Khảo sát ảnh hưởng bã hèm mật rỉ lên sự sinh trưởng và khả năng tích lũy Astaxanthin của tảo Haematococcus Pluvialis

NTTU-NCKH-04 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH BÁO CÁO TÕNG KẾT ĐÈ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP co SỞ NĂM 2021 Tên đề tài: KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG BÃ HÈM MẬT RỈ LÊN sụ SINH TRƯỞNG VÀ KHẢ NĂNG TÍCH LŨY ASTAXANTHIN HAEMA TOCOCCUS PLUVIALIS Mà đề tài: 2021.01.108 Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Bích Ngọc Đơn vị cơng tác: Viện Kỳ thuật CNC NTT Thời gian thực hiện: 06 tháng TP Hồ Chỉ Minh, neàv thảng năm 2021 CỦA TẢO MỤC LỤC MỞ ĐẢU CHƯƠNG TÓNG QUAN TÀI LIỆU CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Từ nguyên OHM Optimal Haematococcus medium BBM Bold Basal medium N Nitơ p Photpho B Bo Fe Sắt DANH MỤC CÁC BẢNG BIẾU, sơ ĐÒ, HÌNH ẢNH Hình 1 Tê bào tảo Haematococcus pluvialis Hình Tảo Haematococcus pluvỉalis sau hoạt hóa Hình Dịch nuôi cấy tảo Haematococcus Phivialis 12 Hình Hình thái te bào tảo Haematococcus Pluvialis 16 Hình 3 Mật độ tế bào tảo điều kiện nuôi cấy khác 17 Hình Tốc độ tăng trưởng đặc hiệu tảo 17 Hình Trọng lượng khơ tảo Haematococcuspỉuvỉalis điều kiện ni cấy 17 Hình Hàm lượng astaxanthin tích lũy điều kiện ni cấy 17 TĨM TẮT KỂT QUẢ NGHIÊN cứu 01 Kết quà đạt Công việc thực STT Nôi dung 1: Khảo sát nồng độ Chọn nồng độ CMS tối ưu CMS Đánh gia hàm lượng Astaxanthin 02 Nội dung 2: Xử lý số liệu viết 01 báo đăng tạp chí nước báo, báo cáo STT 01 thảo Sản phẩm đạt Sản phẩm đăng ký Bài báo Bản thảo Thời gian thực hiện: Thời gian nộp báo cáo : MỞĐẢƯ Hiện nay, ngành công nghiệp sản xuất cồn Việt Nam phát trien có nguồn nguyên liệu phong phú dồi Bã hèm mật rỉ (Condensed molasses solubles:CMS) sản phẩm thừa cịn sau q trình lên men mật mía để sản xuất ethanol CMS coi thuộc loại nước thải ô nhiễm nặng, hàm lượng hữu cao (ở dạng đậm đặc nước thải có COD từ 50.000 mg/1 đến 100.000 mg/1), pH giá trị thấp (từ 4,2 đến 4,5), nhiệt độ cao (từ 75°c đến 85°C); mật rỉ sè thải 3m3 CMS Do đó, việc giảm thiểu nồng độ ô nhiễm đạt tiêu chuẩn khó khăn, địi hởi phải kết họp nhiều phương pháp nhiều ban ngành Tảo H.pluvialis nguồn astaxanthin tự nhiên dồi Hàm lượng astaxanthin tạo phụ thuộc nhiều vào điều kiện nuôi cấy Hầu hết tế bào vi tảo trì trạng thái sinh dường, tích lũy khơng tích lũy astaxanthin ni điều kiện thích họp Tuy nhiên, điều kiện stress, tế bào chuyển sang dạng bào nang khơng chuyển động kích thích phù hợp tế bào tảo tích lũy lượng lớn astaxanthin Vì vậy, điều kiện cho tế bào sinh trưởng tong hợp astaxanthin khác Việc xác định rõ ràng pha sinh trưởng tế bào pha tong họp astaxanthin cần thiết đe đạt mật độ tế bào hàm lượng astaxanthin cao Trong yếu tố dinh dưỡng mơi trường quan trọng Sự thiếu hụt nitơ có cảm ứng đen trình tạo astaxanthin [1], nhiên bồ sung lượng nitơ cao gấp lần môi trường nuôi cấy RM mật độ tế bào tảo đạt cao Ngoài ra, photpho dư thừa acetate bổ sung tiền chất carotenoit khác chứng minh có ảnh hưởng đến q trình tạo astaxanthin [1], [2] Trước thực trạng yếu tố ảnh hưởng nêu trên, sừ dụng bã hèm mật rỉ để nuôi cấy tảo H.pỉuvialỉs nhằm sử dụng đường protein khoáng chất CMS nguồn dinh dưỡng thay cho tảo sinh trưởng, tích lũy astaxanthin; từ xây dựng quy trình ni cấy tiết kiệm hiệu vừa giải vấn đề xử lý nước thải vừa có thêm nguồn thức ăn cung cấp cho thủy sản phân bón cho nông nghiệp Kết thực nghiệm cho thấy, tảo