aureus, chúng tôi đã xác định được 257 protein quan trọng không tương đồng.

+ Dữ liệu gen quan trọng của C albicans:

Thu thập 292 protein quan trọng của C albicans không tương đồng với protein người từ các nghiên cứu trước đó [39]

- Bước 2: Xây dựng và phân tích mạng tương tác protein PPIN

Bước này nhằm xác định các gen trung tâm trong mạng lưới sinh học của vi sinh vật bằng cách sử dụng cơ sở dữ liệu STRING để thu thập thông tin tương tác giữa các protein quan trọng Dữ liệu tương tác được lưu lại và sử dụng Cytoscape để trực quan hóa mạng tương tác protein Plug-in CytoNCA được áp dụng để xác định top các protein trung tâm dựa trên ba thông số: bậc, độ trung tâm và độ gần Từ đó, 100 protein có giá trị cao nhất cho mỗi tham số được lựa chọn, tạo thành ba tập hợp protein tiềm năng Cuối cùng, giao của ba tập hợp này được xác định bằng biểu đồ Venn, giúp xác định các đích trung tâm.

- Bước 3: Phân tích phân cụm, phân tích làm giàu GO và con đường sinh học KEGG pathway

Sử dụng plug-in MCODE để phân tích phân cụm là bước đầu tiên trong nghiên cứu Tiếp theo, công cụ ShinyGO (http://bioinformatics.sdstate.edu/go/) giúp xác định chức năng của các protein Cuối cùng, công cụ KEGG Pathway (https://www.genome.jp/kegg/pathway.html) cho phép xác định con đường sinh học mà các protein tham gia vào.

2.3.3.2 Sàng lọc hoạt chất có tác dụng trên đích đã chọn bằng phương pháp Docking phân tử

- Bước 1: Chuẩn bị cấu trúc của các hợp chất chính trong tinh dầu

Cấu trúc hóa học của các thành phần chính trong tinh dầu được tải xuống từ cơ sở dữ liệu Pubchem và sau đó được tối thiểu hóa năng lượng bằng phần mềm MOE, với cài đặt trường lực AM1-BCC phù hợp.

Các protein có cấu trúc tinh thể được xác định thông qua phương pháp nhiễu xạ tia X, từ đó chọn lựa những protein có chất lượng tốt để thực hiện docking phân tử Cấu trúc tinh thể này được tải từ cơ sở dữ liệu Protein Data Bank và được tinh chỉnh bằng phần mềm MOE Tiếp theo, quá trình xác định trạng thái proton và túi liên kết của protein được thực hiện, trong đó trung tâm hoạt động sẽ được tách riêng để phục vụ cho quá trình docking.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Kết quả phân tích thành phần tinh dầu bằng GC-MS

Hàm lượng tinh dầu trong các mẫu P betle f densum, P betle và P pierrei lần lượt đạt 0,25%; 0,15% và 0,05% tính theo dược liệu tươi Sắc ký đồ của tinh dầu từ các mẫu P betle f densum (LD36), P betle (T6) và P pierrei (DN8) được thể hiện trong hình 3.1.

Hình 3.1 Sắc kí đồ GC-MS của 3 mẫu nghiên cứu

Sắc kí đồ của tinh dầu mẫu P betle f densum (LD36), P betle (T6) và P pierrei (DN8) cho thấy sự khác biệt trong thành phần hóa học của các loại tinh dầu này.

3.1.1 Kết quả phân tích tinh dầu mẫu P betle f densum bằng GC-MS

Kết quả phân tích thành phần tinh dầu loài P betle f densum bằng GC-MS cho phép xác định sự có mặt của 42 thành phần, chiếm 97,20 % Từ bảng 3.1, có

34 thể thấy các monoterpen là thành phần chủ yếu với 8 hợp chất đã được xác định, chiếm 49,67 %; trong đó các thành phần chính β-pinen (16,92 %), sabinen (13,72

Trong nghiên cứu này, các hợp chất chiếm ưu thế bao gồm α-pinen (10,71 %) và các hợp chất sesquiterpenoid, tổng cộng chiếm 41,53 % Có 8 hợp chất sesquiterpenoid với tổng tỷ lệ 21,10 %, nhưng không hợp chất nào vượt quá 5 % Thêm vào đó, 18 hợp chất sesquiterpen được xác định, chiếm 17,50 %, hầu hết đều có tỷ lệ thấp Ngoài ra, có 2 hợp chất phenylpropanoid chiếm 5,9 %, 5 hợp chất monoterpenoid chiếm 2,77 %, và 1 hợp chất dẫn xuất salicylat với hàm lượng không đáng kể (