Dược liệu là một nguồn tiềm năng chứa các chất có khả năng ức chế enzym Acetylcholinesrerase (AChE) –enzym đích quan trọng trong điều trị bệnh Alzheimer. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đánh giá tác dụng ức chế AChE và tác dụng chống oxy hóa của cây Bơ (Persea Americana Mill) gồm lá, quả, hạt và vỏ quả. Các mẫu được chiết siêu âm bằng ethanol 50% và tiến hành phân đoạn lần lượt với n-hexane, ethyl acetate (EtOAc) và n-butanol (n-BuOH).
VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 35, No (2019) 19-30 Original Article Evaluating the Acetylcholinesterase Inhibitory and Antioxidant Activities of Persea Americana Extracts Dang Kim Thu*, Hoang Thi Thuy, Bui Thi Thanh Duyen, Luc Thi Thanh Hang, Nguyen Thi Trang, Bui Son Nhat, Tran Thi Quynh Hoa, Duong Thi Ky Duyen, Bui Thanh Tung VNU School of Medicine and Pharmacy, 144 Xuan Thuy, Cau Giay, Hanoi, Vietnam Received 13 May 2019 Revised 16 May 2019; Accepted 21 June 2019 Abstract: Medicinal plants are a potential source of enzyme acetylcholinesrerase (AChE) inhibitors, a key target in the treatment of Alzheimer’s disease This paper studies the AChE inhibitory activity and the antioxidant effect of Persea Americana Mill extract The sample leave, seed, exocarp and mesocarp of avocado were extracted with 50% ethanol and subsequently fractionated with n-hexane, ethyl acetate (EtOA) and n-butanol (n-BuOH) solvents The AChE inhibitory activity was evaluated by Ellman’s colorimetric method and the antioxidant activity by screening DPPH free radicals The results show that the seed of Persea Americana extract had the strongest AChE inhibitory activity and antioxidant effect, followed by the leave extract, and the exocarp extract and mesocarp extract were the weakest The Persea Americana seed extract inhibited AChE activity in a dose-dependent manner with an IC50 value of 47.43 ± 0.5 μg/mL and the antioxidant effect with an IC50 value of 68.7 ± 0.35 µg/mL The results also show that n–BuOH fraction of Persea Americana seed extract had strong AChE inhibitory and antioxidant activities with an IC50 value of 15.24 ± 0.52 µg/ml and 15.73 ± 0.42 μg/mL, respectively The study results suggest that the Persea Americana Mill is a promising ingredient in Alzheimer’s disease prevention and treatment Keywords: Persea Americana Mill, Acetylcholinesrerase inhibitors (AChE), Alzheimer, DPPH. Corresponding author Email address: dangkimthu048@gmail.com https://doi.org/10.25073/2588-1132/vnumps.4169 19 VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 35, No (2019) 19-30 Nghiên cứu tác dụng ức chế Enzym Acetylcholinesterase quét gốc tự DPPH Bơ (Persea Americana Mill.) Đặng Kim Thu*, Hoàng Thị Thúy, Bùi Thị Thanh Duyên, Lục Thị Thanh Hằng, Nguyễn Thị Trang, Bùi Sơn Nhật, Trần Thị Quỳnh Hoa, Dương Thị Kỳ Duyên, Bùi Thanh Tùng Khoa Y dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, 144 Xuân Thủy, Cầu Giấy, Hà Nội, Việt Nam Nhận ngày 13 tháng năm 2019 Chỉnh sửa ngày 16 tháng năm 2019; Chấp nhận đăng ngày 21 tháng năm 2019 Tóm tắt: Dược liệu nguồn tiềm chứa chất có khả ức chế enzym Acetylcholinesrerase (AChE) –enzym đích quan trọng điều trị bệnh Alzheimer Trong nghiên cứu này, đánh giá tác dụng ức chế AChE tác dụng chống oxy hóa Bơ (Persea Americana Mill) gồm lá, quả, hạt vỏ Các mẫu chiết siêu âm ethanol 50% tiến hành phân đoạn với n-hexane, ethyl acetate (EtOAc) n-butanol (n-BuOH) Tác dụng ức chế AChE tiến hành theo phương pháp đo quang Ellman tác dụng chống oxy hóa thơng qua khả qt gốc tự DPPH Kết cho thấy cao