Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số (2017) 12-18 Sàng lọc hợp chất có tác dụng ức chế enzym tyrosinase phương pháp in silico - in vitro Phạm Thế Hải1,*, Ninh Bảo Yến1, Đỗ Thị Nguyệt Quế1, Lê Thị Thu Hường2, Nguyễn Thị Hương Giang2, Vũ Đức Lợi2, Bùi Thanh Tùng2 Đại học Dược Hà Nội, 13-15 Lê Thánh Tông, Hà Nội, Việt Nam Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, 144 Xuân Thủy, Cầu Giấy, Hà Nội, Việt Nam Nhận ngày 27 tháng năm 2016 Chỉnh sửa ngày 20 tháng năm 2016; Chấp nhận đăng ngày 10 tháng năm 2017 Tóm tắt: Tyrosinase đích phân tử quan trọng tham gia vào q trình hình thành sắc tố melanin Ức chế enzym tyrosinase làm hạn chế việc sản sinh nhiều sắc tố melanin từ giúp điều trị rối loạn liên quan đến tăng sắc tố da Nghiên cứu tìm kiếm hoạt chất có tác dụng ức chế enzym có ý nghĩa lớn khoa học y dược mỹ phẩm Trong nghiên cứu tích hợp phương pháp tính tốn lý thuyết (in silico) thực nghiệm in vitro nhằm tìm kiếm hợp chất có tác dụng ức chế tyrosinase từ sở liệu hóa học Spectrum Collection Cụ thể, sau sàng lọc in silico tìm được19 hợp chất dự đốn có tác dụng ức chế tyrosinase Dựa kết này, hợp chất hóa học bao gồm dibenzoylmethan, 2,2’,4’-trihydroxychalcon, 3,4dimethoxycinnamic acid acetosyringon lựa chọn nhằm sàng lọc đánh giá tác dụng ức chế tyrosinase in vitro Kết thu 3,4-dimethoxycinnamic acid có hoạt tính mạnh ức chế tyrosinase theo chế không cạnh tranh Từ khóa: Tyrosinase; in silico; in vitro; QSAR; Docking phân tử Đặt vấn đề * ức chế tyrosinase mối quan tâm ngành công nghệ dược phẩm hóa mỹ phẩm Việc nghiên cứu phát triển thuốc ức chế tyrosinase quy trình tốn thời gian tiền bạc, nhiên tỷ lệ thất bại lại tương đối cao Do đó, nghiên cứu chúng tơi ứng dụng phương pháp tính tốn mơ phân tử (gọi tắt phương pháp in silico) để sàng lọc hợp chất ức chế tyrosinase nhằm giảm thiểu chi phí thời gian tìm kiếm hợp chất tiềm ức chế tyrosinase có nguồn gốc tự nhiên tổng hợp hoá dược Dựa kết sàng lọc phương pháp in silico, áp dụng phương pháp đo quang đĩa 96 giếng để đánh giá tác dụng Các vấn đề sắc tố da thường gây nhiều áp lực mặt thẩm mỹ, đặc biệt phụ nữ Ở châu Á, hàng năm tiêu tốn hàng tỷ USD cho sản phẩm làm sáng da (làm giảm đốm nắng, tàn nhang hay làm mờ vết nám) Hiện nhiều sản phẩm làm sáng da, chống nám sử dụng hoạt chất chất ức chế enzym tyrosinase Tuy nhiên hoạt chất ức chế enzym tyrosinase hydroquinon arbutin lại có vấn đề an tồn tính hiệu [1, 2] Chính tìm kiếm hợp chất _ * Tác giả liên hệ ĐT.: 84-4-39330531 Email: hpham.phd@gmail.com https://doi.org/10.25073/2588-1132/vnumps.4065 12 P.T Hải nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số (2017) 12-18 xác định chế ức chế tyrosinase số hợp chất tiềm Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Nguyên liệu Cơ sở liệu Spectrum Collection bao gồm 2560 hợp chất có hoạt tính sinh học nhóm nghiên cứu viên MicroSource Discovery Systems Inc thu thập công bố (http://www.msdiscovery.com/index.html) Thành phần sở liệu bao gồm: Các thuốc sử dụng (khoảng 60%) phần lớn thuốc có nguồn gốc tổng hợp bán tổng hợp (khoảng 5% có nguồn gốc tự nhiên); hợp chất