Khảo sát hiệu quả của chế phẩm SiAgnpsOcts đối với khả năng kháng nấm in vitro và khả năng kích thích sinh trưởng trên mầm đậu nành

ĐẠI HOC NGUYỄN TẤT THÀNH NGUYEN TAT THANH THỤC HỌC - THỤC HÀNH - THỤC DANH - THỤC NGHIỆP KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT HIỆU QUẢ CỦA CHẾ PHẴM Si/AgNPs/OCTS ĐÓI VỚI KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM IN VITRO VÀ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG TRÊN MÀM ĐẬU NÀNH Sinh viên thực : Ngô Quang Tú MSSV 1411527830 GVHD PGS.TS Lê Quang Luân ThS Trần Lệ Trúc Hà TP HCM, 2020 MỤC LỰC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii TÓM TẮT V SUMMARY vi DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH vii DANH MỤC BẢNG BIẺU vii DANH MỤC CHỮ VIÉT TẮT ix ĐẶT • VÁN ĐÈ X CHƯƠNG TÔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu silica 1.1.1 Silica 1.1.2 Cấu trúc silica 1.1.3 ứng dụng silica 1.2 Giới thiệu chitosan oligochitosan 1.2.1 Chitosan 1.2.2 Oligochitosan 1.2.3 Vai trò oligochitosan 1.3 Tông quan chitinase 1.4 Giới thiệu nano bạc 1.4.1 Tổng quan nano bạc 1.4.2 Tính chất AgNPs 1.5 Co chế gắn AgNPs lên vi hạt silica sử dụng chitosan làm chất ổn định 1.6 Độc tính silica, nano bạc oligochitosan ii 1.7 Tổng quan nấm 1.7.1 Nam Rhizoctonia solcini 1.7.2 Nam Fusarium oxysporum 1.7.3 Nấm Colletotrichum gloeosporioides 10 1.8 Đậu tương DT84 11 1.9 Tình hình nghiên cứu người nước 12 1.9.1 Các nghiên cứu nước 12 1.9.2 Các nghiên cứu nước 12 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 14 2.1 Nơi thực 14 2.2 Nội dung nghiên cứu 14 2.3 Hóa chất thiết bị 14 2.3.1 Hóa chất .14 2.3.2 Thiết bị 15 2.4 Phương pháp nghiên cứu 15 2.4.1 Xác định hiệu lực kháng nấm theo nồng độ sử dụng chế phâm Si/AgNPs/OCTS 15 2.4.2 Đánh giá khả kích thích tăng trưởng chế phẩm mầm đậu nành 17 2.4.3 Khảo sát hoạt tính enzyme chitinase in vitro q trình mầm hạt đậu nành .18 2.4.3.1 Thu nhận enzyme chitinase từ rễ mầm đậu nành 18 2.4.3.2 Xác định hoạt tính enzyme chitinase .18 CHƯƠNG KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 3.1 Hoạt tính kháng nấm chế phẩm Si/AgNPs/OCTS 20 3.1.1 Khả ức chế Rhizoctonia solani chế phẩm 20 iii 3.1.2 Hoạt tính kháng nấm Colletotrichum gloeosporioides chế phâm Si/AgNPs/OCTS 22 3.1.3 Hoạt tính kháng nấm Fusarium oxysporum che phâm Si/AgNPs/OCTS 24 3.2 Khả sát khả kích thích sinh trưởng mầm đậu nành chế phâm Si/AgNPs/OCTS 25 3.2.1 Khảo sát khả kích thích sinh trưởng mầm đậu nành chế phẩm theo thời gian nảy mầm 25 3.2.2 Khảo sát khả kích thích sinh trưởng mầm đậu nành chế phẩm dựa khối lượng đậu nành 26 3.2.3 Khảo sát khả kích thích sinh trưởng mầm đậu nành chế phẩm dựa hoạt độ enzyme chitinase 