H.pluvialis sinh trưởng mơi trường có chứa CMS Trọng lượng khơ tích lũy cao sau q trình ni cấy điều kiện CMS 0,2 % đạt 209,3 mg/L tốc độ tăng trưởng đặc hiệu đạt 0,06 mg/L/ngày Hàm lượng astaxanthin cao đạt 2,5 % so với trọng lượng khô điều kiện CMS 0,01 % CHƯƠNG TÓNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tảo Haematococcus Pluvialìs Tảo Heamatococcus pluvialis tảo lục đơn bào, chu kỳ tế bào chia làm hai giai đoạn dựa hình thái sinh lý tế bào là: giai đoạn di động giai đoạn không di động Te bào H pluvialis giai đoạn di động có thành mỏng, hai roi chủ yếu phát triển cách tăng sinh tế bào Ngược lại, tế bào H pluvialis giai đoạn khơng di động có vách dày, khơng roi xảy q trình tích tụ astaxanthin [3] Dạng roi di động Khơng roi tích lũy Astaxanthin Hình 1 Tê bào tảo Haematococcus pluvialis Hàm lượng astaxanthin tích lũy từ 0,5 - 4% trọng lượng khô H.pluvialis [4] cao nhiều so với số loại vi tảo lục khác như: Neochloris wimmeri, Protosiphon botryoides, Scotiellopsis oocystiformis, Chorella zofingiensis Scenedesmus vacuolatus (0,27 -1,92% trọng lượng khô) [5] Khi tiếp xúc với điều kiện môi trường khẳc nghiệt H.pluvialis tạo lượng lớn ketocarotenoid astaxanthin Trong điều kiện tăng trưởng tối ưu, tế bào sinh dưỡng tảo tích lũy carotenoid sơ cap (P- carotene, lutein, violaxanthin, neoxanthin zeaxanthin) thường chứa lục lạp Tuy nhiên, tảo tiếp xúc với điều kiện hạn chế tăng trưởng tế bào bắt đầu tổng hợp astaxanthin, hình thái bắt thay đổi để thích ứng với mơi trường khắc nghiệt Sự hình thành astaxanthin H.pluvialis có liên quan đến thay đổi lớn hình thái, sinh lý đặc điểm quang hợp Những thay đồi biểu qua việc rụng roi, tạo bào tử trứng bất động, quan tích tụ lượng lớn lipid ngun sinh chất có chứa astaxanthin, thành tế bào sporopollenin dày có khả chống lại phân hủy oxy hóa giảm khả quang hợp Trong điều kiện môi trường khắc nghiệt, ketocarotenoid canthaxanthin, echinenone, adonirubin p-carotene tìm thấy tế bào nhiên chiếm lượng nhỏ khoảng vài phần trăm so với lượng carotenoid tổng Carotenoid chứa nhóm hydroxy (ví dụ:astaxanthin) thường xuất tảo Haemato-coccus spp., Oocystis spp., v.v dạng hồn hợp phức tạp acid béo mono- bis-este Những carotenoidacyl este chiếm tới 98% tổng số carotenoid chủng tảo đặc biệt Tỷ lệ xác cùa mono: bis-este phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy [1] 1.2 Astaxanthin ứng dụng Astaxanthin [(3S,3'S)-3,3'-dihydroxy-p,p-carotene-4,4'-dione] xanthophyll ketocarotenoid có đặc tính chống oxy hóa mạnh hon P-carotene Vitamin E, gần ứng dụng astaxanthin dược phẩm nghiên cứu bảo vệ chống lão hóa oxy hóa tia ƯV viêm [6] Do đặc tính chống ung thư, chat carotenoid nàycũng tìm thấy ứng dụng để tăng cường phản ứng miễn dịch cải thiện tổn thương mơ, ngồi tác dụng điều trị bệnh tim mạch, tiêu đường, viêm loét dày tăng huyết áp [7] 1.3 Bã hèm mật rỉ (Condensed molasses solubles:CMS) Thành phần CMS bao gồm lượng nhỏ đường, chất hữu tro vô Lượng lớn CMS cùa nhà máy đường, ethanol thải môi trường nguy gây ô nhiễm môi trường nước; chất hữu hợp chất cùa cacbon nitơ, phốt-pho dề bị phân hủy vi sinh vật, gây mùi thối cho khơng khí nguồn nước Mặt khác, phần lớn chất rắn lơ lửng dạng vô cơ, thải môi trường có khả lắng tạo thành lóp dày đáy nguồn nước, phá hủy hệ sinh vật Các khí độc q trình phân hủy sè gây thiếu hụt oxy nước, tác động xấu đến hệ sinh thái 1.4 Các nghiên cứu nước Các nghiên cứu ngồi nước Astaxanthin