VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 35, No (2019) 12-18 Original Article Study on α-glucosidase enzyme inhibitory activity and DPPH free radical scavenging of green coffee bean extract (Coffea canephora) Dang Kim Thu1, Vu Manh Hung2, Nguyen Thi Trang1, Bui Thanh Tung1,* VNU School of Medicine and Pharmacy, 144 Xuan Thuy, Cau Giay, Hanoi, Vietnam Buon Ma Thuot University, 298, Ha Huy Tap, Tan An District, Buon Ma Thuot City, Dak Lak Received 07 October 2019 Revised 10 October 2019; Accepted 16 October 2019 Abstract: α-glucosidase enzyme is one of the important molecular targets in the treatment of diabetes In addition, free radicals are the cause of insulin resistance, damage β- cell pancreatic, glucose uptake disorders and induced diabetes In this study we evaluated the inhibitory effect of αglucosidase enzyme and antioxidant effect by using DPPH free radical scavenging method of green coffee bean extract (Coffea canephora) and its fractions Coffee beans were pulverized, extracted with ethanol 70% by sonications, and fractionated with n-hexane, ethyl acetate (EtOAc) and nbutanol (n-BuOH) solvents Our results showed that coffee bean extract has a strong α-glucosidase enzyme inhibitory activity, especially EtOAc fraction with an IC50 value of 2.21 ± 0.04 µg/mL Furthermore, the coffee bean extract has an antioxidant effect by DPPH radical scavenging ability, and EtOAc fraction has the highest effect with an IC50 value of 25.69 ± 3.08 µg/ml Our results show that green coffee beans and EtOAc fraction have potential effect in preventing and supporting for the treatment of diabetes Keywords: Coffee; Coffea canephora; free radical; α-glucosidase; DPPH Corresponding author Email address: tungasia82@gmail.com https://doi.org/10.25073/2588-1132/vnumps.4180 12 VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 35, No (2019) 12-18 Nghiên cứu tác dụng ức chế enzym α-glucosidase quét gốc tự DPPH cao chiết hạt cà phê xanh (Coffea canephora) Đặng Kim Thu1, Vũ Mạnh Hùng2, Nguyễn Thị Trang1, Bùi Thanh Tùng1,* Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, 144 Xuân Thủy, Cầu Giấy, Hà Nội, Việt Nam Trường Đại học Buôn Ma Thuột, Số 298, Hà Huy Tập, Phường Tân An, TP Buôn Ma Thuột, Đắk Lắk Nhận ngày 07 tháng 10 năm 2019 Chỉnh sửa ngày 10 tháng 10 năm 2019; Chấp nhận đăng ngày 16 tháng 10 năm 2019 Tóm tắt: Enzym α-glucosidase đích phân tử quan trọng điều trị bệnh đái tháo đường Ngoài ra, gốc tự nguyên nhân gây kháng insulin, tổn thương tế bào β tuyến tụy, rối loạn hấp thu glucose bệnh đái tháo đường Trong nghiên cứu đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase tác dụng chống oxi hóa thơng qua khả qt gốc tự DPPH cao chiết hạt cà phê xanh (Coffea canephora) phân đoạn Hạt cà phê nghiền nhỏ, chiết siêu âm ethanol 70% tiến hành phân đoạn với n-hexane, ethyl acetate (EtOAc) n-butanol (n-BuOH) Kết cho thấy cao chiết hạt cà phê có tác dung ức chế enzym α-glucosidase mạnh, đặc biệt phân đoạn EtOAc với giá trị IC50 2,21 ± 0,04 µg/mL Ngồi ra, cao chiết hạt cà phê có tác dụng chống oxy hóa thơng qua khả qt gốc tự DPPH phân đoạn EtOAc có tác dụng cao với giá trị IC50 25,69 ± 3,08 µg/ml Kết nghiên cứu cho thấy hạt cà phê xanh phân đoạn EtOAc có tiềm việc phòng ngừa hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường Từ khóa: Cà phê; Coffea canephora; gốc tự do; α-glucosidase; DPPH; Đặt vấn đề máu, thận, mắt, thần kinh Đến năm 2017, theo ước tính Liên đồn Đái tháo đường Quốc tế có khoảng 425 triệu người độ tuổi từ 20 đến 79 tuổi mắc bệnh toàn giới, tiếp tục tăng lên dự kiến đạt 629 triệu người trưởng thành mắc bệnh vào năm 2045 Ở Việt Nam, có khoảng 3,53 triệu người chung sống với đái tháo đường, chiếm 5,5% dân Đái tháo đường bệnh rối loạn chuyển hóa, có đặc điểm tăng glucose huyết thiếu insulin insulin bị kháng, hai Tăng glucose mạn tính gây nên rối loạn chuyển hóa carbohydrat, protid, lipid, gây tổn thương nhiều quan khác nhau, đặc biệt tim mạch Tác giả liên hệ Địa email: tungasia82@gmail.com https://doi.org/10.25073/2588-1132/vnumps.4180 13 14 D.K Thu et al / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 35, No (2019) 12-18 số nước [1] Enzym α-glucosidase enzym tham gia bước cuối q trình chuyển hóa carbohydrate Ức chế enzym αglucosidase làm chậm hình thành glucose từ carbohydrate, làm giảm hấp thu glucose máu sau ăn Acarbose, miglitol voglibose chất ức chế α-glucosidase sử dụng nay, chúng lại gây tác dụng phụ đường tiêu hóa Hơn nữa, oxy hóa stress có vai trị quan trọng việc phát triển biến chứng bệnh đái tháo đường [2] Do đó, ức chế enzym α-glucosidase chống oxy hóa stress phương pháp để phòng ngừa hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường Chi cà phê, thuộc họ Rubiaceae, có 124 lồi, loài Coffea arabica, Coffea canephora and Coffea liberica ba loài thường sử dụng đồ uống [3] Cà phê trồng 50 quốc gia giới, đứng đầu sản lượng xuất Brasil, Việt Nam, Indonesia Colombia Các hoạt chất cà phê caffeine, axit chlorogen, lipid, sucrose, chất béo protein, axit chlorogen caffeine chịu trách nhiệm cho vị đắng cà phê Cà phê có tác dụng ngăn chặn q trình tổn thương tế bào bệnh tim mạch, ung thư q trình lão hóa, ngăn ngừa bệnh huyết áp tim mạch; tăng trình trao đổi chất; giảm nguy đái thao đường type [4] Tai Việt Nam, chưa có nghiên cứu tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase chống oxi hóa cà phê liên quan đến khả hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường Vì vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu nhằm đánh giá tác dụng ức chế enzyme αglucosidase tác dụng chống oxi hóa cao chiết hạt cà phê xanh Nguyên vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Nguyên liệu Hạt cà phê (1 kg) thu hoạch vào tháng năm 2019 Buôn Ma Thuột Mẫu nghiên cứu giám định thực vật học môn dược liệu- dược cổ truyền, Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội Hạt làm sấy khô 50oC Hạt cà phê nghiền nhỏ thành bột, tiến hành chiết xuất ethanol (EtOH) 70 %, lặp lại lần gộp dịch chiết, lọc, cất loại dung môi áp suất giảm thu cao chiết toàn phần ethanol (512 g) Cao chiết phân tán vào nước cất tỷ lệ 1:1 chiết phân bố dung mơi có độ phân cực tăng dần n-hexan, ethyl acetate n-butanol (mỗi dung môi lần) Các phân đoạn cất loại dung môi áp suất giảm thu phân đoạn tương ứng n-hexane (72 g), ethyl acetate (218 g) n-butanol (142 g) 2.2 Phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa Hợp chất 1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl (DPPH) có khả tạo gốc tự bền dung dịch MeOH bão hòa, dung dịch có màu tím đỏ phản ứng với chất chống oxy hóa để tạo phức hợp màu vàng không hấp thụ ánh sáng tử ngoại bước sóng 517 nm [5] Khi cho chất vào dung dịch chất có khả quét gốc tự làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng gốc tự DPPH Mẫu thử pha thành nồng độ khác Hỗn hợp phản ứng gồm: 170 µl dung dịch DPPH (nồng độ 0.24 mg/ml) methanol, 100 µl dịch thử mẫu 730 µl methanol ủ 25oC 15 phút Song song với mẫu thử, tiến hành đo mẫu chứng với điều kiện thành phần gồm: 830 