chiết hạt Bơ có tác dụng ức chế AChE DPPH mạnh nhất, cao chiết lá, vỏ thấp cao chiết thịt Bơ Tác dụng ức chế AChE cao chiết hạt Bơ theo chế phụ thuộc nồng độ, có giá trị IC 50 47,43 ± 0,5 μg/mL tác dụng chống oxy hóa với IC50 68,7 ± 0,35 µg/ml Đánh giá phân đoạn dịch chiết hạt Bơ cho thấy phân đoạn n-BuOH có hoạt tính ức chế AChE DPPH mạnh với IC50 15,24 ± 0,52 µg/ml 15,73 ± 0,42 µg/ml, phân đoạn n-hexan, EtOH EtOAc Kết nghiên cứu cho thấy hạt Bơ có tiềm việc phòng ngừa hỗ trợ điều trị bệnh Alzheimer Từ khóa: Bơ; Bơ; Bơ; Persea Americana Mill; Enzym Acetycholinesterase; Bệnh Alzheimer; DPPH Đặt vấn đề cho có tích tụ mảng xơ amyloid beta – Aβ đám xơ rối tau protein [1] Một thay đổi sinh hóa đáng ý bệnh nhân mắc bệnh Alzheimer Bệnh Alzheimer bệnh thối hóa thần kinh tiến triển liên quan đến tuổi, làm suy yếu khả nhớ nhận thức mà nguyên nhân Tác giả liên hệ Địa email: dangkimthu048@gmail.com https://doi.org/10.25073/2588-1132/vnumps.4169 20 D.K Thu et al / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 35, No (2019) 19-30 suy giảm nồng độ Acetylcholin vùng đồi vỏ não Acetylcholinesterase (AChE) enzym có tác dụng thủy phân chất dẫn truyền thần kinh synap thần kinh cholinergic chất ức chế enzym AChE đóng vai trò quan trọng việc điều trị bệnh Alzheimer Bên cạnh đó, gia tăng mức gốc tự thể gây tượng “stress oxy hóa” cho nguyên nhân gây bệnh mạn tính thối hóa bệnh Parkinson Alzheimer Tuy nhiên chất ức chế enzym AChE physostigmine, galantamine, tacrine, donepezil, metrifonate, lại không mang lại hiệu cao gây nhiều tác dụng không mong muốn như: buồn nôn, nôn, đau bụng tiêu chảy, khó tiêu, phát ban [2] Physostigmin chất ức chế AChE dùng cho nghiên cứu điều trị bệnh Alzheimer, bị thu hồi khỏi thị trường số tác dụng không mong muốn Tacrine gây độc gan thử nghiệm lâm sàng [3] Ngồi ra, thuốc thuộc nhóm chống oxy hóa vitamin E, Ginkgo biloba… sử dụng để điều trị tổn thương liên quan đến nhận thức bệnh nhân Alzheimer có nguồn gốc từ tự nhiên Vì vậy, việc nghiên cứu dược liệu vừa có hoạt tính chống oxy hóa vừa có khả ức chế enzyme AChE để phòng điều trị bệnh Alzeimer hướng nghiên cứu thu hút quan tâm nhiều nhà nghiên cứu giới Bơ có tên khoa học Persea americana Mill (Lauraceae), loại cận nhiệt đới có nguồn gốc từ Mexico Trung Mỹ Nghiên cứu cho thấy Bơ có chứa hợp chất peptone, b-galactoside, axit glycosylated abscisic, alkaloids, cellulose, polygalacto urease, polyuronoids, cytochrome,… Bơ sử dụng cho điều trị số bệnh lở loét, tăng huyết áp, đau bụng, viêm phế quản, tiêu chảy tiểu đường [4, 5] Lá Bơ có tác dụng hạ glucose huyết hạ cholesterol tồn phần LDL, có tác dụng phòng ngừa xơ vữa động mạch [6] Đặc biệt, Bơ có tác dụng hệ thần kinh chống co giật, ức chế enzym AChE butyrylcholinesterase tác dụng chống oxy hóa Tuy nhiên, Việt Nam chưa có nghiên cứu đánh giá tác dụng ức chế AChE chống 21 oxy hóa DPPH Bơ nhằm phát triển thành sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh Alzheimer Vì vậy, nghiên cứu tiến hành nhằm đánh giá tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh Alzheimer thông qua khả ức chế enzym AChE tác dụng chống oxy hóa dịch chiết phần Bơ Nguyên vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Nguyên liệu Quả Bơ thu mua vào tháng 10 năm 2018 Đắk Lắk Mẫu nghiên cứu giám định thực vật học Bộ môn Dược liệu – Dược cổ truyền, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội Quả rửa bóc tách thành phần: vỏ, thịt, hạt sau đem thái nhỏ, sấy khơ 50oC Lá rửa sạch, phơi sấy khô 50oC sau vò nhỏ Để nghiên cứu tác dụng dược lý tiến hành chiết xuất