25 KÉT LUẬN VÀ ĐÈ NGHỊ 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO 30 PHỤ LỤC 33 IV TÓM TẮT Chế phẩm Si/AgNPs/OCTS chế tạo phương pháp xạ dựa tạo thành nano bạc gắn vi hạt silica sừ dụng oligochitosan làm chất ổn định với mục đích chế tạo phân bón để gia tăng hiệu kháng nấm bệnh dựa hiệu ứng kích kháng bệnh trồng Khóa luận “Khảo sát hiệu chế phẩm Si/AgNPs/OCTS khả kháng nấm in vitro khả kích thích sinh trưởng mầm đậu nành” thực từ tháng 03/2020 đến tháng 9/2020 phịng Cơng nghệ Sinh học Vật liệu Nano, Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp Hồ Chí Minh với mục tiêu xác định khả kháng nấm bệnh, kích thích tăng trưởng tăng hoạt tính enzyme chitinase mầm đậu nành chế phâm Si/AgNPs/OCTS Đe tài bao gồm ba nội dung: Xác định hiệu kháng nấm Rhizoctonia solani, Colletotrichum gloeosporioides Fusarium oxysporum chế phâm Si/AgNPs/OCTS; Đánh giá khả kích thích tăng trưởng chế phẩm hạt đậu nành nảy mầm; Khảo sát hoạt động enzyme chitinase ìn vitro trình nảy mầm hạt đậu nành Sau tháng ngiên cứu, kết đạt sau: Hiệu lực kháng nấm chế phẩm Si/AgNPs/OCTS mơi trường PGA có độ pha lỗng 50 lần cho hiệu kháng nấm cao 83,56% nấm Rhizoctonia solani, 79,52% đổi với nấm Colletotrichum gloeosporioides 70,04% nấm Fusarium oxysporum Ớ nghiệm thức bổ sung chế phẩm có độ pha lỗng 454 lần cho kết tốt nhất, cụ thể tăng 1,5 - 1,7 lần tiêu lệ nảy mầm tốc độ nảy mầm, từ 3,5 đến gần lần tiêu chí khối lượng thân rề đậu tươi lần sau sấy khô giảm 5,3 lần thời gian nảy mầm ngày Hoạt tính enzyme chitinase nghiệm thức có độ pha lỗng 454 lần có hoạt độ 18,06 u/ml cao tất mẫu, tăng 33,5 lần so với mẫu đối chứng sừ dụng nước cất vô trùng V DANH MỤC • CÁC HÌNH ÃNH Hình 1.1 Cấu trúc mạng silica vơ định hình tinh thể Hình 1.2 Cấu trúc hóa học chitosan Hình 1.3 Cơ chế diệt vi khuẩn AgNPs thông qua tương tác với protein nucleic acid Hình 1.4 Các chế tác động AgNPs đến vi sinh vật Hình 1.5 Sơ đồ phản ứng tạo AgNPs gắn vi hạt SĨO2 Hình 1.6 Nam Rhizoctonia solani Hình 1.7 Nam Fusarium oxysporum Hình 1.8 Nấm Colletotrichum gloeosporioides 11 Hình 3.1 Đường kính tăng trưởng nấm Rhizoctonia solani môi trường bô sung chế phàm theo độ pha loãng khác 20 Hình 3.2 Ảnh hưởng chế phẩm Si/AgNPs/OCTS đến hiệu lực kháng nấm sau 52 nuôi cấy môi trường PGA 21 Hình 3.3 Đường kính tăng trưởng nấm Colletotrichum gloeosporioides mơi trường PGA có bổ sung chế phẩm theo độ pha loãng khác 22 Hình 3.4 Nấm c.gloeosporioides sau 168 ni cấy mơi trường có bổ sung chế phẩm Si/AgNPs/OCTS 23 Hình 3.5 Nam Fusarium oxysporum sau 144 nuôi cấy mơi trường PGA có 24 Hình 3.6 Đường kính tăng trưởng nấm Fusarium oxysporum mơi trường PGA có bơ sung chế phâm theo độ pha