khảo sát ảnh hưởng của dịch truyền đạm aminoplasmal đến khả năng phát triển của cordyceps militaris

TỔNG QUAN

Giới thiệu về nấm Cordyceps militaris

Đặc điểm hình thái và sinh trưởng trong tự nhiên của Cordyceps militaris

1-Bướm đẻ trứng; 2-Sâu non hình thành và di chuyển vào lòng đất; 3-Sâu non bị nấm Cordyceps ký sinh;

Hình 1 2: Sự hình thành nấm Cordyceps trong tự nhiên

Giống như hầu hết các loài Cordyceps khác, Cordyceps militaris là một loài nấm ký sinh trên côn trùng và ấu trùng của côn trùng Loài này chủ yếu lây nhiễm ở giai đoạn nhộng của các loài bướm khác nhau, rồi nhân lên trong cơ thể ký chủ vào mùa đông Bào tử nấm theo gió dı́nh vào bên ngoài ký chủ, sau đó từ bào tử hı̀nh thành các ống nảy mầm có các thể bám Các ống này tiết ra các enzyme như lipase, chitinase, protease làm tan vỏ ngoài của ký chủ và xâm nhập vào bên trong cơ thể Sau đó hệ sợi nấm hút dinh dưỡng và sinh trưởng mạnh mẽ chiếm toàn bộ cơ thể và gây chết ký chủ Ðến cuối hè hoặc thu quả thể nhô ra ngoài để phát tán bào tử vào không khí [12][13] Các quả thể nấm Cordyceps militaris thường có màu vàng nhạt hoặc màu da cam (Zheng và cs, 2011) Nấm Cordyceps militaris có các dạng bào tử khác nhau trong chu trı̀nh sống của nấm Ở các điều kiện môi trường khác nhau, sự hı̀nh thành các dạng bào tử cũng cho thấy sự khác biệt, như việc tạo bào tử tròn tạo ra trên môi trường nuôi cấy rắn hoặc các chồi bào tử tạo ra trên môi trường nuôi cấy lỏng [6]

1.2.1 Đặc điểm hình thái của Cordyceps militaris:

Nấm Cordyceps militaris là loài nấm ký sinh trên bướm và sâu bướm, có màu cam, chiều dài 8 - 10 cm Ðầu quả thể nấm có các đốm màu cam sáng Quả thể nấm nhô lên từ xác ấu trùng hoặc nhộng, mặt cắt ngang quả thể có màu nhạt, rỗng ở giữa Cỏc nang bào tử dài từ 300 - 510 àm, bề rộng 4 àm Cỏc bào tử nang hỡnh sợi, khụng màu và phõn đoạn, ̣ kớch thước 3.5 - 6 ì 1- 1.5 àm Cỏc bào tử nang này trong điều kiện nghèo dinh dưỡng sẽ đứt ra và nảy chồi tạo các bào tử thứ cấp Loài có phân bố rộng ở Bắc Мỹ, châu Âu và châu Á [17]

(Nguồn: Nguyễn Thị Liên Hương và cs, 2016) Hình 1 3: Nấm Cordyceps militaris và mặt cắt dọc quả thể chứa các bào tử

1.2.2 Đặc điểm sinh trưởng của nấm Cordyceps militaris:

Nấm Cordyceps militaris, là các loài nấm ký sinh trên sâu non, nhộng hoặc sâu trưởng thành của một số loài côn trùng Loài nấm đầu tiên các nhà khoa học Trung Quốc xác định trên vùng núi trên cao nguyên Tây Tạng thuộc chi Cordyceps là Cordyceps sinensis ký sinh vào ấu trùng của loài bướm thuộc chi Thitarodes Năm

1878, các nhà khoa học phát hiện ra loài Cordyceps militaris cũng ký sinh trên ấu trùng của các loài côn trùng thuộc chi Thitarodes [11][19]

(Nguồn: http://vienbaovethucvat.com.vn) Loài Cordyceps militaris được nghiên cứu nhiều nhất trong chi Cordyceps và cũng là loài có số lượng ký chủ đa dạng nhất Khả năng thích nghi của loài này cao nên chúng được tìm thấy ở nhiều khu hệ sinh thái trên trái đất Ký chủ phổ biến của loài Cordyceps militaris trong tự nhiên bao gồm ấu trùng và nhộng của các loài bướm, côn trùng cánh cứng (Coleoptera), cánh màng (Hymenoptera) và hai cánh (Diptera) như: Ips sexdentatus, Lachnosterna quercina, Tenebrio molitor (thuộc cánh cứng),