xanthophyll carotenoid có hoạt tính chống oxy hóa mạnh, gấp 54 lần so với p- carotene, 14 lần so với vitamin E 65 lần so với vitamin c Khả vô hiệu oxy đơn phân tử mạnh vitamin E 550 lần, vitamin c 6000 lần [8] Chính the, astaxanthin ứng dụng nhiều chế phẩm bảo vệ sức khỏe như: tăng cường sức khỏe, giảm nguy mắc bệnh mạn tính, giảm nguy mắc bệnh ung thư, bệnh thần kinh, giảm nguy biến chứng bệnh tiểu đường, phụ hồi teo cơ, [9] Tảo Heamatococcus pluvỉalỉs xem nguồn cung cấp astaxanthin tự nhiên hiệu Hàm lượng astaxanthin so với trọng lượng khô chiếm khoảng 0,5 - 4,0% cao gấp 2-3 lần so với số loại vi tảo khác [5] Chính vậy, nghiên cứu yếu to ảnh hưởng đến khả tích lũy astaxanthin thực nhằm tìm mơi trường nuôi cấy tảo hiệu Nghiên cứu Mark Harker cộng rằng, yếu to dinh dưỡng vật lý có ảnh hưởng để khả tích lũy astaxanthin H.pluvỉalis Khi ni cấy tảo điều kiện khắc nghiệt như: thiếu nitơ, độ mặn cường độ ánh sáng cao kích thích tảo tạo lượng astaxanthin khác [1] Bên cạnh đó, việc giảm chi phí ni trồng quan trọng Một số nguồn carbon, nitơ “xanh” như: bã hèm mật rỉ, chất thải cồn từ nhà máy sử dụng ni cấy tảo nói chung tảo H.pluvialỉs nói riêng Mật độ tế bào tảo H.pluvialis nuôi điều kiện nồng độ chất thải sinh học 60% tăng khoảng 10,5% so với môi trường nuôi cay chuan M1B1 [10] Một nghiên cứu khác, sử dụng mật mía ni cấy tảo Chlorella zofingiensis đe sản xuất astaxanthin, kết cho thấy hàm lượng astaxanthin tăng 42,2% sinh khối tăng 29,3% nuôi cấy môi trường chứa 5g/L mật rỉ đường [11] Qua nghiên cứu cho thấy, nguồn carbon, nitơ cho hiệu cao suất, đồng thời vừa tiết kiệm chi phí vừa góp phần bảo vệ môi trường Các nghiên cứu nước Với giá trị sinh học cao tiềm kinh tế, tảo H.pỉuvỉalis quan tâm Việt Nam Các sản phẩm từ tảo nghiên cứu ứng dụng để làm thực phẩm, thức ăn chăn nuôi để tăng sản lượng chất lượng thủy hải sản có giá trị kinh tế cao Ví dụ ni cá hồi thức ăn có bồ sung H.pluvialis, chất lượng thịt cá hồi cải thiện rõ rệt, hàm lượng canxi DHA cao gấp 4,26 1,69 lần so với sử dụng cám nhập ngoại cám nước [12] Ngoài ra, nghiên cứu điều kiện ức chế đe tăng hàm lượng astaxanthin tăng trưởng nuôi cấy tảo H.pluvialis thực Trong điều kiện, ánh sáng nồng độ nitrat có ảnh hưởng mạnh đến khả sinh trưởng tích lũy astaxanthin H.pluvialis [13], [14], Mới gần đây, công nghệ nuôi cấy cố định hệ thống quang sinh học hai lớp màng theo phương ngang thiết lập tối ưu hóa điều kiện nuôi, kết cho thấy tăng sinh khối đạt tối đa 6,08 g/ngày/m2 với tỷ lệ astaxanthin đạt mức 1,75% lượng sinh khối khô tế bào việc thu hoạch tảo đơn giản hóa CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN củu 2.1 Đối tượng nghiên cứu Tảo Heamatococcus pluvỉaỉis ƯTEX2505 nuôi cấy Viện Kỳ thuật Công nghệ cao trường Đại học Nguyền Tất Thành Được nuôi cấy môi trường OHM điều kiện ánh sáng trắng cường độ 100 gmol/photon/m2/s chiếu sáng sục khí liên tục nhiệt độ 25°c±2 (Hình 2) Các vật liệu phưong pháp thực hiệu chình sửa đối trình thực đề tài Hình Tảo Haematococcus pluvialis sau hoạt hóa 2.2 Nội dung nghiên cứu: Khảo sát nồng độ CMS Mục đích: Chọn nồng độ CMS tối ưu để nuôi cấy tảo H.pluviaỉis đạt hàm lượng astaxanthin cao Trong nội dung nghiên cứu sử dụng bà hèm mật rỉ xử lý Công ty Huy Việt Tây Đô dạng chất lỏng sệt Thành phần CMS xác định bảng Lấy lượng tảo cho vào erlen 500 mL, bo sung dung dịch môi trường hấp vô trùng vừa đù đe đạt mật độ tế bào IxlO5 tế bào/mL Nuôi cấy ánh sáng trắng