phần Bơ (vỏ 65g, hạt 100g, thịt 100g) Bơ (65g) khô ethanol (EtOH) 50% dịch chiết, lặp lại lần gộp dịch chiết sau lọc Cơ quay thu hồi cắn tạo thành cao tổng để tiến hành thử hoạt tính Hiệu suất chiết phần thu sau: Lá 9,03 %; Vỏ 17,51%; Hạt 25,8 %; Thịt 43,65 % Phân tích, đánh giá kết thu cao tổng loại: lá, vỏ, thịt, hạt để đưa phần có hoạt tính cao nhất, tiến hành chiết phân đoạn Cao tổng phần có hoạt tính cao tiến hành chiết phân đoạn sau: Hòa tan cao EtOH 50o dịch chiết, sau chiết dung môi n-Hexan, EtOAc nButanol thu phân đoạn dịch chiết Cô quay thu hồi cắn dịch chiết phân đoạn để tiến hành thử hoạt tính 2.2 Phương pháp đánh giá tác dụng chớng oxy hóa Hợp chất 1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl (DPPH) có khả tạo gốc tự bền dung dịch MeOH bão hòa, dung dịch có màu tím đỏ phản ứng với chất chống oxy hóa để tạo phức hợp màu vàng khơng hấp thụ ánh sáng tử ngoại bước sóng 517 nm Khi cho chất vào 22 D.K Thu et al / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 35, No (2019) 19-30 dung dịch chất có khả quét gốc tự làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng gốc tự DPPH Mẫu thử pha thành nồng độ khác Hỗn hợp phản ứng gồm: 1100 µl dung dịch DPPH (nồng độ 0,08 mg/ml) methanol, 100 µl dịch thử mẫu 1800 µl methanol ủ 25oC 15 phút Song song với mẫu thử, ta tiến hành đo mẫu chứng với điều kiện thành phần gồm: 1900 µl methanol 1100 µl dung dịch DPPH (nồng độ 0,08 mg/ml methanol) Tất thí nghiệm lặp lại lần Hoạt tính quét gốc tự DPPH đánh giá thông qua giá trị phần trăm ức chế I (%) tính theo cơng thức: Ac − At I%= x 100 Ac − Ao Trong đó: I %: Hoạt tính chống oxy hóa Ac: Độ hấp thu mẫu chứng At: Độ hấp thu mẫu thử A0: Độ hấp thu mẫu trắng (sử dụng methanol) Tác dụng chống oxy hóa dịch chiết so sánh với chất chuẩn dương acid ascorbic Giá trị chống oxy hóa IC50 mẫu tính theo đồ thị nồng độ % ức chế (I%) 2.3 Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase Cơ chất acetylthiocholin iodid (ACTI) bị thủy phân nhờ xúc tác AChE tạo thiocholin Sản phẩm thiocholin phản ứng với thuốc thử acid 5-5’-dithiobis-2-nitrobenzoic (DTNB) tạo thành hợp chất acid 5-thio-2-nitro benzoic có màu vàng Lượng hợp chất màu tạo thành tỷ lệ thuận với hoạt độ AChE Dựa vào xác định độ hấp thụ mẫu thử 412 nm để đánh giá hoạt tính AChE Hỗn hợp phản ứng bao gồm 700 µl dung dịch đệm natri phosphat (pH 8,0); 100 µl dung dịch thử nồng độ khác 100 µl dung dịch enzym AChE 0,5 IU/ml Trộn đem ủ 15 phút 25oC Các dịch chiết thử chất chuẩn dương (Donepezil) hòa tan 10% dimethyl sulfoxid (DMSO) Sau đó, thêm 50 µl of DTNB 2,5 mM 50 µl ACTI 2,5 mM trộn Tiếp tục ủ hỗn hợp 10 phút 250C Sau đó, dung dịch đo độ hấp thụ bước sóng 412 nm Tất thí nghiệm lặp lại lần Donepezil sử dụng làm chứng dương Phần trăm ức chế hoạt độ enzym AChE (% I) tính theo cơng thức: Ac − At %I = x100 Ac − Ao Trong đó: %I: phần trăm hoạt tính AChE bị ức chế Ac: độ hấp thu mẫu chứng (khơng chứa 100 µl dung dịch thử) At: độ hấp thu mẫu thử Ao: độ hấp thu mẫu trắng (1 ml dung dịch đệm sodium phosphat) 2.4 Phương pháp đánh giá đặc điểm dược động học ức chế enzym AChE Hỗn hợp phản ứng gồm 700 µl dung dịch đệm sodium phosphat 0,1M (pH 8.0); 100 µl dung dịch thử nồng độ µg/ml, 7,5 µg/ml; 15 µg/ml 30 µg/ml 100 µl dung dịch enzym AChE 0,5 IU/ml Trộn đem ủ 15 phút 25oC Sau đó, thêm 50 µl dung dịch DTNB 2,5 mM 50 µl với nồng độ khác chất ACTI (1,25; 2,5; mM) trộn Tiến hành đo độ hấp thụ quang dung dịch thu bước sóng 412 nm vòng phút Tất thí nghiệm lặp lại lần Sử dụng đồ thị 1/[ACTI] 1/V (1/tốc độ phản ứng) (đồ thị