có nguồn gốc tự nhiên (khoảng 25%) hay hợp chất chuyển hóa thứ cấp phân lập xác định cấu trúc (khoảng15%) 2.2 Hóa chất thuốc thử Enzym tyrosinase (5771 U/mg), chất Ltyrosin, hydroquinon (Sigma Aldrich) Hóa chất để pha dung dịch đệm kali phosphat: kali dihydro phosphat; dikali hydro phosphat, kali hydroxyd (Sigma Aldrich) Chất thử dibenzoylmethan; 2,2’,4’-trihydroxychalcon; acid 3,4-dimethoxycinnamic; acetosyringon (Sigma Aldrich) Dung môi dimethylsulfoxide (DMSO) (Sigma Aldrich) 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Sàng lọc hợp chất ức chế tyrosinase sử dụng mô hình in silico Chúng tơi định hướng phát triển hệ thống sàng lọc ảo theo bước giống hình Hệ h 13 thống bao gồm nhiều phễu lọc cho phép sàng lọc sở liệu lớn (hàng nghìn hợp chất) nhằm ưu tiên tập hợp nhỏ hợp chất tiến hành thí nghiệm in vitro Đầu tiên, tính tốn tham số phân tử đặc trưng cho cấu trúc phân tử hợp chất cho phễu lọc Ở phễu lọc giống thuốc druglinkess, tham số phân tử khối lượng phân tử (MW), hệ số phân bố dầu/nước (LogP), số nguyên tử cho liên kết hydro (nHBDon), nhận liên kết hydro (nHBAc) số liên kết quay (nRotB) tính tốn Sau đó, hợp chất thỏa mãn tính chất này: MW≤ 500 g/mol, LogP≤ 5, nHBDon≤ 5, nHBAc≤ 10 nRotB ≤ 10 giữ lại cho phễu lọc Tiếp theo hợp chất trải qua phễu lọc tìm kiếm tương đồng với hợp chất ức chế mạnh tyrosianse Các hợp chất lựa chọn có hoạt tính mạnh sử dụng tìm kiếm cấu trúc tương đồng trình bày bảng Các hợp chất nằm dãy (sau xếp) giữ lại cho phễu lọc Sau đó, hợp chất dự đốn khả ức chế tyrosinase hợp chất dự đoán có khả ức chế tyrosinase dự đoán khả ức chế (độ mạnh yếu) sử dụng hệ thống phân loại kết hợp mơ hình QSAR công bố trước [3] Các hợp chất xác định có khả ức chế mạnh tyrosinase giữ lại tiến hành nghiên cứu Docking để đánh giá mức độ tương tác lực liên kết với enzym Quy trình tiến hành phần mềm ICM 3.8 (Molsoft LCC.) dựa nghiên cứu Senol et al [4] Hình Mơ hệ thống sàng lọc in silico lựa chọn hợp chất ức chế enzym tyrosinase 14 P.T Hải nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số (2017) 12-18 Bảng Danh sách hợp chất có hoạt tính mạnh sử dụng tìm kiếm cấu trúc tương đồng STT Tên hợp chất Acid kojic L-mimosin L-Tropolon N-cyclopenthyl-N-nitrosohydroxyl-amin Kurarinon Phenyl-thiourea STT 10 11 12 Tên hợp chất 8’-epi-cleomiscosin A 4-prenyloxy-resveratrol Alkyl-thiocarbamat E 3-Hydroxy-4-methoxy benzaldehyd thiosemicarbazon Benzylbenzamid Acid methyl ester ofgentisic g 2.3.2 Đánh giá tác dụng ức chế tyrosinase in vitro số hợp chất sàng lọc mơ hình in silico * Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế tyrosinase in vitro Tác dụng ức chế enzym tyrosinase in vitro đánh giá theo phương pháp Mashuda cộng với số thay đổi nhỏ [5] Các bươc tiến hành sau: Chuẩn bị mẫu thử: Các hợp chất hòa tan dung dịch DMSO để dung dịch gốc có nồng độ 10mM Dung dịch gốc tiếp tục pha loãng đệm kali phosphat thành dung dịch có nồng độ 50μM; 100μM 500μM để thực phản ứng ức chế enzym Đánh giá tác dụng ức chế enzym tyrosinase in vitro đĩa UV 96 giếng đáy phẳng Costar 3596 (Corning, Mỹ), tiến hành đo độ hấp thụ 490nm hệ thống