cường độ 100 |imol/photon/m2/s (với chu kỳ sáng: tối, 12 giờ: 12 giờ) ❖ Thí nghiệm bố trí với nghiệm thức sau: - Dung dịch CMS nồng độ 0,01% - Dung dịch CMS nồng độ 0,05% - Dung dịch CMS nồng độ 0,1% - Dung dịch CMS nồng độ 0,2% - Môi trường OHM Dinh dưỡng thông số môi trường yếu tố gây hình thành astaxanthin tế bào H pỉuvialis Khi ni cấy mơi trường OHM, tảo trì trạng thái xanh tăng trưởng mạnh thành phần dinh dường vi lượng môi trường nitrat bị cạn kiệt khiến phát trien trở nên hạn chế, tế bào bị ức chế tích lũy astaxanthin Trong nghiên cứu Mark Harker cộng đà rõ, giảm nong độ N p mơi trường ni cấy kích thích tảo tạo astaxanthin [1] Trong mơi trường CMS nồng độ N p thấp nhiều so với mơi trường OHM, tạo mơi trường khắc nghiệt làm tảo H.pluvialis kích thích tạo astaxanthin Nồng độ CMS thấp thời gian tảo chuyển dạng tích lũy astaxanthin ngắn 21 CHƯƠNG 4, KẾT LƯẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Ket luận Mơi trường CMS có ảnh hưởng đến sinh trưởng khả tích lũy astaxanthin tảo Haematococcus pluvialis Cụ thể, mật độ tế bào khối lượng khơ có xu hướng tăng tăng nong độ CMS từ 0,01 % lên 0,2% nhiên, so với mẫu đối chứng nuôi môi trường OHM suất sinh khối thấp hon nhiều Ngược lại, nồng độ CMS thấp tảo có xu hướng tạo asxanthin nhiều nhanh để tồn môi trường nghèo nàn chất dinh dường vi khoáng Dựa vào kết này, tùy vào mục tiêu nghiên cứu ta lựa chọn nồng độ CMS để nuôi cấy tảo Nếu muốn tăng sinh khối tảo sử dụng CMS nồng độ cao, mục tiêu dùng để ức chế thúc đẩy tạo astaxanthin lựa chọn nong độ CMS thấp 4.2 Kiến nghị Khảo sát yếu tố bổ sung thêm vào môi trường CMS 0,2% để tăng sinh khối, đồng thời ứng dụng nuôi cấy tảo Haematococcus pluvialis môi trường CMS 0,01% quy mô túi lớn 5L đánh giá hiệu gây ức chế tế bào đe tạo astaxanthin Chủ nhiệm đề tài (Ký ghi rõ họ tên) 22 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] M Harker, A J Tsavalos, and A J Young, "Factors responsible for astaxanthin formation in the Chiorophyte Haematococcus pluvialis," Bioresource Technology, vol 55, pp 207-214, 1996/03/01/ 1996 [2] T Gõksan, i Ak, and c Kihẹ, "Growth Characteristics of the Alga Haematococcus pluvialis Flotow as Affected by Nitrogen Source, Vitamin, Light and Aeration," Turkish Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, vol 11, pp 377-383,09/01 2011 [3] c Zhang, J Liu, and L Zhang, "Cell cycles and proliferation patterns in Haematococcus pluvialis," Chinese Journal of Oceanology and Limnology, vol 35, pp 1205-1211, 2017/09/01 2017 [4] K Chekanov, E Lobakova, I Selyakh, L Semenova, R Sidorov, and A Solovchenko, "Accumulation of Astaxanthin by a New Haematococcus pluvialis Strain BM1 from the White Sea Coastal Rocks (Russia)," Marine Drugs, vol 12, pp 4504-4520, 08/01 2014 [5] M Orosa, J F Valero, c Herrero, and J Abalde, "Comparison of the accumulation of astaxanthin in Haematococcus pluvialis and other green microalgae under N-starvation and high light conditions," Biotechnology Letters, vol 23, pp 1079-1085, 2001/07/01 2001 [6] T.-B Zou, Ọ Jia, H.-W Li, C.-X Wang, and H.