Cimbex similis (thuộc cánh màng) và Tipula paludosa (thuộc họ hai cánh) Trong tự nhiên có nhiều loài Cordyceps có hình thái tương tự hoặc gần giống loài Cordyceps

Hình 1 4: Nấm Cordyceps militaris trong tự nhiên militaris, bao gồm Cordyceps cardinalis, Cordyceps Kyusyuensis A Kawam., Cordyceps pseudomilitaris HywelJones & Sivichai, Cordyceps rosea Kobayasi & Shimizu, Cordyceps roseostromata Kobayasi & Shimizu, Cordyceps washingtonensis và một số loài khác [5]

Điều kiện nuôi trồng

Nhiệt độ môi trường có ảnh hưởng lớn đến việc tạo quả thể trong nuôi trồng nấm Các nghiên cứu cho thấy khoảng nhiệt độ 18–22°C là tối ưu cho sự sinh trưởng sinh khối nấm và năng suất quả thể Tuy nhiên, quá trình này sẽ giảm mạnh khi tăng nhiệt độ trên 25°C (Sung và cs, 1999; Gao và cs, 2000) Do đó, cần lưu ý về yếu tố nhiệt độ môi trường khi trồng nấm và phải đảm bảo điều kiện này khi tiến hành nuôi trồng nấm ở khu vực có nhiệt độ môi trường không thích hợp, như sử dụng máy điều hòa [6]

Cường độ ánh sáng cũng ảnh hưởng lớn đến quá trình nuôi cấy tạo quả thể nấm Trong điều kiện che tối, việc tạo quả thể bị ức chế (Gao và cs, 2000; Sato và Shimazu, 2002) Các nghiên cứu cho thấy cường độ ánh sáng tối ưu cho sinh trưởng của nấm có thể dao động tùy chủng nấm, tuy nhiên từ 500-1000 lux được xem là điều kiện thı́ch hợp nhất (Sung và cs, 1999; Gao và cs, 2000; Sato và Shimazu, 2002) Cần thiết kế các chế độ chiếu sáng phù hợp trong phòng nuôi khi nuôi trong điều kiện nhân tạo đối với nấm Cordyceps militaris [6]

1.3.3 Độ thoáng khı́ và ẩm độ։ Ðộ thoáng khı́ tốt kı́ch thích sự sinh trưởng của tơ nấm và tổng sinh khối nấm Các nghiên cứu cho thấy việc sử dụng màng bao HFМ (Hydrophobic Fluoropore Мembrane) cho kết quả tốt nhất về hiệu suất quả thể nấm Cordyceps militaris (Zhang và cs, 2010) Khoảng ẩm độ thı́ch hợp cho nấm dao động từ 70– 90 %, tương đương với độ ẩm không khí trong tự nhiên sẽ phù hợp cho việc tạo quả thể Khi độ ẩm thấp sẽ làm môi trường khô nhanh hạn chế sự phát triển của tơ nấm cũng như quả thể Do đó, trong phòng nấm cần bổ sung ẩm bằng máy phun ẩm với nguồn nước sạch khuẩn Ngoài độ thoáng khí và ẩm độ, dịch nuôi cấy Cordyceps militaris cần được chú ý duy trı̀ nhiệt độ 20–25°C và bổ sung các nguồn dinh dưỡng như carbohydrate, nitrogen và muối khoáng [20]

Dinh dưỡng nuôi trồng

Nguồn cacbon là thành phần chính của môi trường dinh dưỡng, đảm bảo cho sự phát triển của vi sinh vật và tạo hợp chất thứ cấp như polysaccharide, Cordycepic acid Mặc dù, nhiều nghiên cứu coi sử dụng glucose như một nguồn cacbon thích hợp và cơ bản, tuy nhiên một số nghiên cứu cũng đã so sánh ảnh hưởng của các nguồn cacbon khác nhau tới sự sinh trưởng của nấm Cordyceps sp Và việc tạo ra các hợp chất polysaccharide và Cordycepic acid