Lineweaver – Burk) để xác định kiểu động học ức chế enzym Hằng số Ki xác định điểm giao đường nồng độ phân đoạn dịch chiết IC50 nhỏ với 1/V (1/tốc độ phản ứng) (đồ thị Dixon – Dixon plot) trục Ox 2.5 Xử lý số liệu Các số liệu nghiên cứu xử lý thống kê theo phần mềm SigmaPlot 12, Microsoft excel 2013 Số liệu biểu diễn dạng ⃐ ± SD (X ⃐ : giá trị trung bình mẫu thử, SD: X độ lệch chuẩn D.K Thu et al / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 35, No (2019) 19-30 Kết 3.1 Kết đánh giá hoạt tính cao chiết thành phần lá, vỏ, thịt và hạt Bơ 3.1.1 Tác dụng chớng oxy hóa in vitro Tác dụng chống oxy hóa in vitro mơ hình qt gốc tự DPPH mẫu thử dịch chiết toàn phần nồng độ khác lá, vỏ quả, thịt hạt Bơ trình bày hình Song song với mẫu thử, tiến hành tương tự với mẫu chứng kết thu trình bày hình Vỏ Bơ Thịt Bơ 600 600 500 y = 0.1469x2 + 0.1702x + 33.442 R² = 0.9997 400 C (µg/ml) C (µg/ml) 500 300 y = 0.0568x2 - 0.3743x + 38.14 R² = 0.9987 400 300 200 200 100 100 0 10 20 30 40 50 60 20 40 60 80 100 I% I% 600 600 Hạt Bơ Lá Bơ 500 500 400 400 y = 0.0729x2 - 1.5148x + 35.575 R² = 0.9989 300 C (µg/ml) C (µg/ml) 23 200 200 100 100 0 20 40 60 80 100 y = 0.1009x2 - 5.2818x + 80.54 R² = 0.999 300 0 I% 20 40 60 80 100 I% Hình Đồ thị biểu diễn khả quét gốc tự DPPH Bơ phần Bơ Bảng Giá trị IC50 Bơ, phần Bơ acid ascorbic khả quét gốc tự DPPH Mẫu thử Lá Bơ Vỏ Bơ Thịt Bơ Hạt Bơ Acid ascorbic IC50 (µg/ml) 142,09 ± 1,00 161,43 ± 0,88 409,20 ± 0,53 68,70 ± 0,35 4,84 ± 0,35 25 C (µg/ml) 20 y = 0.0039x2 - 0.1348x + 1.8326 R² = 0.9982 15 10 0 20 40 60 80 100 I% Hình Đồ thị biểu diễn khả quét gốc tự DPPH acid ascorbic Từ hình hình ta tính giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50%) mẫu thử trình bày bảng Từ kết bảng cho thấy tác dụng quét gốc tự DPPH in vitro phận khác tăng dần theo nồng độ Trong mẫu thử, cao chiết hạt Bơ thể tác dụng quét gốc tự DPPH tốt với IC50 68,70 ± 0,35 µg/ml, sau Bơ vỏ Bơ với IC50 142,09 ± 1,00 µg/ml 161,43 ± 0,88 µg/ml Thịt Bơ gần khơng thể tác dụng chống oxy hóa với giá trị IC50 thu 409,20 ± 0,53 µg/ml, gấp gần 100 lần mẫu chứng Song song với mẫu thử tiến hành tương D.K Thu et al / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 35, No (2019) 19-30 24 tự với mẫu chứng acid ascorbic thu giá trị IC50 4,84 ± 0,35 µg/ml 3.1.2 Tác dụng ức chế enzym AChE Hoạt tính ức chế AChE in vitro dịch chiết toàn phần lá, phận Bơ chất đối chứng Donezepil thể hình hình Thịt Bơ 600 500 500 C (µg/ml) y = 0.4484x2 - 25.544x + 338.82 R² = 0.9984 400 C (µg/ml) Vỏ Bơ 600 300 y = 0.1789x2 - 12.807x + 240.53 R² = 0.9999 400 300 200 200 100 100 0 20 10 30 70 60 50 40 20 10 30 I% 60 50 40 70 I% Hạt Bơ Lá Bơ 600 600 500 400 C (µg/ml) y = 0.1789x2 - 12.807x + 240.53 R² = 0.9999 400 300 y = 0.141x2 - 8.0726x + 144.85 R² = 0.9992 300 200 200 100 100 0 20 100 80 60 40 20 60 40 I% 80 I% Hình Đồ thị biểu diễn khả ức chế AChE in vitro Bơ phần Bơ 2.5 2.0 C (µg/ml) C (µg/ml) 500 y = 0.0003x2 - 0.0114x + 0.232 R² = 0.9997 1.5 1.0 0.5 0.0 20 40 60 80 100 I% Hình Đồ thị biểu diễn khả ức chế AChE in vitro Donezepil 100 D.K Thu et al / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 35, No (2019) 19-30 25 Bảng Giá trị IC50 khả chống oxy hóa ức chế enzym AChE phần Bơ, Bơ chất chuẩn Mẫu thử Donepezil Hạt Lá Vỏ Thịt IC50 (µg/ml) 0,41 ± 0,12 47,43 ± 0,5 93,72 ± 1,86 376,29 ± 0,68 182,62 ± 2,5 Dựa vào đồ thị nồng độ phần trăm ức chế, ta xác định giá trị IC50 mẫu, chất chuẩn donepezil cho khả ức chế AChE Kết thu bảng Kết nghiên cứu cho thấy cao chiết hạt Bơ cho tác dụng ức chế enzym AChE tốt