-F Wu, "Response surface methodology for ultrasound-assisted extraction of astaxanthin from Haematococcuspluvialis," Marine drugs, vol 11, pp 1644-1655, 2013 [7] s Dong, Y Huang, R Zhang, s Wang, and L Yun, "Four Different Methods Comparison for Extraction of Astaxanthin from Green Alga Haematococcus pluvialis," TheScientificWorldJournal, vol 2014, p 694305, 01/19 2014 [8] J Igielska-Kalwat, J Goscianska, and I Nowak, "Carotenoids as natural antioxidants," Postẹpy higieny i medycyny doswiadczalnej (Online), vol 69, pp 418-28,01/02 2015 [9] M Sztretye, B Dienes, M Gonczi, T Czirjak, L Csemoch, L Dux, et al., "Astaxanthin: A Potential Mitochondrial-Targeted Antioxidant Treatment in 23 Diseases and with Aging," Oxidative medicine and cellular longevity, vol 2019, pp 3849692-3849692, 2019 [10] F Haque, A Dutta, M Thimmanagari, and Y w Chiang, "Intensified green production of astaxanthin from Haematococcus pluvialis" Food and Bioproducts Processing, vol 99, pp 1-11, 2016/07/01/ 2016 [11] J Liu, z Sun, Y Zhong, H Gerken, J Huang, and F Chen, "Utilization of cane molasses towards cost-saving astaxanthin production by a Chlorella zofingiensis mutant," Journal ofApplied Phycology, vol 25, 10/01 2013 [12] Lưu Thị Tâm, Lê Thị Thơm, Nguyền cẩm Hà, Lê Hà Thu, and Đ D Hồng, "BƯỚC ĐẦU NGHIÊN cứu ÚNG DỤNG SINH KHỐI TẢO Haematococcus pluvialis GIÀU ASTAXANTHIN LÀM THÚC ÀN Bố SUNG CHO CẢ HỒI VÂN VIỆT NAM " TẠP CHỈ SINH HỌC, vol 37, pp 470-478, 2015 [13] Đặng Diễm Hồng, Đinh Thị Ngọc Mai, Bùi Đình Lãm, Lưu Thị Tâm, Nguyễn Thị Thu Thủy, Nguyền cẩm Hà, et al., "ẢNH HƯỞNG KÉT HỢP CỦA NỒNG ĐỘ NITRATE VÀ CHẾ ĐỘ CHIẾU SÁNG LÊN SINH TRƯỞNG CỦA VI TẢO Haematococcus pluvỉaỉis," TẠP CHỈ SINH HỌC, vol 34, pp 493-499, 2013 [14] Trịnh Ngọc Nam, Trương Ngọc Bảo Trân, Huỳnh Thị Hiếu, Nguyễn Thị Duy Hiền, and T T B Liên, "NÂNG CAO TÍCH LŨY ASTAXANTHIN VI TẢO Haematococcus pluvialis BỞI CÁC ĐIÊU KIỆN STRESS CỦA MỊI TRƯỜNG NI CẤY," Tạp Khoa học công nghệ Thực phẩm, vol 13, pp 48-59, 2017 [15] B Nahidian, F Ghanati, M Shahbazi, and N Soltani, "Effect of nutrients on the growth and physiological features of newly isolated Haematococcus pluvialis TMU1," Bioresource Technology, vol 255, pp 229-237, 2018/05/01/ 2018 24 PHỤ LỤC 1: MINH CHÚNG ĐI KÈM SẢN PHÀM DẠNG (hình ảnh sản phấm đạt ) SẢN PHÀM DẠNG 2: (quy trình, sơ đồ, bảng vẽ, sở dừ liệu „) SẢN PHÀM DẠNG 3: (toàn văn báo, sách chuyên khảo ,) SẢN PHÀM ĐÀO TẠO: gồm hồ sơ sau - Quyết định hướng dần sinh viên (hoặc giấy xác nhận Ban chủ nhiệm Khoa) - Biên họp hội đồng luận văn sinh viên (có thể tên sinh viên, giảng viên hướng dần, tên đề tài, kết quả) 25 KHẦO SÁT ẢNH HƯỞNG BÃ HÈM MẶT RỈ LÊN sụ SINH TRƯỞNG VÀ KHẢ NĂNG TÍCH LŨY ASTAXANTHIN CỦA TẢO HAEMATOCOCCUS PLUVIALIS Nguyền Thị Bích Ngọc, Nguyền Lương Hiếu Hịa Trung tâm Nghiên cứu VK Tech, Viện Kĩ thuật Công nghệ cao, Đại học Nguyền Tất Thành ntbngoc@ntt.edu Tóm tắt Táo Haematococcus pluvialis nguồn astaxanthin tự nhiên phong phú Sự thay đoi yếu to dinh dưỡng mơi trường kích thích táo tạo astaxanthin Thi nghiêm sứ dụng bã hèm mật ri đường (CMS) làm môi trường nuôi cấy táo Ket thực nghiệm cho thấy, CMS ảnh hường lên sinh trướng tích lũy astaxanthin táo Heamatococcus pluvialis Khi tăng dần nồng độ CMS từ 0,01 % đen 0,20 %, khói lượng sinh khối khơi có xu hướng tăng dần từ 150,497 mg/L đen 192,689 mg/L Nong độ astaxanthin nuôi cấy CMS nồng độ thấp (0,01 %) cao 3,1 % (so với sinh khối khô) Nong độ CMS thấp thời gian táo tích lũy astaxanthin nhanh Từ khóa: Haematococcus pluvialis, astaxanthin, bã hèm mật rỉ đường, CMS Đặt vấn đe Tảo Heamatococcus pluvialis tào lục đơn bào, chu kỳ tế bào chia làm hai giai đoạn dựa hình thái sinh lý tế bào là: giai đoạn di động giai đoạn không di động Te bào H pluvialis giai đoạn di động có thành mỏng, hai