Nghiên cứu khả năng chống oxi hóa của N-phenylhydroxylamine bằng phương pháp DPPH

Nghiên cứu tính chất động học của N-phenylhydroxyalmine (PHA) như một chất bắt gốc tự do được nghiên cứu bằng phương pháp 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl (DPPH*). Phần trăm DPPH* còn lại đối với thời gian tuân theo phương trình: ln[DPPH*còn lại]= b. thời gian + a.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM, ĐẠI HỌC HUẾ | HNKH 2019 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỐNG OXI HÓA CỦA N-PHENYLHYDROXYLAMINE BẰNG PHƯƠNG PHÁP DPPH* LÊ SĨ ANH KIỆT*, CHÂU VĂN CƯỜNG** NGUYỄN THỊ KIM KHÁNH , ĐẶNG CÔNG VŨ****, ĐỖ QUANG HUY***** Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Huế * Email: kietlspro@gmail.com ** Email: chaucuongars@gmail.com *** Email: kimkhanh778@gmail.com **** Email: math1997congvu@gmail.com ***** Email: qhuy.qb@gmail.com *** Tóm tắt: Nghiên cứu tính chất động học N-phenylhydroxyalmine (PHA) chất bắt gốc tự nghiên cứu phương pháp 2,2-diphenyl-1picrylhydrazyl (DPPH*) Phần trăm DPPH* lại thời gian tn theo phương trình: ln[DPPH*cịn lại]= b thời gian + a Hai thông số thời gian cần thiết để đạt trạng thái ổn định đến nồng độ tương ứng (TEC50) hiệu suất bắt gốc (AE) đưa để khảo sát Kết cho thấy chúng thông số quan trọng đánh giá khả chống oxy hóa hợp chất AE cao axit ascobic lại thấp với PHA chứng tỏ axit ascorbic có khả chống oxy hóa vượt trội N-phenylhydroxylamine có khả chống oxy hóa nhiên tốc độ bắt gốc chậm so với axit ascorbic Từ khóa: Chất chống oxi hóa, N-phenylhydroxylamine, axit ascorbic, TEC50, AE GIỚI THIỆU Sự oxy hóa đóng vai trị quan trọng q trình hóa học thu hút nhiều ý nhà khoa học khắp giới [1, 7, 9] Chất chống oxy hóa thường hợp chất thơm phenol, anilin, thiophenol chúng có lượng phân li liên kết N-H, O-H S-H thấp [6] Về mặt nghiên cứu thực nghiệm, phương pháp Blois (1958) phát triển sử dụng rộng rãi để xác định định lượng hoạt tính chống oxy hóa hợp chất [2] Phương pháp khơng phương pháp nhanh chóng, đơn giản rẻ tiền mà cịn cung cấp thơng tin trực tiếp khả chống oxy hóa tổng thể hệ thống nghiên cứu [4, 5] Về mặt cấu tạo, N-phenylhydroxylamine có vịng phenolic hai liên kết O-H N-H phân tử Vì đánh giá có khả chống oxy hóa cao Do đó, chúng tơi chọn N-phenylhydroxylamine làm đối tượng nghiên cứu: “Nghiên cứu khả chống oxi hóa N-phenylhydroxylamine phương pháp DPPH” Với mục đích so sánh, axit ascorbic (một chất chống oxy hóa truyền thống) lựa chọn để khảo sát khả chống oxy hóa với N-phenylhydroxylamine theo chế chuyển nguyên tử hidro THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thực nghiệm - Hóa chất: 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (C18H12N5O6): hàng Nhật Bản + N-phenylhydroxylamine (C6H7NO): hàng Merk + Axit ascorbic (C6H8O6 ): hàng Pháp - Dụng cụ: bình định mức, cân phân tích, bình tam giác, pipet, cốc thuỷ tinh 160 KỶ YẾU HỘI NGHỊ KHOA HỌC SINH VIÊN | 12/2019 2.2 Phương pháp nghiên cứu Ảnh hưởng chất chống oxy hóa dựa khả bắt gốc DPPH* đánh giá theo quy trình Brand-William [3] 0,1 ml dung dịch etanol có nồng độ chất chống oxy hóa khác thêm vào 3,9 ml DPPH* nồng độ 6,7.10-5 M Mật độ quang 517 nm đo thời gian khác máy quét phổ tử ngoại khả kiến TCC-240A SHIMADZU nhiệt độ phòng Các nồng độ chất chống oxy hóa khảo sát tính theo tỷ lệ số gam chất chống oxy hóa số kg DPPH* Phần trăm DPPH* cịn lại tính theo cơng thức (1) : [DPPH* ]T %DPPH = [DPPH* ]T=0 * (1) Phần trăm lượng DPPH* lại nồng độ chất chống oxy hóa sau vẽ đồ thị để xác định lượng chất