với giá trị IC50 47,43 ± 0,50 µg/ml, cao chiết Bơ với IC50 93,72 ± 1,86 µg/ml Cao chiết thịt Bơ vỏ Bơ gần không cho tác dụng ức chế enzym AChE với IC50 182,62 ± 2,50 µg/ml 376,29 ± 0,68 µg/ml Song song với mẫu thử, tiến hành tương tự với mẫu chứng donepezil thu giá trị IC50 0,41 ± 0,12 µg/ml Từ bảng số liệu cho thấy hạt Bơ có tác dụng chống oxy hóa ức chế enzym AChE tốt nên ta tiến hành đánh giá hoạt tính sinh học phân đoạn dịch chiết hạt Bơ 3.2 Kết đánh giá hoạt tính phân đoạn hạt Bơ 3.2.1 Tác dụng chống oxy hóa Khả quét gốc tự DPPH phân đoạn dịch chiết hạt Bơ thể đồ thị phần trăm chống oxy hóa (%) nồng độ mẫu thử (hình 5) 120 n-hexan 120 100 100 y = 0.009x2 + 1.0538x + 3.2833 R² = 0.9996 60 60 40 40 20 20 0 20 40 y = 0.0174x2 + 0.3333x - 0.645 R² = 0.9978 80 C (µg/ml) 80 C (µg/ml) EtOAc 60 80 20 I% n-BuOH 120 60 80 EtOH 120 100 100 C (µg/ml) y = 0.0242x2 - 1.3714x + 24.277 R² = 0.9996 80 C (µg/ml) 40 I% 60 y = 0.0038x2 + 1.5882x - 1.279 R² = 0.9995 80 60 40 40 20 20 0 20 40 60 I% 80 100 20 40 60 I% Hình Đồ thị biểu diễn khả quét gốc tự DPPH phân đoạn dịch chiết hạt Bơ 80 D.K Thu et al / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 35, No (2019) 19-30 26 Kết thu phân đoạn n-BuOH khả quét gốc tự DPPH tốt với giá trị IC50 thu 15,73 ± 0,42 µg/ml, sau phân đoạn EtOAc phân đoạn n-hexan với giá trị IC50 tính 59,51 ± 1,61 µg/ml; 78,47 ± 1,05 µg/ml phân đoạn EtOH với IC50 87,63 ± 0,26 µg/ml 3.2.2 Tác dụng ức chế enzym AChE Kết khả ức chế enzym AChE phân đoạn dịch chiết hạt Bơ thể hình 120 n-hexan 120 100 100 y = 0.0454x2 - 1.6777x + 22.576 R² = 0.9978 80 y = 0.0101x2 + 1.5504x - 2.5651 R² = 0.9991 80 C (µg/ml) C (µg/ml) EtOAc 60 60 40 40 20 20 0 20 40 60 20 I% n-BuOH 120 60 EtOH 120 100 100 y = 0.0283x2 - 1.7946x + 34.223 R² = 0.9997 80 C (µg/ml) C (µg/ml) 40 I% 60 80 60 40 40 20 20 y = 0.0051x2 + 1.6762x - 4.3178 R² = 0.9996 0 20 40 60 80 100 I% 20 40 60 I% Hình Đồ thị biểu diễn khả ức chế AChE in vitro phân đoạn dịch chiết hạt Bơ Kết nghiên cứu cho thấy phân đoạn dịch chiết hạt Bơ có tác dụng ức chế AChE dải nồng độ thử Trong phân đoạn n-BuOH cho tác dụng ức chế tốt với giá trị IC50 15,24 ± 0,52 µg/ml; sau phân đoạn n-hexan EtOH với giá trị IC50 52,19 ± 1,1 µg/ml 92,24 ± 0,88 µg/ml phân đoạn EtOAc có tác dụng thấp với IC50 99,94 ± 3,23 µg/ml 3.3 Kết xác định động học ức chế enzym AChE Động học ức chế enzym AChE mô tả đồ thị Lineweaver-Burk, xây dựng từ đồ thị biểu diễn mối tương quan giá trị độ hấp thụ quang với thời gian phản ứng chất ACTI nồng độ khác Tác dụng ức chế enzym AChE phân đoạn dịch chiết nBuOH hạt Bơ thể hình (Đồ thị Lineweaver-Burk plot) 1/Tốc độ phản ứng (abs/min) D.K Thu et al / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 35, No (2019) 19-30 27 1/C 1/K0 1/C 1/K7.5 1/C 1/K15 1/C 1/K30 50 40 30 20 10 0.00 -0.05 -10 0.05 0.10 0.15 1/[ACTI] mM-1 Hình Đồ thị Lineweaver – Burk cho phân đoạn dịch chiết n-BuOH hạt Bơ 1/Tốc độ phản ứng (abs/min) Từ đồ thị Lineweaver-Burk ta xác định kiểu ức chế enzym AchE phân đoạn dịch chiết n-BuOH ức chế hỗn hợp Tiếp tục tiến hành xây dựng đồ thị động học Dixon phân đoạn dịch chiết n-BuOH dựa đồ thị biểu diễn mối tương quan giá trị độ hấp thụ quang với thời gian phản ứng phân đoạn dịch chiết nBuOH nồng độ 0; 7,5; 15; 30 µg/mL, kết thể hình 50 40 CBuOH K1 CBuOH K2 CBuOH K3 30 20 10 -40 -20 20 40 -10 Nồng độ phân đoạn n-BuOH (µg/mL) Hình Đồ thị Dixon phân đoạn dịch chiết n-BuOH hạt Bơ Từ đồ thị Dixon ta xác định số ức chế Ki xác định điểm giao đường [nồng độ phân đoạn dịch chiết n-BuOH] 1/V (1/tốc độ phản