roi yếu phát triển cách tăng sinh te bào Ngược lại, tế bào H pluvialis giai đoạn khơng di động có vách dày, khơng roi xảy q trình tích tụ astaxanthin [1] Hình Tê bào tào Haematococcus pluvialis Astaxanthin [(3S,3'S)-3,3'-dihydroxy-p,P-carotene-4,4'-dione] xanthophyll ketocarotenoid có đặc tính chống oxy hóa mạnh P-carọtene Vitamin E, gần ứng dụng cũa astaxanthin dựợc phấm nghiên cứu bảo vệ chống lão hóa oxy hóa cũa tia uv viêm [2], Do đặc tính chống ung thư, chat carotenoid nàycũng tìm thấy ứng dụng để tăng cường phán ứng miễn dịch cải thiện tốn thương mô, tác dụng điều trị bệnh tim mạch, tiếu đường, viêm loét dày tăng huyết áp [3] Tảo H.pluvialis nguôn astaxanthin tự nhiên dôi Hàm lượng astaxanthin tích lũy từ 0,5 - 4,0 % trọng lượng khô cùa H.pỉuvialis [4] cao nhiều so với so loại vi táo lục khác như: Neochloris vvimmeri, Protosiphon botryoides, Scotiellopsis oocystiformis, Chorella zojingiensis Scenedesmus vacuolatus (0,27 -1,92 % trọng lượng khô) [5] Hàm lượng astaxanthin tạo phụ thuộc nhiều vào điều kiện nuôi cấy Hầu hết tê bào vi tảo đêu tri trạng thái sinh dưỡng, tích lũy rât khơng tích lũy astaxanthin ni điêu kiện thích hợp Tuy nhiên, điều kiện stress, te bào chuyến sang dạng bào nang không chuyển động kích thích phù hợp tê bào tào tích lũy lượng lớn astaxanthin Vi vậy, điều kiện cho tế bào sinh trưởng tồng hợp astaxanthin khác Việc xác định rõ ràng pha sinh trường tế bào pha tong hợp astaxanthin cân thiêt đê đạt mật độ tê bào hàm lượng astaxanthin cao Trong u tơ vê dinh dưỡng môi trường quan trọng Sự thiếu hụt nitơ có cảm ứng đến q trình tạo astaxanthin [6], nhiên bố sung lượng nitơ cao gâp lân môi trường nuôi bàn RM thi mật độ tê bào táo đạt cao nhât Ngoài ra, photpho dư thừa acetate bo sung tiền chất carotenoit khác chứng minh có ảnh hường đến trình tạo astaxanthin [6], [7], Hiện nay, ngành công nghiệp sân xuất cồn cũa Việt Nam phát triền có nguồn nguyên liệu phong phú doi Bã hèm mật ri (Condensed molasses solubles:CMS) sản phẩm thừa cịn sau q trình lên men mật mía để sàn xuất ethanol CMS coi thuộc loại nước thải ô nhiễm nặng, hàm lượng hữu cao (ở dạng đậm đặc nước thãi có COD từ 50.000 mg/1 đến 100.000 rng/1), pH giá trị thấp (từ 4,2 đen 4,5), nhiệt độ cao (từ 75°c đen 85°C); mật ri thài 3m3 CMS Do đó, việc giảm thiếu nồng độ ô nh2iềm đạt tiêu chuẩn khó khăn, địi hỏi phải kết hợp nhiều phương pháp nhiều ban ngành Trước thực trạng yêu tô ánh hường nêu trên, sữ dụng bã hèm mật rĩ đê nuôi tào H.pỉuvialis nhăm sứ dụng đường protein khống chât CMS ngn dinh dưỡng thay thê cho tào sinh trưởng, tích lũy astaxanthin; từ xây dựng quỵ trinh nuôi tiêt kiệm hiệu vừa giãi quyêt vân đê vê xữ lý nước thái vừa có thêm ngn thức ăn cung câp cho thủy sàn phân bón cho nơng nghiệp Phuong pháp nghiên cứu Đoi tượng nghiên cứu Tảo Heamatococcus pluvialis UTEX2505 nuôi cấy Viện Kỹ thuật Công nghệ cao trường Đại học Nguyễn Tất Thành Được nuôi cấy môi trường OHM điều kiện ánh sáng trang cường độ 100 pmol/photon/m2/s chiếu sáng sục khí liên tục nhiệt độ 25°c±2 (Hình 2) Hình Tảo Haematococcus pluvialis sau hoạt hóa Trong nội dung nghiên cứu sừ dụng bã hèm mật ri xử lý Công ty Huy Việt Tây Đô dạng chất lóng sệt Thành phần cũa CMS xác định bàng Bâng Thảnh phân B —r — cũa CMS Chỉ tiêu STT Đon vị tính Ket kiếm nghiệm 10 11 12 13 14 15 16 17 As B Ca Cd Cu Fe Hg K2O Mg Mn P2O5 Pb Zn N Chat hữu 4-Hydroxyproline Acid amin mg/Kg mg/Kg mg/Kg mg/Kg mg/Kg mg/Kg mg/Kg