Khi lên men Cordyceps sp Pokhrel và Ohga đã sử dụng 7 nguồn cacbon khác nhau ở cùng nồng độ 30g/l trong môi trường cơ bản Trên các môi trường ở nguồn cacbon khác nhau, kết quả thu được về sinh khối nấm cũng như các hợp chất có hoạt tính sinh học cũng rất khác biệt Trong 7 nguồn cacbon, lượng sinh khối nấm tốt nhất là lactose xếp sau là glucose và fructose (6,36 – 6,73 g/l) Các tác giả cho rằng các nguồn cacbon khác nhau đã ảnh hưởng tới cơ chế ức chế dị hóa của trao đổi thứ cấp Glucose hoặc maltose dễ dàng sử dụng hơn vì glucose là thành phần đường cơ bản của các Exopolysaccharide ngoại bào

Nitơ là nhân tố có tính quyết định tới sự tổng hợp enzyme có trong cơ thể, ảnh hưởng mạnh tới sự trao đổi sơ cấp và thứ cấp Một nguồn Nitơ cơ bản có trong môi trường bao gồm dạng vô cơ ammonium, nitrat hoặc dạng hữu cơ là các acid hoặc protein và thường sử dụng nguồn nitơ là cao nấm men, peptone ở dạng riêng rẽ hay kết hợp cả hai loại ở mỗi nồng độ từ 1-5g/l Pokhrel và Ohga đã nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn Nitơ hữu cơ và vô cơ cho sự phát triển của sinh khối nấm Trong các nguồn Nitơ sử dụng trong nghiên cứu, cao nấm men cho khả năng phát triển cao nhất với hàm lượng sinh khối đạt 7,03g/l Khi nồng độ cao nấm men thay đổi từ 0,5% – 2% thì nồng độ ở 1% cho nấm khả năng phát triển tối đa 2,46g/l Tất cả các hợp chất chưa nitơ đều cho thấy những ảnh hưởng tích cực đến quá trình tạo sinh khối nấm, lượng sinh khổi thu được lên đến xấp xỉ 2,5 đến 4,7 lần Lương sinh khối tối đa trên môi trường sử dụng hợp chất hữu cơ là 2,5-3,0g/l.

Thành phần dinh dưỡng và dịch truyền đạm Aminoplasmal

Trong môi trường nuôi trồng nấm Cordyrceps militaris, gạo là thành phần chính Gạo lứt thường được sử dụng do vẫn còn lớp vỏ cám bên ngoài hạt chứa nhiều vitamin B1 [2] Gạo lứt đỏ với lớp vỏ cám rất dày bao gồm chất tinh bột, chất béo, chất đạm, chất xơ cùng các vitamin như B1, B2, B3, B6; các axit như paraaminobenzoic (PABA) pantothenic (vitamin B5), folic (vitamin M), phytic; các nguyên tố vi lượng như canxi, selen, glutathion (GSH), sắt, magie, kali và natri

Bảng 1 1: Thành phần dinh dưỡng có trong 100g gạo lứt theo Bộ Y Tế viện dinh dưỡng Bảng thành phần thực phẩm Việt Nam

Bảng 1 2: Thành phần dinh dưỡng có trong dịch truyền đạm Aminoplasmal

Các hoạt chất sinh học và thành thành phần dinh dưỡng của nấm

Các tác động được cho là của nấm Cordyceps militaris là chống ung thư, chống di căn, điều hòa miễn dịch, chống oxy hóa, chống viêm, diệt khuẩn, hạ đường huyết, chống lão hóa, bảo vệ thần kinh và bảo vệ thận Cụ thể, polysaccharide đảm nhiệm chống viêm, chống oxy hóa, chống ung thư, chống di căn khối u, điều hòa miễn dịch

Cordycepin đảm nhiệm chống ung thư, chống nhiễm khuẩn Ergosterol ức chế ung thư và điều hòa miễn dịch