ứng) trục Ox, giá trị Ki thu 9,07 ± 0,21 µg/ml Bàn luận Theo nghiên cứu bệnh học Alzheimer q trình oxy hóa kéo dài đặc điểm điển hình bệnh với đặc điểm lượng peroxid hóa lipid, oxy hóa protein oxy hóa ADN tăng cao não [7] Các nghiên cứu nguyên nhân q trình oxy hóa chủ yếu protein beta – amyloid gây tế bào thần kinh nên phương hướng tiếp cận điều trị sử dụng liệu pháp chống oxy hóa Phương pháp DPPH phương pháp sử dụng rộng rãi mơ hình nghiên cứu đánh giá khả chống oxy hóa chất q trình nghiên cứu phát triển 28 D.K Thu et al / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 35, No (2019) 19-30 thuốc [8] Vì nghiên cứu sử dụng phương pháp DPPH để đánh giá tác dụng chống oxy hóa mẫu thử Chất đối chứng sử dụng acid ascorbic thu giá trị IC50 acid ascobic 4,84 ± 0,35 µg/ml tương đồng với nghiên cứu trước [9; 10] cho thấy phương pháp thử nghiệm phù hợp kết thu có ý nghĩa Bên cạnh liệu pháp chống oxy hóa hướng điều trị tiến hành nghiên cứu điều trị bệnh Alzheimer nghiên cứu chất ức chế enzym AChE – xúc tác trình thủy phân chất dẫn truyền ACh mà theo nghiên cứu nồng độ chất dẫn truyền ACh giảm trầm trọng bệnh nhân Alzheimer gây suy giảm khả nhận thức người bệnh [7; 11] Với nhiều ưu điểm phương pháp khác, phương pháp đo quang Ellman sử dụng để đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE mẫu thử với số thay đổi cho phù hợp với điều kiện nghiên cứu Chúng tơi sử dụng chất đối chứng Donepezil thuốc FDA chấp thuận sử dụng cho bệnh nhân bị Alzheimer thông qua chế ức chế AChE [12] Bên cạnh sử dụng phổ biến làm chất đối chứng thử nghiệm đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE [13; 14] Kết thu Donezepil thể khả ức chế AChE rõ rệt với giá trị IC50 0,41 ± 0,12 µg/ml tương đồng với nghiên cứu trước Fernandes cộng hay Ahmad Mohammadi-Farani cộng [13; 14] Vì phương pháp chất đối chứng lựa chọn phù hợp với thí nghiệm Kết nghiên cứu cho thấy cao chiết từ phần Bơ có tác dụng quét gốc tự DPPH nồng độ biến thiên khả quét gốc tự biến thiên theo Trong đó, cao chiết từ hạt Bơ cho tác dụng tốt so với phận lại với IC50 68,7 ± 0,35 µg/ml Điều chứng tỏ, cao chiết hạt Bơ chứa nhiều chất có khả quét gốc tự DPPH phần khác phenol, sterol, flavonoid Kết nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu trước tác giả Maha I Alkhalf tiến hành nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa hạt Bơ có tác dụng chống oxy hóa tốt thịt Bơ [15] Hạt Bơ tác giả Gómez nghiên cứu để sử dụng làm chất chống oxy hóa thực phẩm [16] Một số nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa dịch chiết hạt Bơ [17; 18] Bằng phương pháp Ellman nghiên cứu thấy phần Bơ có tác dụng ức chế enzym AChE theo cách thức phụ thuộc vào nồng độ chất thử, nghĩa tác dụng ức chế tăng dần theo nồng độ thử Cao chiết hạt Bơ cho thấy khả ức chế cao với IC50 47,43 ± 0,5 µg/ml hạt Bơ chứa hàm lượng cao chất có khả ức chế enzym AChE phenolic, saponin, alkanoid, terpenoid Kết tương đồng với nghiên cứu trước Oboh cộng kết luận dịch chiết hạt Bơ có tác dụng ức chế enzym AChE chống oxy hóa [19] Tiến hành nghiên cứu tiếp phân đoạn cao chiết hạt Bơ ta thu kết phân đoạn n-BuOH cho tác dụng ức chế AChE tốt (IC50 15,24 ± 0,52 µg/ml) chống oxy hóa tốt (IC50 = 15,73 ± 0,42 µg/ml) Phân đoạn n-BuOH dịch chiết hạt Bơ có tác dụng ức chế enzym AChE chống oxy hóa cao phân đoạn giải thích BuOH dung mơi phân cực nên hợp chất phenol, flavonois… tan chủ yếu dung môi Kết tác dụng ức chế enzym AChE chống oxy hóa tác dụng hiệp đồng hợp chất phân đoạn dịch chiết Hướng nghiên cứu nên tập trung vào phân lập, xác định hợp chất