mg/Kg mg/Kg mg/Kg mg/Kg mg/Kg mg/Kg % % g/100g g/100g 0,18 3,01 14300 Không phát (MDL=0,l) 2,06 1000 Không phát (MDL=0,01) 64094 8462 126 1696 Không phát (MDL=1) 14,5 1,66 53,6 Không phát (MDL=0,01) 2,69 Thiết kế thí nghiệm Haematococcus pluvialis đạt giai đoạn tăng trưởng sau khống 15 ngày ni mơi trường OHM sứ dụng đê bơ trí thí nghiệm Thí nghiệm sứ dụng bã hèm mật ri đường pha lỗng với nơng độ 0,01 %; 0,05 %, 0,10 %; 0,20 % làm môi trường nuôi cấy mầu đối chứng nuôi môi trường OHM, mật độ tế bào IxlO5 te bào/mL Tào nuôi cấy ánh sáng trang với cường độ chiếu sáng 100 pmol/photon/nr/s (với chu kỳ sáng: tôi, 12 giờ: 12 giờ) Đánh giá nghiệm thức qua chi tiêu vê: hình thái, trọng lượng khô tôc độ tăng trưởng đặc hiệu Quan sát tê bào băt đâu chuyên sang màu đò tiên hành định lượng astaxanthin Phương pháp nghiên cứu • Quan sát hình thái te bào H.pluviaỉis Hình thái tế bào H.pìuvialis quan sát bang kính hiển vi quang học với độ phóng đại lOOx sau ngày ni cay • Xác định trọng lượng khơ H.pluviaỉis Lấy 10 mL dịch nuôi cay tào lọc qua màng lọc, với đường kính màng 47 mm, đường kính lồ 20 prn Sau tâo rửa với 20 mL nước cất hấp vơ trịng, sấy khơ 103°C suốt tiếng cho đen trọng lượng khô khơng đổi (g) • Xác định mật độ tế bào tão Sừ dụng buồng đến hồng cầu, thêm lOpL dung dịch tảo vào mồi buồng đếm Đem ô lớn Mật độ tế bào tính theo cơng thức: N= 0,25a X106 tê bào/mL (a: sô tê bào trung binh đêm • Xác định tốc tăng trường đặc hiệu Trọng lượng khô tế bào hai thời điếm khác trình tăng trường mầu tào dùng đế tính tơc độ tăng trường đặc hiệu (p: g/L/ngày) khống thời gian theo cơng thức: In (Dry weight2 / Dry weighty \ -Ji Trong đó: Dry weight I, Dry weight 2: Trọng lượng khơ thời diêm ti, t2: thời diêm • Định lượng Astaxanthin Xây dựng đường chuân Astaxanthin Tách chiêt Astaxanthin: cân lOmg cho thêm 1mL HC1 4M, ũ 70°C phút Ly tâm 6000 vịng/5 phút, bó dịch Rữa lại cắn với nước cất hấp vô trùng lần, ly tâm lấy cắn Nghiền cho tơi cắn, cho mL aceton trộ đêu; đánh siêu âm 20 phút nhiệt độ lạnh Ly tâm thu dịch chiêt Lây dịch chiêt cho phàn ứng với enzyme Cholesterol esterase Định lượng astaxathin dung dịch chiêt sau phán ứng băng phương pháp HPLC Kết quà bàn luận 3.1 Hình thái tê bào tảo Haematocọccus Pluvialis Ket khảo sát cho thấy, nồng độ CMS mơi trường ni cấy có ãnh hưởng rõ ràng đến hình thái, màu sắc mật độ tế bào tào Khi nuôi cấy với CMS, màu sắc dịch te bào đậm so với mẫu đoi chứng nuôi môi trường OHM nồng độ CMS 0,01 % màu sắc te bào tào hầu hết chuyến sang màu đỏ kích thước tế bào lớn sau 03 ngày nuôi cấy Các điều kiện CMS 0,05 % 0,10 % tế bào dần chuyển sang màu đỏ sau 06 ngày ni cấy Bên cạnh đó, te bào tào trì màu xanh cho đen ngày ni cấy 18 bất đầu chuyển dần sang màu đỏ nuôi cấy mô trường CMS 0,20 % OHM (hình 7) Màu sắc dịch ni cấy có khác biệt rõ ràng, điều kiện môi trường OHM CMS 0,20 % màu sắc dung dịch đậm so với ban đầu Các điều kiện CMS 0,05 % 0,10 % màu sắc dung dịch nuôi cấy khơng có thay đối khác biệt, nhiên ỡ điều kiện 0,01 % màu sắc dịch nuôi cấy chuyến sang màu đị chi sau ngày ni cấy (hình 3) Ngày 10 Hình Dịch ni cấy tảo Haematococcus Pluvialis Nghiên cứu Mark Harker cộng chi ràng, yếu tố dinh dưỡng vật lý có ành hưởng đe khả tích lũy astaxanthin cùa H.pluviaỉis Trong đó, yếu tố dinh dưỡng môi trường nuôi cấy yếu to quan trọng Sự thiếu hụt nitơ có cảm úng đen trình tạo astaxanthin [6], điều kiện CMS 0,01 % hàm lượng dinh dưỡng thấp làm sinh