máy đọc ELISA kèm theo ủ ấm (xMark, Bio-Rad) Chất chứng dương sử dụng hydroquinon Hỗn hợp phản ứng gồm: 30μl dung dịch đệm kaliphosphat; 50μl dung dịch chất Ltyrosin 2mM; 20μl dung dịch mẫu thử nồng độ khác Sau ủ đĩa 96 giếng máy ủ elisa vòng 3-5 phút nhiệt độ 370C bổ sung 100μl dung dịch enzym tyrosinase 100U/ml (pha dung dịch đệm kali phosphat 0,1M trước sử dụng) lắc 30 giây máy elisa Cuối ủ đĩa 96 giếng vòng 30 phút nhiệt độ 370C tiến hành đo quang bước sóng 490nm Mẫu chứng có thành phần tương tự mẫu thử dung dịch mẫu thử thay dung dịch đệm kali phosphat Song song với mẫu chứng mẫu thử ta làm mẫu trẵng chứng trắng thử 100μl dung dịch enzym tyrosinase 100U/ml thay 100μl dung dịch đệm kali phosphat Phần trăm ức chế enzym tyrosinase tính theo cơng thức sau: 0 Inhibition 100 (C D) 10 A B Trong (A: mật độ quang trung bình mẫu chứng; B: mật độ quang trung bình mẫu trắng chứng; C: mật độ quang trung bình mẫu thử; D: mật độ quang trung bình mẫu trắng thử) * Phương pháp xác định chế ức chế tyrosinase hợp chất tiềm Ta tiến hành xác định sơ chế tác dụng hoạt chất tiềm dựa việc xây dựng đồ thị Lineweaver - Burk với nồng độ chất thay đổi [5] Thí nghiệm tiến hành phần phương pháp đánh giá tác dụng ức chế tyrosinase in vitro nồng độ chất thay đổi từ 100μM - 500μM Từ kết đo mật độ quang mẫu thử mẫu chứng nồng độ chất khác ta vẽ đồ thị thể quan hệ nồng độ chất tốc độ phản ứng (tốc độ phản ứng thể thông qua mật độ quang) Dựa vào điểm giao đồ thị đường thẳng thể quan hệ nồng độ chất tốc độ phản ứng có mặt khơng có mặt chất ức chế để kết luận chất thử ức chế tyrosinase theo chế Lehninger Michael xác định có bốn chế ức chế tyrosinase là: cạnh tranh, không cạnh tranh, chế hỗn hợp hỗn hơp không cạnh tranh (non-competitive inhibitor) [6] * Xử lý kết Số liệu lưu trữ xử lý phần mềm Microsoft Office Excel 2007 phần mềm SPSS 20.0 Số liệu biểu diễn dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn P.T Hải nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số (2017) 12-18 (Xtb ± SD) So sánh giá trị trung bình mẫu one-way ANOVA với test hậu kiểm Dunnet để so sánh giá trị trung bình mẫu Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê p< 0,05 Kết bàn luận 3.1 Sàng lọc hoạt chất có tác dụng ức chế tyrosinase mơ hình in silico Tiến hành sàng lọc sở Spectrum Collection qua qua phễu lọc thứ thu 15 1394 hợp chất có đặc điểm giống thuốc, qua phễu lọc tìm kiếm hợp chất có cấu trúc tương đồng với chất có hoạt tính ức chế tyrosinase biết thu 109 hợp chất Áp dụng mơ hình QSAR để sàng lọc 109 hợp chất qua phễu lọc tìm kiếm đồng dạng thu 25 hợp chất dự đốn có hoạt tính ức chế tyrosinase mạnh Tiến hành docking phân tử 25 hợp chất thu 19 hợp chất có khả gắn kết với trung tâm hoạt động tyrosinase Danh sách 19 hợp chất liệt kê bảng Bảng Kết sàng lọc in silico sở liệu Spectrum Collection STT g Hợp chất Acid ferulic Naproxol Acid 3,4-Dimethoxy-cinnamic Dalbergion Dibenzoylmethan Obtusaquinon 2,2',4'-Trihydroxychalcon STT 10 11 12 13 14 Từ hợp chất sàng lọc kết docking 19 hợp chất dự đốn có tác dụng ức chế mạnh tyrosinase có lực liên kết với trung tâm hoạt