1.6.1Các hợp chất dược liệu

Các hoạt chất dược liệu của loài nấm Cordyceps militaris ứng dụng trong điều trị bệnh và nâng cao sức khỏe con người, do đó loài nấm này có giá tri ̣ kinh tế cao Nấm Cordyceps militaris rất khan hiếm trong tự nhiên Vì vậy, việc sản xuất ở quy mô lớn các chiết xuất từ nấm phục vụ nghiên cứu và điều trị bệnh từ Cordyceps militaris hiện đang là một vấn đề cấp thiết.[6]

Các hợp chất chống ung thư: Hợp chất Cordycepin (3′-deoxyadenosine) từ nấm cho thấy có hoạt tính kháng vi sinh vật, kháng ung thư, ngừa di căn, điều hòa miễn dịch.[6]

Hoạt tı́nh kháng oxy hóa: Các nghiên cứu cho thấy hơp chất CM-hs-CPS2 chứa trong dịch chiết nấm C.militaris có khả năng bắt gốc tự do Hoạt tı́nh khử và tạo phức ở nồng độ (8 mg/ml) là 89%, 1,188 và 85.[6]

Tăng số lượng tinh trùng: ̣ Nghiên cứu trên lợn cho thấy khi dùng chế phẩm từ Cordyceps militaris, số lượng tinh trùng tăng, số phần trăm tinh trùng di động và hı̀nh dạng bı̀nh thường tăng Hiệu quả này được duy trı̀ thậm chí sau 2 tuần ngưng sử dụng chế phẩm Lượng Cordycepin trong tế bào tăng trong thời gian sử dụng chế phẩm nên có khả năng chất này làm tăng lượng tinh dịch và chất lượng tinh trùng ở lợn.[6]

Hạn chế vius cúm: Acidic polysaccharide (APS) tách chiết từ nấm Cordyceps militaris trồng trên đậu nành nảy mầm có khả năng ứng dụng trong điều trị cúm A

Chất này góp phần điều hòa hoạt động miễn dịch của các đại thực bào.[6]

Kháng khuẩn, kháng nấm và kháng ung thư: Protein (CМP) tách chiết từ nấm có kı́ch thước 12kDa, pI 5,1 và có hoạt tính trong khoảng pH 7−9 Protein này ức chế nấm Fusarium oxysporum và gây độc đối với tế bào ung thư bàng quan (Byung-Tae et al., 2009) Hơp chất Cordycepin còn cho thấy khả năng kháng vi khuẩn Clostridium

Các hợp chất dẫn xuất từ nấm được mong đợi ứng dụng trong việc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn đường ruột (Young-Joon ̣ et al., 2000) Cordycepin ngăn sự biểu hiện của gen T2D chịu trách nhiệm điều hòa bệnh tiểu đường thông qua viêc ức chế các đáp ứng phản ứng viêm phụ thuộc NF-κB, do đó được hy vọng sẽ ứng dụng được như một chất điều hòa miễn dịch dùng trong điều trị các bệnh về miễn dịch.[6]

Tan huyết khối: Enzyme tiêu sợi huyết tách chiết từ nấm Cordyceps militaris có hoạt tính gắn fibrin, và do đó xúc tiến việc phân hủy fibrin ̣ Enzyme này có khả năng sử dụng trong điều trị tan huyết khối tương tự như các enzym fibrinolytic mạnh khác như nattokinase và enzyme chiết từ giun đất Khi enzyme này có thể sản xuất ở quy mô lớn sẽ là một giải pháp thay thế hữu hiệu cho các enzym fibrinolytic giá thành cao hiện đang được sử dụng cho bệnh tim lão hóa ở người.[6]

Tı́nh kháng viêm: Ðể xác định tác dụng kháng viêm của nấm, dich chiết từ quả thể nấm Cordyceps militaris (CМWE) được thử nghiệm về tác dụng kiểm soát lipopolysaccharide (LPS) (chịu ̣ trách nhiệm kı́ch thı́ch việc sản xuất nitric oxide), việc phóng thích yếu tố hoại tử khối u α (TNF-α) và interleukin-6 (IL-6) của tế bào RAW 264,7 Các đại thực bào được xử lý với nồng độ khác nhau của CМWE làm giảm đáng kể LPS, TNF-α và IL-6 và mức độ giảm theo nồng độ của dịch chiết Những ̣ kết quả này cho thấy rằng CMWE có tác dụng ức chế mạnh đến việc sản xuất các chất trung gian gây viêm của tế bào.[6]