loãng khác 24 Hình 3.7 Sinh trưởng phát triển hạt đậu nành giá thể có bổ sung chế phẩm Si/AgNPs/OCTS độ pha loãng khác 25 Hình 3.8 Đậu nành sau 144 phát triển giá thể bơng gịn có bổ sung chế phẩm độ pha loãng khác 26 vii DANH MỤC BẢNG BIẺU Bảng 2.1 Nghiệm thức chế phẩm Si/AgNPs/OCTS khảo sát kháng nấm 15 Bảng 2.2 Nghiệm thức chế phẩm Si/AgNPs/OCTS khảo sát kháng nấm Colletotrichum gloeosporioides 16 Bảng 2.3 Nghiệm thức chế phẩm Si/AgNPs/OCTS khảo sát kháng nấm Fusarium oxysporum 16 Bảng 2.4 Khảo sát kích thích nảy mầm chế phẩm 17 Bảng 2.5 So đồ phản ứng cho thử nghiệm enzyme 19 Bảng 3.1 Ảnh hưởng che phẩm Si/AgNPs/OCTS đến hiệu lực kháng nấm Rhizoctonia solani 21 Bảng 3.2 Anh hưởng chế phẩm đến hiệu lực kháng nấm Colletotrichum gloeosporioides 23 Bảng 3.3 Ảnh hưởng chế phâm đến hiệu lực kháng nấm Fusarium oxysporum 25 Bảng 3.4 Chỉ số tăng trưởng hạt đậu nành bổ sung chế phẩm 27 Bảng 3.5 Hoạt lực enzyme chitinase đo máy ELISA 28 viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AgNPs Nano bạc Ag’ lon bạc CTS Chitosan OCTS Oligochitosan Mw Khối lượng phân tử Si/AgNPs/CTS Che phẩm nano silica gắn nano bạc sử dụng oligochitosan làm chất ồn định PGA Môi trường potato glucose agar R Solani Nam Rhizoctonia solani Fusarium sp Nam Fusarium oxysporum c Gloeosporìoides Nam Colletotrichum gloeosporioides TL Tỉ lệ KL Khối lượng TLNM Tỉ lệ nảy mầm TGNM Thời gian nảy mầm TĐNM Toe độ nảy mầm Cs Cộng ĐC Đối chứng IX ĐẶT VẤN ĐỀ Tính cấp thiết đề tài Việt Nam nước có nơng nghiệp phát triển mạnh nhờ điều kiện khí hậu tương đối thuận lợi số liệu thống kê từ Tồng cục Hải quan năm 2018, xuất mặt hàng rau củ Việt Nam đạt 3,52 tỷ USD; tăng 10,8% so với năm 2017 Đậu nành có nguồn gốc Đơng Nam Á, nhiên Mỹ nước có diện tích trồng 45% đạt 55% sản lượng giới, số nước có lượng sản xuất đậu nành lớn khác Brasil, Argentina, Trung Quốc Án Độ Ờ Việt Nam, đậu nành thực phâm có truyền thống lâu đời, cung cap protein chủ yếu cho người, thành phần thiếu mồi bừa ăn Diện tích trồng đậu nành Việt Nam vần thấp, đủ cung cấp cho khoảng - 10% nhu cầu thị trường dự kiến tới năm 2015 - 2020, Việt Nam thiếu hụt tới 3,5 - 4,0 triệu tấn/năm nên nhu cầu sản xuất đậu nành nước cần thiết Tuy vậy, dịch bệnh lở cổ rễ nấm Rhizoctonia solani, bệnh héo rũ, chết vàng xanh nấm Fusarium sp số loại trùng chích hút gây thiệt hại lớn đến xuất khơng có biện pháp sinh học tỏ có hiệu việc phòng trừ bệnh Những năm gần vật liệu sinh học công nghệ nano xem vật liệu quan trọng khoa học tương lai, phát triển nhanh Vật liệu nano đánh giá vượt trội với khả ứng dụng cao đa dạng nhiều lĩnh vực thực phẩm, mỹ phẩm, y dược, Đây loại vật liệu thu hút quan tâm nhiều nhà khoa học tính