trường tảo bị ức chế dần đến việc thay đối màu sắc cùa tế bào thời gian ngấn Ngược lại, môi trường giàu dinh dưỡng OHM nồng CMS cao nhiều dinh dưỡng kích thích tào tăng trường hàm lượng chất dinh dưỡng dung dịch nuôi cấy bị cạn kiệt tế bào dần chuyển sang màu đỏ 3.2 Sự tăng trưởng cũa tảo Haematococcuspluvialìs Kêt q thí nghiêm cho thấy, tảo H.pluvialis sinh trưởng mơi trường có CMS, nhiên hàm lượng chất khoáng thấp dần đến tăng trưởng cũa tảo thấp nhiều so với mẫu đối chứng mơi mơi trường OHM Nong độ CMS có ảnh hường lên tăng trưởng cũa quần tảo H.pluvialis Khi tăng dần nong độ CMS mật độ tê bào trọng lượng khô tăng tý lệ thuận theo Sau 12 ngày nuôi nông độ CMS 0,2 % tão cho mật độ cao 19,3 X104 tế bào/mL với trọng lượng khô 192,689 mg/L Ket quà thấp mầu đối chứng nuôi cấy mơi trường OHM có the giải thích điều kiện CMS hàm lượng chất khống thấp khơng cung cấp đũ chất dinh dưỡng đế tào sinh trường tăng sinh số lượng tê bào Thực nghiệm cho thấy, thời gian giai đoạn tăng trưởng tý lệ thuận với nông độ CMS Tôc độ tăng trưởng đặc hiệu nuôi điêu kiện CMS 0,1 % 0,06 mg/L/ngày cao không đáng kế so với điều kiện lại thấp lần so với mầu đoi chứng (hình 4-5-6, bàng 2) Trong thành phần cùa CMS có chứa chất dinh dưỡng (nitơ, phospho) vi lượng sắt (Fe) bo (B) yếu tố cần thiết cho sinh trưởng cũa vi tào H.pluvialis, tào có the sinh trưởng môi trường CMS môi trường nghèo nàn vê mặt dinh dưỡng Theo nghiên cứu cúa Bahareh Nahidian cộng cho thấy, N p cần thiết cho trình phân chia tế bào hai yếu tố quan trọng cho tống hợp thành tế bào Khi giám nồng độ N xuống 50 % so với lượng N ban đầu môi trương BBM, không ảnh hường đáng kế đen phát triển tế bào; tăng nồng độ N lên gấp - lần làm tăng ti lệ tăng trưởng tào lân lượt 86 % 14 % [8] Trong thí nghiệm này, sử dụng CMS đê nuôi cho thây mật độ tế bào khối lượng khối khô cùa tảo không ảnh hưởng đáng kế nong độ N p thấp Mặt khác, tào H pluvialis môi môi trường giàu dinh dưỡng OHM có mật độ tê bào tăng liên tục cao rât nhiêu so với môi trường CMS Tôc độ tăng trưởng cùa tảo Haemetococcus pluvialis tăng tăng nồng độ Fe3+ Fe xúc tác oxy hóa khứ hệ thống quang hợp tào đồng hóa phân tử NADPH lượng cao [8], Kêt thực nghiệm cùa đê tài có xu hướng giơng với nghiên cứu cùa Bahareh Nahidian Hỉnh Trọng lượng khô tảo Haematococcus pluvialis điều kiện ni cấy Hình Mật độ tế bào tào điều kiện nuôi cấy khác Hình Tốc độ tăng trưởng đặc hiệu cũa tào Bâng Khối lượng sinh khối khô Haematococcus pluvialis điều kiện nuôi cấy Điều kiện vế nồng độ CMS (%) 0,01 0,05 0,1 0,2 OHM 99,667± 0,333 99,667± 0,333 99,667± 99,667± 99,667± la la 0,333 la 0,333 la 0,333 la 133,221± 144,517± 149,500± 2,877 lb 5,754 l2bc 2,1792bc 147,174+ 2,075 l2b 262,123± 1.9583b 141,859± 156,144± 165,779± 0,879 lc 1.448 lcd 0,332 2c 177,074± 0,575 3c 408,966± 4,395 4c 150,497± 162,789 ± 150,164 ± 4,395 l2d 0,575 2d 0,332 lbc 186,044± 1,661 3cd 1127,064± 3,469 4d 146,178± 147,839 ± 153,819± 192,689± 0,332 2d 1,661 lbc 3,469 l2bc 3,3223c 1282,378± 0,575 46 139,866± 146,676± 149,666 ± 0,439 lc 1,163 lbc 1,297 lbc 189,034± 0,3322de 1249,156± 1,602 3ed Ngxày 18 133,553± 0,575 lb 145,513± 3,045 2bc 151,493± 1,151 2bc 185,380± 3,045 3cd 1259,122± 2,8774cd Ngày 21 131,228± 1,758 lb 140,862± 0,879 lb 139,533± 5,754 lb 179,400+ 5,7542cd 1249,156± 3,045 3ed 131,560± 148,503± 136,211± 2,302 lb 2,075 lbc 8,790 lb 183,387± 3,045 2cd 1252,478± 3,322 3ed Ngày «2 Ngày a "õì S Ngày Ngày