1.6.2 Thành thành phần dinh dưỡng của nấm Cordyceps militaris:

Kết quả nghiên cứu của Hur H (2008) cho thấy trong quả thể nấm Cordyceps militaris có chứa lượng acid amin tổng số cao hơn trong sinh khối nấm (69,32 mg/g trong quả thể và 14,03 mg/g trong sinh khối nấm) Khối lượng acid amin mỗi loại trong quả thể và sinh khối nấm cũng có sự chênh lệch, dao động từ 1,15-15,06 mg/g và 0,36- 2,99 mg/g Thành phần acid amin của mỗi loại trong quả thể bao gồm: lysine (15,06 mg/g), glutamic acid (8,79 mg/g), prolin (6,68 mg/g), threonine (5,99 mg/g), arginine (5,29 mg/g), và alanine (5,18 mg/g) Số liệu phân tích của Chang và cs (2001) cho thấy phần lớn trong sinh khối nấm chứa acid aspartic (2,66 mg/g), valine (2,21 mg/g) và tyrosine (1,57 mg/g) [8]

Acid béo bao gồm cacbon, hydro và oxy Ở Cordyceps lượng acid béo no được tìm thấy là 57,84% gồm có C16:1, C17:1, C18:1, C18:2 Acid linoleic chiếm hàm lượng cao nhất 38,44%, tiếp đó là acid oleic 17,94% Các acid béo không no chiếm 42,16% bao gồm C14, C15, C16, C17, C18, C20 và C22 Acid palmitic và acid octadecanoic chiếm hàm lượng cao nhất lần lượt là 21,86% và 15,78% Các acid béo không no có chức năng giảm lipid máu và bảo vệ chống lại bệnh tim mạch, chứa một loạt các hợp chất dinh dưỡng như các acid amin thiết yếu : Vitamin E và K, các vitamin tan trong nước như B1, B2 và B12, nguyên tố đa lượng và vi lượng (K, Na,

Ca, Mg, Fe, Cu, Mn, Zn, Pi, Se, Ti, Cr, Ga, V).[11]

Adenosine và Cordycepin là hai hợp chất có dược tính cao của nấm Cordyceps militaris Adenosine chiếm 0,18% trong quả thể và 0,06% trong sinh khối nấm Ðối với hợp chất Cordycepin, trong quả thể có hàm lượng cao gấp 3 lần so với sinh khối (0,97% so với 0,36%) [10]

Nấm Cordyceps được đánh giá cao về giá trị dinh dưỡng trong sản xuất thực phẩm chức năng và sản xuất thuốc trong phòng và chữa bệnh Chúng chứa rất nhiều loại đường bao gồm mono-, di- và các oligosaccharide và nhiều polysaccharides phức tạp [11]

Các polysaccharide có khả năng chống lại hoạt động ung thư của các tế bào ung thư Trong một số loại nấm, polysaccharide liên kết với các protein hoặc peptide tạo thành các hệ polysaccharide – protein hoặc polysaccharide – peptide cấu trúc có hoạt tính kháng u mạnh hơn [11]

Các nghiên cứu trong nước và ngoài nước

Theo Nguyễn Thị Minh Hằng và cộng sự, (2017), “Nghiên cứu nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) trên giá thể tổng hợp và nhộng tằm” Tác giả đã sử dụng nhiều nguyên liệu khác nhau bổ sung vào các dạng môi trường khác nhau để khảo sát về môi trường tạo quả thể và môi trường nhân giống Ðặc biệt là môi nhân giống lỏng gồm các tỷ lệ thành phần (20g/l glucose + 5 g/l pepton + 5 g/l cao nấm men + 0,5 g/l MgSO 4 7H 2 O + 0,25 g/l KH 2 PO 4 ) Kết quả cho thấy hệ sợi phát triển nhanh (chỉ 5 ngày hệ sợi đã ăn kín bề mặt môi trường).[4]

Theo Xie và cộng sự (2009b), Nghiên cứu về ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh khối nấm và sinh tổng hợp Cordycepin nội bào của Cordyceps militaris trong môi trường tự nhiên Kết quả cho thấy môi trường tự nhiên là hỗn hợp của 53% bột gạo lứt, 6% bia tươi, 42% nước ép đậu nành được sử dụng để lên men trong bình lắc Nhiệt độ lên men 28℃, pH 6.2 và dung tích trung bình 57ml [22]