µl methanol 170 µl dung dịch DPPH (nồng độ 0,24 mg/ml methanol) Tất thí nghiệm lặp lại lần Hoạt tính quét gốc tự DPPH đánh giá thông qua giá trị phần trăm ức chế I (%) tính theo cơng thức: Ac − At I% = × 100 Ac − Ao Trong đó: I %: Hoạt tính chống oxy hóa Ac: Độ hấp thu mẫu chứng At: Độ hấp thu mẫu thử Ao: Độ hấp thu mẫu trắng (sử dụng methanol) Tác dụng chống oxy hóa dịch chiết so sánh với chất chuẩn dương acid ascorbic Giá trị IC50 mẫu tính theo đồ thị nồng độ % ức chế (I%) D.K Thu et al / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 35, No (2019) 12-18 2.3 Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase glucosidase 0.2 U/ml, 10 µl mẫu thử, 25 µl pNitrophenyl-α-D-glucopyranoside 2.5 mM Ở mẫu đối chứng, mẫu thử thay đệm phản ứng Thí nghiệm ủ nhiệt độ 37 o C Sau 30 phút, phản ứng dừng 100 µg/ml Na2CO3 Độ hấp thụ phản ứng xác định máy BIOTEK với bước sóng 410 nm (A) Khả ức chế enzyme α-glucosidase mẫu thử xác định công thức A(đối chứng) − A(mẫu thử) Độ ức chế % = A(đối chứng) × 100 IC50 nồng độ ức chế 50% hoạt động enzym α-glucosidase, tính phần mềm Tablecurve Dựa phản ứng phân cắt chất pNitrophenyl-α-D-glucopyranoside nhờ tác động enzyme α-glucosidase qua giả phóng sản phẩm p-Nitrophenol có màu vàng α-glucosidase p-Nitrophenyl-α-D-glucopyranoside α-D-glucose + p-Nitrophenol Độ hấp thụ hỗn hợp phản ứng bước sóng 410 nm thời điểm 30 phút sau phản ứng, phản ánh lượng sản phẩm p-Nitrophenol sinh ra, sau phản ánh hoạt độ enzyme αglucosidase [6] Phương pháp xác định hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase thực đĩa 96 giếng Mẫu thử pha loãng DMSO nước deion thành dãy nồng độ, nồng độ phản ứng 256, 64, 14, 4, µg/ml pha lỗng tiếp với mẫu hoạt tính nhỏ µg/ml Acarbose sử dụng làm chất tham khảo Các thành phần phản ứng bao gồm µl phosphate buffer 100 mM pH 6.8; 25 µl α- 2.4 Xử lý số liệu Các số liệu nghiên cứu xử lý thống kê theo phần mềm SigmaPlot 12, Microsoft excel 2013 Số liệu biểu diễn dạng 𝑋± SD ( 𝑋: giá trị trung bình mẫu thử, SD: độ lệch chuẩn) Phân đoạn n-Hexane 300 600 250 500 Nồng độ (µg/mL) Nồng độ (µg/mL) Cao chiết toàn phần 200 150 100 50 400 300 200 100 0 20 40 60 80 100 20 100 80 60 40 30 60 25 50 40 30 20 20 10 0 40 60 80 Phần tram ức chế (%) 80 100 100 Axit ascorbic 70 Nồng độ (µg/mL) Nồng độ (µg/mL) 120 20 60 Phân đoạn EtOAc Phân đoạn Butanol 140 40 Phần trăm ức chế (%) Phần trăm ức chế (%) Nồng độ (µg/mL) 15 20 15 10 0 20 40 60 80 100 Phần tram ức chế (%) 120 20 40 60 80 100 Phần tram ức chế (%) Hình Đồ thị biểu diễn khả quét gốc tự DPPH cao chiết toàn phần, phân đoạn hạt cà phê xanh axit ascorbic 16 D.K Thu et al / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 35, No (2019) 12-18 Bảng Giá trị IC50 cao chiết toàn phần phân đoạn hạt cà phê acid ascorbic khả quét gốc tự DPPH Mẫu thử Cao chiết tồn phần n-Hexan EtOAc n-Butanol Acid Ascorbic IC50 (µg/ml) 155,86 ± 0,87 295,21 ± 0,93 25,69 ± 3,08 61,09 ± 1,02 20,37 ± 0,58 Kết bàn luận 3.1 Tác dụng chống oxi hóa Tác dụng chống oxy hóa in vitro mơ hình qt gốc tự DPPH mẫu thử cao chiết toàn phần phân đoạn n-Hexan, EtOAc n-Butanol mẫu chứng trình bày hình Từ kết bảng cho thấy tác dụng quét gốc tự DPPH in vitro phân đoạn phụ thuộc vào nồng độ Trong mẫu thử, phân đoạn EtOAc thể tác dụng quét gốc tự DPPH tốt với IC50 25,69 ± 3,08 µg/ml, sau phân đoạn Butanol cao chiết toàn phần hạt cà phê với IC50 61,09 ± 1,02 µg/ml 155,86 ± 0,87 µg/ml Phân đoạn nHexan thể tác dụng chống oxy hóa yếu với giá trị IC50 thu 295,21 ± 0,93 µg/ml Song song