làm sáng tỏ chế tác dụng hợp chất Động học ức chế enzym AChE dịch chiết hạt Bơ chưa công bố trước nên nghiên cứu tiến hành đánh giá động học ức chế enzym phân đoạn có tác dụng mạnh – phân đoạn nBuOH Đồ thị động học Lineweaver–Burk có tính chất trung gian kiểu ức chế cạnh tranh không cạnh tranh, cho thấy kiểu ức chế phân đoạn dịch chiết n-BuOH kiểu ức chế hỗn hợp (trong đồ thị Lineweaver–Burk hệ số góc =Km/Vmax, điểm giao trục Ox = -1/Km) Đồ thị động học Dixon có tính chất đặc trưng chất ức chế cạnh tranh Hằng số ức chế Ki xác định giá trị tuyệt đối từ điểm giao đường D.K Thu et al / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 35, No (2019) 19-30 trục Ox đồ thị Dixon, vẽ theo 1/(tốc độ phản ứng) theo nồng độ phân đoạn dịch chiết n-BuOH Giá trị Ki xác định theo đồ thị Dixon 9,07 ± 0,21 µg/ml Ki số ức chế enzym cho phép đánh giá độ mạnh yếu chất ức chế, gọi số phân ly phức hợp enzym – chất ức chế Nếu số Ki nhỏ, chất ức chế bị liên kết chặt với enzym nên lượng enzym hoạt động nhỏ, tác dụng ức chế mạnh Phân đoạn n-BuOH dịch chiết hạt Bơ có giá trị số Ki nhỏ chứng tỏ có tác dụng ức chế enzym AChE mạnh Kiểu ức chế hỗn hợp kiểu ức chế đặc trưng dược liệu, nguyên nhân thành phần dịch chiết có chứa loạt hợp chất có nhiều chế tác dụng khác Cơ chế ức chế cho thấy hợp chất có hoạt tính phân đoạn dịch chiết n-BuOH cạnh tranh với ACTI để gắn vào trung tâm hoạt động – vị trí liên kết với chất enzym AChE kết hợp với enzym AChE kết hợp với phức hợp AChE-ACTI [20] Kết luận Nghiên cứu đánh giá tác dụng chống oxy hóa ức chế enxym AChE dịch chiết và thành phần Bơ: hạt, thịt bơ Kết cho thấy hạt Bơ có tác dụng chống oxy hóa tốt với giá trị IC50 68,7 ± 0,35 µg/ml tác dụng ức chế enzym AChE mạnh với giá trị IC50 47,43 ± 0,5 µg/ml Trong phân đoạn dịch chiết hạt Bơ phân đoạn nBuOH có tác dụng chống oxy hóa (IC50 = 15,73 ± 0,42 µg/ml ) ức chế enzym AChE (IC50 = 15,24 ± 0,52 µg/ml) cao Đặc điểm động học ức chế enzym AChE phân đoạn dịch chiết n-BuOH hạt Bơ kiểu ức chế hỗn hợp với số Ki 9,07 ± 0,21 µg/ml Kết nghiên cứu cho thấy cao chiết hạt Bơ, đặc biệt phân đoạn n-BuOH có tiềm hỗ trợ phòng điều trị bệnh liên quan đến Alzheimer rối loạn thần kinh Lời cảm ơn Đề tài tài trợ Khoa Y Dược, Đại Học Quốc Gia Hà Nội, mã số đề tài CS.18.01 29 Tài liệu tham khảo [1] M.M Essa et al., Neuroprotective effect of natural products against Alzheimer's disease, Neurochem Res 37(9) (2012) 1829 [2] B McGleenon, K Dynan, A Passmore, Acetylcholinesterase inhibitors in Alzheimer's disease, British journal of clinical pharmacology 48 (1999) 471 [3] P B Watkins et al, Hepatotoxic effects of tacrine administration in patients with Alzheimer's disease, In: Jama pp 992 (1994) [4] O Adeyemi, S Okpo, O Ogunti, Analgesic and anti-inflammatory effects of the aqueous extract of leaves of Persea americana Mill (Lauraceae) In: Fitoterapia pp 375 (2002) [5] P.D.D Dzeufiet, et al, Antihypertensive potential of the aqueous extract which combine leaf of Persea americana Mill (Lauraceae), stems and leaf of Cymbopogon citratus (DC) Stapf.(Poaceae), fruits of Citrus medical L.