Theo Gao et al (2000) cho biết nấm Cordyceps militaris yêu cầu hàm lượng nitơ tương đối thấp Nếu hàm lượng nitơ quá nhiều trong môi trường sẽ làm chậm quá trình biệt hóa để hình thành quả thể Trong giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng, tỷ lệ C/N vào khoảng 4/1 – 6/1 là thích hợp, giai đoạn sinh trưởng sinh thực tỷ lệ thích hợp từ 10/1 – 15/1.

VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

Địa điểm và thời gian thí nghiệm

Ðịa điểm: Nghiên cứu được thực hiện tại: Trường Ðại học Mở Tp.HCM (cơ cở 3 Bình Dương)

Vật liệu và hóa chất sử dụng trong đề tài

- Giống nấm dùng phân lập: Giống nấm Cordyceps militaris được nuôi trồng tại 68

Lê Thị Trung, phường Phú Lợi, thành phố Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương (cơ sở 3 Bình Dương Trường Ðại học Mở thành phố Hồ Chí Minh)

- Khoai tây: Chọn những củ không nảy mầm, còn tươi và sạch bệnh

Dụng cụ và thiết bị

- Dụng cụ: Nồi nấu, đĩa petri, đồng hồ, Erlen 250 ml, đèn cồn, giấy lọc, cán dao số 3, dao mổ số 12, khăn sạch, bật lửa, phễu lọc, đũa thủy tinh, bình định mức 1000 ml,…

- Thiết bị: Máy lắc tròn, bếp gas, nồi hấp khử trùng, máy đo pH, cân phân tích, máy chụp ảnh,…

- Hóa chất: Ðường D-glucose, Kalidyhydro phosphate (KH 2 PO 4 3H 2 O), Magie sunphate (MgSO 4 7H 2 O), cồn 96 o , NaOH, HCl.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nội dung nghiên cứu

Khảo sát sự ảnh hưởng của dịch truyền đạm Aminoplasmal đến sự tăng sinh của hệ sợi nấm Cordyceps militaris

Khảo sát tối ưu hàm lượng Nitơ từ dịch truyền đạm Aminoplasmal bổ sung vào môi trường rắn đến sự hình thành và phát triển quả thể nấm Cordyceps militaris Khảo sát sự kết hợp từ dịch truyền Aminoplasmal và bột đậu nành bổ sung vào môi trường rắn đến sự hình thành và phát triển quả thể nấm Cordyceps militaris Khảo sát sự kết hợp từ dịch truyền Aminoplasmal và nhộng khô bổ sung vào môi trường rắn đến sự hình thành và phát triển quả thể nấm Cordyceps militaris.

Các phương pháp nghiên cứu thực hiện

Sơ đồ quy trình nuôi cấy:

GIỐNG CẤP 1 (Môi trường thạch)

GIỐNG CẤP 2 (Môi trường lỏng)

Khảo sát tối ưu hàm lượng Nitơ từ dịch truyền đạm

Aminoplasmal bổ sung vào môi trường rắn đến sự hình thành và phát triển quả thể nấm

Khảo sát ảnh hưởng của dịch truyền đạm Aminoplasnal đến sự tăng sinh của hệ sợi nấm Cordyceps militaris

Khảo sát sự kết hợp từ dịch truyền

Aminoplasmal và nhộng khô bổ sung vào môi trường rắn đến sự hình thành và phát triển quả thể nấm Cordyceps militaris

Khảo sát sự kết hợp từ dịch truyền Aminoplasmal và bột đậu nành bổ sung vào môi trường rắn đến sự hình thành và phát triển quả thể nấm Cordyceps militaris

3.2.1 Phương pháp chuẩn bị môi trường nuôi cấy Мôi trường thạch dinh dưỡng PDA (Potato D-glucose Agar)

Nước cất vừa đủ: 1000 (ml) pH: 6.0 - 6.5 Мôi trường giống lỏng:

Khoai tây(*) D-glucose Cao nấm men

KH 2 PO 4 MgSO 4 7H 2 O Vitamin B1 Nguồn bổ sung Nitơ (Pepton, bột đậu nành, dịch truyền đạm) Nước cất vừa đủ: 1000 (ml) pH: 6.0 - 6.5 Мôi trường giá thể:

Gạo lứt Khoai tây(*) D-glucose Saccarozo

KH 2 PO 4 MgSO 4 7H 2 O Vitamin B1 Bột đậu nành: Khảo sát Dịch truyền đạm Aminoplasmal: Khảo sát Nhộng khô: Khảo sát

Nước cất vừa đủ: 1000 (ml) pH: 6.0 - 6.5

(*)Khoai tây: Chọn những củ không nảy mầm, rửa sạch, gọt vỏ, dùng dao cắt nhỏ, cho vào nồi, bổ sung 1000 ml nước cất, đun sôi từ 15 – 20 phút, lọc thu dịch chiết, bổ sung các chất dinh dưỡng rồi định mức lên 1000 ml Ðối với môi trường bổ sung khoáng cần chỉnh pH về 6.0 – 6.5 bằng dd NaOH 0.05N Môi trường được hấp khử trùng ở 121 o C, 1atm trong 30 phút Kiểm nhiễm sau 24h và tiến hành cấy

Cho vào bình nón 20ml dung dịch chứa axit amin và 0,5ml dung dịch phenolphtalein 1% Ðể trung hòa dung dịch axit amin, cho từng giọt NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu vàng nhạt Cho thêm 20ml dung dịch fomanđehit 30% đã trung hòa và lắc đều bình nón Sau 5 phút dung dịch mất màu Chuẩn độ bằng NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu vàng nhạt trở lại (pH = 9,0) Thí nghiệm kiểm tra cũng được tiến hành tương tự với các hoá chất trên nhưng thay dung dịch chứa axit amin bằng nước cất cùng thể tích

Xác định hàm lượng (mg) acid amin trong mẫu

1 ml dung dịch NaOH 0,1N tương đương l, 4 mg nitơ Số mg nitơ amin của dung dịch nghiên cứu được tính theo công thức: mgN = (A - B) x 1, 4

Trong đó: A – Số ml NaOH 0, 1N dùng để chuẩn độ bình thí nghiệm

B – Số ml NaOH 0, 1N dùng để chuẩn độ bình kiểm tra

3.2.3 Phương pháp thu chỉ tiêu trọng lượng quả thể nấm cordyceps militaris

Cân trọng lượng tươi trong từng hộp: Cân khối lượng đĩa nhựa М1, cắt quả thể nấm sát đế rồi bỏ lên đĩa nhựa đem đi cân М2 М0: Khối lượng tươi М1: Khối lượng đĩa nhựa М2: Khối lượng cả nấm lẫn đĩa

Cân trọng lượng khô trong từng hộp: Lấy khối lượng tươi М0 của từng hộp mang đi sấy ở 40 o C trong 24h đến 2 lần cân liên tiếp có khối lượng không đổi

3.2.4 Phương pháp đo năng suất sinh học BE%

Năng suất sinh học BE tính theo phương pháp

3.2.5 Phương pháp cân sinh khối:

Sử dụng phương pháp cân sinh khối, được thực hiện như sau: Cắt những miếng giấy lọc có kích thước bằng nhau, ghi số theo từng nghiệm thức và theo mỗi lần lặp lại, cho sấy cùng một lúc với nhiệt độ là 100 o C, cứ 15p đem ra cân một lần, sấy tới khi 2 lần cân liên tiếp có khối lượng không thay đổi thì dừng lại

Hút lượng dung dịch môi trường (lắc đều) cần khảo sát với thể tích bằng nhau từ các nghiệm thức trong thí nghiệm lọc qua giấy lọc trên phễu, sau khi lọc xong hết tất cả, đem sấy cùng một lúc với nhiệt độ 100 o C, cứ sau 15p đem cân một lần, sấy tới khi 2 lần cân liên tiếp có khối lượng không thay đổi thì dừng lại, lúc này khối lượng sinh khối đã đạt được khối lượng không đổi

Dùng cân phân tích 4 số để cho kết quả chính xác, cân lần lượt từng mẫu giấy chứa sinh khối đã sấy khô và ghi lại kết quả

Sau khi thu được kết quả hoàn chỉnh ta dùng công thức này để tính được khối lượng sinh khối cần khảo sát:

Khối lượng sinh khối của sợi tơ nấm ( Gram) = M2 – M1

M1: khối lượng giấy ban đầu sau khi sấy ( Gram)

M2: Khối lượng giấy chứa sinh khối sau khi sấy ( Gram)

3.2.6 Phương pháp xử lý số liệu

Kết quả được xử lý thống kê trên phần mềm Stagraphis plus 3.0 và Excel.