với mẫu thử tiến hành tương tự với mẫu chứng acid ascorbic thu giá trị IC50 20,37 ± 0,58 µg/ml cho thấy thí nghiệm hoạt động ổn định 3.2 Tác dụng ức chế enzym α-glucosidase Kết thử hoạt tính ức chế enzym αglucosidase mẫu thử trình bày bảng Bảng Kết IC50 cao chiết toàn phần phân đoạn hạt cà phê xanh Tên mẫu Cao chiết toàn phần n-Hexan EtOAc n-Butanol Acarbose Giá trị IC50 (µg/ml) 2,40 ± 0,11 2,25 ± 0,06 2,21 ± 0,04 5,90 ± 0,56 124,6 ± 1,10 Qua bảng cho thấy cao chiết toàn phần phân đoạn có tác dụng ức chế enzym α- glucosidase, đặc biệt phân đoạn EtOAc có biểu hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase mạnh với giá trị IC50 2,21± 0,04 µg/mL Tiếp đến cao hexan với giá trị IC50 2,25 ± 0,06 µg/mL phân đoạn n-Butanol với giá trị IC50 5,90 ± 0,56 µg/mL Quá trình tăng glucose huyết thể sản sinh nhiều gốc tự làm suy yếu hệ thống phòng thủ chống oxy hóa nội sinh [7] Do để phòng ngừa giảm triệu chứng bệnh đái tháo đường sử dụng chất chống oxy hóa biện pháp hữu hiệu [8] Phương pháp quét gốc tự DDPH sử dụng rộng rãi để đánh giá khả chống oxy hóa Kết nghiên cứu cho thấy tác dụng cao chiết toàn phần hạt cà phê xanh phụ thuộc vào nồng độ nghĩa nồng độ chất tăng tác dụng quét gốc tự tăng theo Cao chiết tồn phần hạt cà phê xanh có khả qt gốc tự DPPH đáng kể với IC50 155,86 ± 0,87 µg/ml; đặc biệt phân đoạn EtOAc thể tác dụng quét gốc tự DPPH cao với IC50 25,69 ± 3,08 µg/ml Kết nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa cà phê nghiên cứu tương đồng với nghiên cứu giới Babova O cộng nghiên cứu tác dụng quét gốc DDPH cao chiết ethanol hạt cà phê xanh với loài Coffea Arabica Coffea Canephora cho thấy cao chiết có tác dụng chống oxi hóa cao, đặc biết lồi Coffea Arabica [9] Alexandros Priftis cộng chứng minh dịch chiết từ cà phê xanh cà phê rang có tác dụng quét gốc tự mạnh, ngăn ngừa tổn thương ADN gốc tự gây [10] Tương tự, Ningjian Liang cộng chứng minh hoạt chất có cà phê caffeine, axit chlorogenic, melanoidins, trigonelline, cafestol kahweol có tác dụng chống oxy hóa động vật trờn ngi [11] Richtier Gonỗalves cng chng minh dch chit cà phê có tác dụng chống oxy hóa thơng qua tác D.K Thu et al / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 35, No (2019) 12-18 dụng quét gốc tự DPPH ABTS (2, 2’azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) [12] α-Glucosidase enzym nằm màng tế bào đường ruột, tham gia vào bước cuối q trình tiêu hóa Vì vậy, chất ức chế enzym làm giảm trình hấp thu đường từ đường tiêu hóa vào máu Các chất ức chế enzym α-glucosidase sử dụng làm thuốc điều trị bệnh đái tháo đường typ acarbose, miglitol, voglibose [6] Acarbose thuốc tân dược dược sử dụng rộng rãi chất chứng dương nghiên cứu tác dụng ức chế enzym α – glucosidase Trong nghiên cứu acarbose sử dụng làm chất chứng dương cho thí nghiệm đánh giá khả ức chế enzyme αglucosidase Kết nghiên cứu cho thấy cao chiết toàn phần phân đoạn hạt cà phê xanh có tác dụng ức chế enzym αglucosidase mạnh so với acarbose Như vậy, cao chiết hạt cà phê xanh có chứa nhiều hợp chất có tác dụng ức chế enzym αglucosidase Vì vậy, hướng nghiên cứu tiến hành tách chiết hợp chất từ cao chiết hạt cà phê xanh để phân lập hợp chất có khả ức chế enzym với giá trị IC50 cao Kết nghiên cứu tương đồng với công bố trước Shin-Duk Kim phân lập hợp chất β-carboline alkaloid norharman (9H-pyrido[3.4- b]indole) từ hạt cà phê cho thấy hợp chất ức chế mạnh enzym α-Glucosidase với IC50 180 ± 3.2 µM [13] Ngoài ra, Zheng Yinan cộng cho thấy dịch chiết nước hạt cà phê ức chế enzym