chất trội mà mang lại có khả kháng khuẩn, kháng nấm cao Trong kể đến silica chế tạo từ vỏ trấu quan tâm rộng rãi nguồn phụ phâm rẻ tiền từ nông nghiệp, nano silica tăng cường khả chống xâm nhập vi sinh vật gây bệnh vào tế bào thực vật thông qua chế tăng cường hoạt động enzyme chitinase, peroxidase, polyphenoloxydase, hạn che trình chích hút trùng cách tăng cường độ cứng vách tể bào Nano bạc biết đến tác nhân có khả kháng khuân, kháng nấm kháng virus cao Chitosan có khả kháng khuẩn, ức chế nấm, oligochitosan sản phẩm từ chitosan cắt mạch có khối lượng phân tử thấp với khả tăng cường sinh trưởng, nâng cao sức chống chịu thực vật X Nghiên cứu đánh giá hiệu kháng nấm bệnh gây hại đặc trưng đậu nành khảo sát khả tăng cường sinh trưởng hạt đậu nành nảy mầm phân bón Si/AgNPs/OCTS Từ đề tài “Khảo sát hiệu chế phẩm Si/AgNPs/OCTS khả kháng nấm in vitro khả kích thích sinh trưởng mầm đậu nành” thực Mục tiêu đề tài - Xác định hiệu lực kháng nấm Rhizoctonia solani, Colletotrichum gloeosporioides Fusarium oxỵsporum theo nồng độ sử dụng chế phẩm Si/AgNPs/OCTS; - Đánh giá khả tăng cường nảy mầm đậu nành chế phâm theo nồng độ sử dụng; - Khảo sát hoạt động enzyme chitinase in vitro trình nảy mầm hạt đậu nành xi Chương Ket thảo luận c.gloeosporioides bị ức chế tốt pH = nồng độ 1% CTS (Mw = 350 kDa , DD = 90%) Hình 3.4 Nấm c.gloeosporioides sau 168 ni cấy mơi trường có bổ sung chế phẩm Si/AgNPs/OCTS Bảng 3.2 Ảnh hưởng che phẩm đến hiệu lực kháng nấm Colletotrỉchum gloeosporioides Độ pha loãng (lần) Hiệu lực kháng nấm (%) of±o 50 79,52a ± 0,48 60 65,95b ± 0,24 80 59,76c ± 0,24 90 52,62d ± 0,24 100 42,62e ± 0,24 Các số liệu cột có kí tự khác khác biệt có ý nghĩa mức p < 0,05, liệu chuyến sang dạng (x + 0,5)l/2 trước xử lý thống kê 23 Chương Ket thảo luận 1.1.3 Hoạt tính kháng nấm Fusarium oxysporum cua chế phẩm Si/AgNPs/OCTS Ket khảo sát hiệu lực ức chế nấm Fusarium oxysporum độ pha loãng 0; 50; 70; 80; 90 100 lần cho thấy che phẩm ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng nấm môi trường có bơ sung chế phâm Hình 3.5 Nấm Fusarium oxysporum sau 144 nuôi cấy môi trường PGA có bổ sung chế phẩm Si/AgNPs/OCTS Sau 144 ni cấy, tản nấm đĩa đối chứng mọc chạm thành đìa petri Theo hình 3.5, đường kính đĩa đối chứng 74 mm cịn đĩa có độ pha lỗng 50 24 Chương Ket thảo luận lần cho thấy hiệu kháng nấm tốt nhất, đường kính tản nấm đạt 17,17 mm, thấp 4,3 lần so sánh với đối chứng Bảng 3.3 Ảnh hưởng chế phấm đến hiệu lực kháng nấm Fusarium oxysporum Độ pha loãng (lần) Hiệu lực kháng nấm (%) of±o 50 70,04a ± 0,23 70 60,59b ± 0,22 80 54,96c ± 0,45 90 47,30d ± 100 45,72e±0,78 Các số liệu cột có ki tự khác khác biệt có ỷ nghĩa mức p