Bố trí thí nghiệm

3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của dịch truyền đạm Aminoplasmal đến sự tăng sinh của hệ sợi nấm Cordyceps militaris

Mục đích: Tìm ra nguồn Nitơ phù hợp để bổ sung vào môi trường nhân giống lỏng

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức, 3 lần lặp lại mỗi lần lặp lại 10 erlen

Bảng 3 1: Bố trí thí nghiệm 1

STT KÝ HIỆU NGHIỆM THỨC HÀM LƯỢNG %N

3.3.3 Chỉ tiêu đánh giá thí nghiệm 1

Thời gian 5 ngày sau khi cấy đem lọc dung dịch cân sinh khối nấm tươi và khô

KÝ HIỆU NGHIỆM THỨC SINH KHỐI

3.3.4 Thí nghiệm 2: khảo sát tối ưu hàm lượng Nitơ từ dịch truyền đạm Aminoplasmal bổ sung vào môi trường rắn đến sự hình thành và phát triển quả thể nấm Cordyceps militaris

Mục đích: Xác định hàm lượng tối ưu của dịch truyền đạm Aminoplasmal bổ sung vào giá thể nuôi nấm Cordyceps militaris để phát triển tốt nhất

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 nghiệm thức, 3 lần lặp lại với mỗi lần 15 hộp

- Trọng lượng tươi (gram), Trọng lượng khô (gram), năng suất sinh học BE

3.3.7 Thí nghiệm 3: khảo sát sự kết hợp từ dịch truyền Aminoplasmal và nhộng khô bổ sung vào môi trường rắn đến sự hình thành và phát triển quả thể nấm Cordyceps militaris

Mục đích: Xác định hàm lượng từ dịch truyền đạm Aminoplasmal và nhộng khô bổ sung vào giá thể nuôi nấm Cordyceps militaris để phát triển tốt nhất

STT KÝ HIỆU NGHIỆM THỨC HÀM LƯỢNG

2 F1 Dịch truyền đạm 2ml/l + 1g/l nhộng 1%

3 F2 Dịch truyền đạm 3ml/l+0,9g/l nhộng 1%

- Trọng lượng tươi (gram), Trọng lượng khô (gram)

F1 Dịch truyền đạm 2ml/l + 1g/l nhộng

F2 Dịch truyền đạm 3ml/l+0,9g/l nhộng

Thí nghiệm 4: khảo sát sự kết hợp từ dịch truyền Aminoplasmal và bột đậu nành bổ sung vào môi trường rắn đến sự hình thành và phát triển quả thể nấm Cordyceps militaris

Mục đích: Xác định hàm lượng từ dịch truyền đạm Aminoplasmal và bột đậu nành bổ sung vào giá thể nuôi nấm Cordyceps militaris để phát triển tốt nhất

2 G1 Dịch truyền đạm 2ml/l + 5,6g/l bột đậu nành 1%

Dịch truyền đạm 3ml/l + 4,8g/l bột đậu nành

- Trọng lượng tươi (gram), Trọng lượng khô (gram)

Dịch truyền đạm 2ml/l + 5,6g/l bột đậu nành G2

Dịch truyền đạm 5ml/l + 1,6g/l bột đậu nành

Tiêu đề	Khảo sát ảnh hưởng của dịch truyền đạm Aminoplasmal đến khả năng phát triển của Cordyceps militaris
Tác giả	Lưu Thanh Vũ
Người hướng dẫn	ThS. Nguyễn Thị Phương Khanh
Trường học	Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh
Chuyên ngành	Công nghệ Sinh học
Thể loại	Khóa luận tốt nghiệp
Năm xuất bản	2021
Thành phố	Hồ Chí Minh

Định dạng
Số trang	64
Dung lượng	2,39 MB