động (ΔG, kCal/mol) enzym, hợp chất dự đoán có tác dụng ức chế tyrosinase mạnh có lực liên kết với enzym cao là: acid 3,4-dimethoxycinnamic l Hợp chất Nilutamid Rockogenin Dipyrocetyl Acetosyringon Diplosalsalat Atranorin Acid arjunolic STT 15 16 17 18 19 Hợp chất Culmorin 4,4’-Dimethoxy dalbergion Acid kainic Troglitazon Dicamba (ΔG = -6.7 kCal/mol), 2,2',4'-trihydroxychalcon (ΔG = -8.1 kCal/mol), acetosyringon (ΔG = 7.9 kCal/mol) dibenzoylmethan (ΔG = -8.2 kCal/mol) chọn để tiến hành đánh giá tác dụng ức chế tyrosinase in vitro Hình biểu diến cấu dạng 3D hợp chất trung tâm hoạt động tyrosinase Hình Tương tác hợp chất sàng lọc với acid amin trung tâm hoạt động tyrosinase 16 P.T Hải nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số (2017) 12-18 Nhìn chung bốn hợp chất dự đốn có hoạt tính mạnh, có lực liên kết tốt với đích phân tử Phân tích kết docking (Hình 2) cho thấy bốn hợp chất có khả sâu vào khoang gắn kết tạo phức chelat với ion Cu2+ nằm sâu trung tâm hoạt động enzym Đây xem chế quan trọng gây ức chế hoạt động tyrosinase [7] Bên cạnh đó, hợp chất tương tác mạnh với enzym thông qua nhiều liên kết hydro với acid amin His61, His259, His263 His296 đáy khoang, đồng thời tương tác kỵ nước (π-π, π-alkyl) với acid amin Phe264, Val283, Met280 Ala286 miệng khoang Như vậy, xét mức độ phân tử, hợp chất có cấu dạng hoàn toàn phù hợp ổn định trung tâm hoạt động tyrosinase dự đoán ức chế enzym theo chế cạnh tranh 3.2 Đánh giá tác dụng ức chế tyrosinase in vitro số hợp chất sàng lọc mơ hình in silico 3.2.1 Kết đánh giá tác dụng ức chế tyrosinase in vitro Mỗi hợp chất tiến hành đánh giá tác dụng ức chế tyrosinase nồng độ khác nhau: 50μM; 100μM 500μM Mỗi nồng độ tiến hành thử giếng Thí nghiệm lặp lại lần Kết trình bày bảng 3.2 Theo đó, nồng độ 50μM có acid 3,4dimethoxycinnamic thể tác dụng ức chế tyrosinase với % ức chế 13,3% nhiên tác dụng ức chế không mạnh (0,01 < p < 0,05) Những hợp chất cịn lại khơng thể tác dụng ức chế tyrosinase tác dụng ức chế yếu Ở nồng độ 100μM dibenzoylmethan 2,2’,4’-trihydroxychalcon tác dụng ức chế tyrosinase (p > 0,05) Hợp chất acetosyringon acid 3,4- dimethoxycinnamic thể tác dụng ức chế tyrosinase với % ức chế 15,36% 32,33% Ở nồng độ 500μM hoạt chất dibenzoylmethan có tượng kết tủa lại pha loãng với dung dịch đệm từ dung dịch gốc DMSO (có thể dibenzoylmethan nồng độ cao khơng tan đệm kali phosphat) Chính khơng đánh giá tác dụng ức chế dibenzoylmethan nồng độ Các hợp chất 2,2’,4’-trihydroxychalcon; acetosyringon; acid 3,4-dimethoxycinnamic lại thể tác dụng ức chế tyrosinase với % ức chế tương ứng 29,72%; 59,82% 96,74% (p < 0,01) Bảng Kết sàng lọc hoạt tính ức chế tyrosinase in vitro hợp chất chọn Nồng độ 500μM I (%) Nồng độ 100μM I (%) Nồng độ 50μM I (%) STT Các lô Chứng dương - - 0,191 97,8 ± 1,7 0,196 96,1 ± 2,7 Dibenzoylmethan - - 0,185 3,4 ± 2,1 0,196 - 2,2’,4’trihydroxychalcon 0,133** 29,7 ± 4,0 0,178 6,8 ± 2,0 0,192 2,0 ± 1,7 Acetosyringon 0,076** 59,8 ± 3,7 0,162** 15,4 ± 3,8 0,183 6,4 ± 2,7 Acid 3,4dimethoxycinnamic 0,006** 96,7 ± 2,3 0,129** 32,3 ± 3,6 0,170* OD OD OD 13,3 ± 3,0 Ghi chú: *: p