PHẦN III: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2 Các phương pháp nghiên cứu thực hiện
Phân lập
Cấy truyền
QUẢ THỂ
GIỐNG CẤP 1 (Môi trường thạch)
GIỐNG CẤP 2 (Môi trường lỏng)
Khảo sát tối ưu hàm lượng Nitơ từ dịch
truyền đạm
Aminoplasmal bổ sung vào môi trường rắn đến sự hình thành và phát triển quả thể nấm Cordyceps militaris.
HỘP
(Môi trường rắn)
Khảo sát ảnh hưởng của dịch truyền đạm Aminoplasnal đến sự tăng sinh của hệ sợi nấm Cordyceps militaris.
Khảo sát sự kết hợp từ
dịch truyền
Aminoplasmal và nhộng khô bổ sung vào môi trường rắn đến sự hình thành và phát triển quả thể nấm Cordyceps militaris.
Khảo sát sự kết hợp từ dịch truyền Aminoplasmal và bột đậu nành bổ sung vào môi trường rắn đến sự hình thành và phát triển quả thể nấm Cordyceps militaris.
TN1
3.2.1 Phương pháp chuẩn bị môi trường nuôi cấy
Мôi trường thạch dinh dưỡng PDA (Potato D-glucose Agar) Thành phần: Khoai tây(*)
D – glucose Agar
Nước cất vừa đủ: 1000 (ml) pH: 6.0 - 6.5
Мôi trường giống lỏng:
Thành phần:
Khoai tây(*) D-glucose Cao nấm men KH2PO4
MgSO4.7H2O Vitamin B1
Nguồn bổ sung Nitơ
(Pepton, bột đậu nành, dịch truyền đạm) Nước cất vừa đủ: 1000 (ml)
pH: 6.0 - 6.5 Мôi trường giá thể:
Thành phần:
Gạo lứt Khoai tây(*) D-glucose Saccarozo KH2PO4 MgSO4.7H2O Vitamin B1
Bột đậu nành: Khảo sát
Dịch truyền đạm Aminoplasmal: Khảo sát Nhộng khô: Khảo sát
Khảo sát
Nước cất vừa đủ: 1000 (ml) pH: 6.0 - 6.5
(*)Khoai tây: Chọn những củ không nảy mầm, rửa sạch, gọt vỏ, dùng dao cắt nhỏ, cho vào nồi, bổ sung 1000 ml nước cất, đun sôi từ 15 – 20 phút, lọc thu dịch chiết, bổ sung các chất dinh dưỡng rồi định mức lên 1000 ml. Ðối với môi trường bổ sung khoáng cần chỉnh pH về 6.0 – 6.5 bằng dd NaOH 0.05N. Môi trường được hấp khử trùng ở 121oC, 1atm trong 30 phút. Kiểm nhiễm sau 24h và tiến hành cấy
3.2.2 Phương pháp Sorensen
Cho vào bình nón 20ml dung dịch chứa axit amin và 0,5ml dung dịch phenolphtalein 1%. Ðể trung hòa dung dịch axit amin, cho từng giọt NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu vàng nhạt. Cho thêm 20ml dung dịch fomanđehit 30% đã trung hòa và lắc đều bình nón. Sau 5 phút dung dịch mất màu. Chuẩn độ bằng NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu vàng nhạt trở lại (pH = 9,0). Thí nghiệm kiểm tra cũng được tiến hành tương tự với các hoá chất trên nhưng thay dung dịch chứa axit amin bằng nước cất cùng thể tích.
Xác định hàm lượng (mg) acid amin trong mẫu
1 ml dung dịch NaOH 0,1N tương đương l, 4 mg nitơ. Số mg nitơ amin của dung dịch nghiên cứu được tính theo công thức:
mgN = (A - B) x 1, 4
Trong đó: A – Số ml NaOH 0, 1N dùng để chuẩn độ bình thí nghiệm B – Số ml NaOH 0, 1N dùng để chuẩn độ bình kiểm tra 3.2.3 Phương pháp thu chỉ tiêu trọng lượng quả thể nấm cordyceps militaris Cân trọng lượng tươi trong từng hộp: Cân khối lượng đĩa nhựa М1, cắt quả thể nấm sát đế rồi bỏ lên đĩa nhựa đem đi cân М2.
М0: Khối lượng tươi М1: Khối lượng đĩa nhựa
М2: Khối lượng cả nấm lẫn đĩa
M0=M2- M1
Cân trọng lượng khô trong từng hộp: Lấy khối lượng tươi М0 của từng hộp mang đi sấy ở 40oC trong 24h đến 2 lần cân liên tiếp có khối lượng không đổi.
3.2.4 Phương pháp đo năng suất sinh học BE%
Năng suất sinh học BE tính theo phương pháp
BE= ố ượ ả ể ươ
ố ượ ơ ấ ∗ 100
3.2.5 Phương pháp cân sinh khối:
Sử dụng phương pháp cân sinh khối, được thực hiện như sau: Cắt những miếng giấy lọc có kích thước bằng nhau, ghi số theo từng nghiệm thức và theo mỗi lần lặp lại, cho sấy cùng một lúc với nhiệt độ là 100oC, cứ 15p đem ra cân một lần, sấy tới khi 2 lần cân liên tiếp có khối lượng không thay đổi thì dừng lại.
Hút lượng dung dịch môi trường (lắc đều) cần khảo sát với thể tích bằng nhau từ các nghiệm thức trong thí nghiệm lọc qua giấy lọc trên phễu, sau khi lọc xong hết tất cả, đem sấy cùng một lúc với nhiệt độ 100oC, cứ sau 15p đem cân một lần, sấy tới khi 2 lần cân liên tiếp có khối lượng không thay đổi thì dừng lại, lúc này khối lượng sinh khối đã đạt được khối lượng không đổi.
Dùng cân phân tích 4 số để cho kết quả chính xác, cân lần lượt từng mẫu giấy chứa sinh khối đã sấy khô và ghi lại kết quả.
Sau khi thu được kết quả hoàn chỉnh ta dùng công thức này để tính được khối lượng sinh khối cần khảo sát:
Khối lượng sinh khối của sợi tơ nấm ( Gram) = M2 – M1
Trong đó:
M1: khối lượng giấy ban đầu sau khi sấy ( Gram).
M2: Khối lượng giấy chứa sinh khối sau khi sấy ( Gram).
3.2.6 Phương pháp xử lý số liệu
Kết quả được xử lý thống kê trên phần mềm Stagraphis plus 3.0 và Excel.