(Rutaceae) as well as honey in ethanol and sucrose experimental model In: BMC complementary and alternative medicine p 507 (2014) [6] B.I Brai, A Odetola, P Agomo, Hypoglycemic and hypocholesterolemic potential of Persea americana leaf extracts, Journal of medicinal food 10(2) (2007) 356 [7] Phạm Khuê Bệnh Alzheimer Nhà xuất Y học (2002) [8] Đàm Trung Bảo Các gốc tự do, Tạp chí Dược học (2001) 29 [9] F.R Mowsumi, A Rahaman, N.C Sarker, B.K Choudhury, S Hossain, In vitro relative free radical scavenging effects of Calocybe indica (milky oyster) and Pleurotus djamor (pink oyster), World J Pharm Pharm Sci 4(07) (2015) 186 [10] Y Bao, Y Qu, J Li, Y Li, X Ren, K Maffuci, et al In vitro and in vivo antioxidant activities of the flowers and leaves from Paeonia rockii and identification of their antioxidant constituents by UHPLC-ESI-HRMSn via pre-column DPPH reaction, Molecules 23(2) (2018) 392 [11] Phan Kế Sơn Đánh giá tác dụng ức chế enzym Acetylcholinsterase in vitro phân đoạn dịch chiết Hồng Liên Ơ rơ (Mahonia Nepalensis DC., họ Berberidaceae) Khóa luận tốt nghiệp Đại học ngành Dược học Khoa Y Dược - Đại học Quốc Gia Hà Nội (2017) [12] D Mohammad, P Chan, J Bradley, K Lanctôt, N Herrmann, Acetylcholinesterase inhibitors for treating dementia symptoms-a safety evaluation, Expert opinion on drug safety 16(9) (2017) 1009 30 D.K Thu et al / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 35, No (2019) 19-30 [13] A Mohammadi-Farani, S.S Darbandi, A Aliabadi, Synthesis and acetylcholinesterase inhibitory evaluation of 4-(1, 3-dioxoisoindolin-2yl)-N-phenyl benzamide derivatives as potential anti-alzheimer agents, Iranian journal of pharmaceutical research IJPR 15(3) (2016) 313 [14] T.B Fernandes, M.R Cunha, R.P Sakata, T.M Candido, A.R Baby, M.T Tavares, et al Synthesis, Molecular Modeling, and Evaluation of Novel Sulfonylhydrazones as Acetylcholinesterase Inhibitors for Alzheimer's Disease, Archiv der Pharmazie 350(11) (2017) 1700163 [15] M.I Alkhalf, W.S Alansari, E.A Ibrahim, M.E Elhalwagy, Anti-oxidant, anti-inflammatory and anti-cancer activities of avocado (Persea americana) fruit and seed extract Journal of King Saud University-Science (2018) [16] F Gómez, S Sánchez, M Iradi, N Azman, M Almajano, Avocado seeds: extraction optimization and possible use as antioxidant in food, Antioxidants 3(2) (2014) 439 [17] O.A Folasade, R.A Olaide, T.A Olufemi, Antioxidant properties of Persea americana M seed as affected by different extraction solvent, Journal of Advances in Food Science & Technology 3(2) (2016) 101 [18] C.A Alagbaoso, I.I Tokunbo, O.S Osakwe, Comparative study of antioxidant activity and mineral composition of methanol extract of seeds of ripe and unripe avocado pear (Persea americana, Mill.) NISEB Journal 15(4) (2017) [19] G Oboh, V.O Odubanjo, F Bello, A.O Ademosun, S.I Oyeleye, E.E Nwanna et al Aqueous extracts of avocado pear (Persea americana Mill.) leaves and seeds exhibit anticholinesterases and antioxidant activities in vitro, Journal of basic and clinical physiology and pharmacology 27(2) (2016) 131 [20] H Cavdar, M Senturk, M Guney , S Durdagi, G Kayik, C.T Supuran, et al Inhibition of acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase with uracil derivatives: kinetic and computational studies, Journal of enzyme inhibition and medicinal chemistry 34(1) (2019) 429 ... Pharmaceutical Sciences, Vol 35, No (2019) 19-30 Nghiên cứu tác dụng ức chế Enzym Acetylcholinesterase quét gốc tự DPPH Bơ (Persea Americana Mill.) Đặng Kim Thu*, Hoàng Thị Thúy, Bùi Thị Thanh... 100 I% Hình Đồ thị biểu diễn khả quét gốc tự DPPH Bơ phần Bơ Bảng Giá trị IC50 Bơ, phần Bơ acid ascorbic khả quét gốc tự DPPH Mẫu thử Lá Bơ Vỏ Bơ Thịt Bơ Hạt Bơ Acid ascorbic IC50 (µg/ml) 142,09... có khả quét gốc tự DPPH phần khác phenol, sterol, flavonoid Kết nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu trước tác giả Maha I Alkhalf tiến hành nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa hạt Bơ có tác dụng chống