αglucosidase hợp chất chlorogenic acid đảm nhiệm [14] Trong nghiên cứu này, cao chiết hạt cà phê có khả ức chế enzyme αglucosidase, bước ngăn cản q trình hấp thu glucose, giúp hỗ trợ điều hịa đường huyết Kết luận Nghiên cứu đánh giá tác dụng chống oxi hóa ức chế enzym α-glucosidase cao chiết hạt cà phê phân đoạn cao chiết hạt cà phê xanh Kết cho thấy cao chiết cà 17 phê có tác dụng chống oxi hóa ức chế enzym α-glucosidase, đặc biệt phân đoạn EtOAc Kết gợi ý cho việc nghiên cứu sâu thành phần hóa học phân đoạn dịch chiết EtOAc để phân tách hợp chất tinh khiết có tiềm phịng, điều trị bệnh đái tháo đường Tài liệu tham khảo [1] Federation ID IDF Diabetes Atlas 8th Edition (2017) [2] Wright Jr E, Scism‐Bacon J, Glass L Oxidative stress in type diabetes: the role of fasting and postprandial glycaemia International journal of clinical practice 60(3) (2006) 308 [3] X Chen A review on coffee leaves: Phytochemicals, bioactivities and applications Critical reviews in food science and nutrition 59(6) (2019) 1008 [4] Chu Y-F Coffee: emerging health effects and disease prevention John Wiley & Sons (2012) [5] N.T Hai, D.K Thu, B.T Tung Sarcandra glabra Extract Protects against Scopolamine Induced Cognitive Deficits by Modulating Neuroinflammation and the Cholinergic System Current Enzyme Inhibition 14(3) (2018) 210 [6] B.T Tung, D.K Thu, P.T Hai, N.T Hai Evaluation of α-glucosidase inhibitory activity of fractions from Punica granatum Linn fruits (in Vietnamese), Journal of Traditional Vietnamese Medicine and Pharmacy 5(18) (2018) 59 [7] S Lenzen The mechanisms of alloxan-and streptozotocin-induced diabetes Diabetologia 51(2) (2008) 216 [8] K Shapiro, W.C Gong Natural products used for diabetes Journal of the American Pharmaceutical Association 42(2) (2002) 217 [9] O Babova, A Occhipinti, M.E Maffei Chemical partitioning and antioxidant capacity of green coffee (Coffea arabica and Coffea canephora) of different geographical origin Phytochemistry 123 (2016) 33 [10] A Priftis, D Stagos, K Konstantinopoulos, C Tsitsimpikou, D.A Spandidos, A.M Tsatsakis, et al Comparison of antioxidant activity between green and roasted coffee beans using molecular methods Molecular medicine reports 12(5) (2015) 7293 [11] N Liang, D.D Kitts Antioxidant property of coffee components: assessment of methods that define mechanisms of action Molecules 19(11) (2014) 19180 18 D.K Thu et al / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 35, No (2019) 12-18 [12] Vieira TMFdS Potential antioxidant of brazilian coffee from the region of Cerrado Food Science and Technology 38(3) (2018) 447 [13] S.D Kim α-Glucosidase inhibitor isolated from coffee J Microbiol Biotechnol 25(2) (2015) 174 [14] Y Zheng, K Liu, G Jia, H Li, L Han, Y Kimura Effect of hot-water extract of coffee seeds on postprandial blood glucose concentration in rats (2007) ... dụng chống oxi hóa ức chế enzym α- glucosidase cao chiết hạt cà phê phân đoạn cao chiết hạt cà phê xanh Kết cho thấy cao chiết cà 17 phê có tác dụng chống oxi hóa ức chế enzym α- glucosidase, đặc... Trong nghiên cứu đánh giá tác dụng ức chế enzym α- glucosidase tác dụng chống oxi hóa thơng qua khả qt gốc tự DPPH cao chiết hạt cà phê xanh (Coffea canephora) phân đoạn Hạt cà phê nghiền nhỏ, chiết. .. nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa cà phê nghiên cứu tương đồng với nghiên cứu giới Babova O cộng nghiên cứu tác dụng quét gốc DDPH cao chiết ethanol hạt cà phê xanh với loài Coffea Arabica Coffea Canephora