chống oxy hóa cần thiết để giảm 50% nồng độ DPPH* ban đầu Thời gian cần thiết để đạt trạng thái ổn định nồng độ EC50 (TEC50) tính tốn đồ thị Dựa hai giá trị EC50 TEC50, hiệu suất bắt gốc (AE) tính tốn theo cơng thức (2) [8]: AE= EC50.TEC50 (2) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Trong nghiên cứu này, việc khảo sát ảnh hưởng nồng độ N-phenylhydroxylamine (PHA) đến khả bắt gốc DPPH* theo thời gian đánh giá Công thức cấu tạo Nphenylhydroxylamine (PHA) axit ascorbic (ASC) minh họa hình (a) PHA (b) ASC Hình Cấu trúc phân tử (a) PHA (b) ASC 3.1 Mối liên hệ mật độ quang (A517) nồng độ DPPH** A517 mật độ quang dung dịch DPPH* đo nồng độ khác etanol bước sóng 517 nm Mối quan hệ A517 nồng độ DPPH* biểu diễn qua công thức: A517= 7003,3.CDPPH* + 0,0013 Như từ giá trị mật độ quang đo được, ta biết nồng độ DPPH* dung dịch 161 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM, ĐẠI HỌC HUẾ | HNKH 2019 3.2 Ảnh hưởng nồng độ thời gian đến khả bắt gốc DPPH* chất chống oxy hóa Bảng Mật độ quang (A517) thời gian nồng độ khác PHA Thời gian (phút) A517 (CPHA=5.10-5 M) A517 (CPHA=10-4 M) A517 (CPHA=10-3 M) A517 (CPHA=5.10-3 M) 0.580 1.000 1.500 2.000 2.500 3.000 3.500 0.460 0.459 0.460 0.459 0.459 0.459 0.459 0.445 0.442 0.439 0.436 0.434 0.432 0.430 0.413 0.410 0.405 0.400 0.398 0.395 0.392 0.091 0.093 0.092 0.092 0.092 0.092 0.092 4.000 0.459 0.429 0.389 0.092 4.500 5.000 5.500 6.000 6.500 7.000 7.500 8.000 8.500 9.000 9.500 10.000 10.500 15.000 20.000 25.000 30.000 0.459 0.459 0.458 0.458 0.458 0.458 0.458 0.458 0.458 0.457 0.457 0.457 0.457 0.456 0.455 0.454 0.453 0.427 0.426 0.425 0.425 0.424 0.423 0.422 0.422 0.421 0.421 0.421 0.420 0.420 0.418 0.416 0.415 0.415 0.386 0.384 0.381 0.378 0.374 0.370 0.367 0.365 0.361 0.359 0.357 0.354 0.352 0.333 0.316 0.304 0.294 0.092 0.092 0.092 0.092 0.092 0.092 0.092 0.092 0.092 0.092 0.092 0.092 0.092 0.092 0.092 0.092 0.092 40.000 45.000 50.000 0.453 0.452 0.452 0.413 0.412 0.411 0.279 0.274 0.270 0.092 0.092 0.092 Quan sát giá trị thu Bảng 1, nhận thấy nồng độ thấp PHA (5.10-5 M, 10-4 M), thời gian thay đổi, mật độ quang dung dịch thay đổi giảm dần theo thời gian Chứng tỏ số lượng gốc DPPH* bị dập tắt tăng Sau 50 phút, mật độ quang dường không thay đổi Chứng tỏ PHA bắt gốc DPPH* tối đa Ở nồng độ cao 5.10-3M, tốc độ phản ứng PHA nhanh, sau 1,5 phút, PHA phản ứng hoàn toàn với DPPH* Khác với PHA, giá trị mật độ quang A517 ASC thay đổi khoảng thời gian ngắn (0,58-2,5 phút) nhiều nồng độ khác (Bảng 2) Chứng tỏ tốc độ phản ứng axit ASC với gốc tự DPPH* nhanh Giá trị mật độ quang dung dịch phản ứng 162 KỶ YẾU HỘI NGHỊ KHOA HỌC SINH VIÊN | 12/2019 giảm đáng kể nồng độ ASC tăng lên Điều đồng nghĩa với lượng gốc DPPH* dung dịch bị giảm xuống Bảng Mật độ quang (A517) thời gian nồng độ khác ASC Thời gian (phút) A517 (CASC = 10-5 M) A517 (CASC=10-4 M) A517 (CASC=5.10-4 M) A517 (CASC=10-3 M) 0.58 1.5 0.446 0.446 0.445 0.447 0.447 0.447 0.301 0.298 0.250 0.036 0.026 0.026 0.445 0.447 0.206 0.026 2.5 3.5 4.5 0.445 0.445 0.445 0.445 0.445 0.445 0.447 0.447 0.447 0.447 0.447 0.447 0.206 0.206 0.206 0.206 0.206 0.206 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 3.3 Cơ chế đề xuất cho phản ứng chất chống oxy hóa DPPH* Hình Cơ chế đề xuất PHA DPPH* 163 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM, ĐẠI HỌC HUẾ | HNKH 2019 Cơ chế phản ứng PHA DPPH* đề xuất gồm ba hướng có khả xảy H1, H2 H3 (được biểu diễn Hình 2) Rõ ràng, gốc tự DPPH* thu nhận nguyên tử hydro liên kết O-H N-H, để tạo thành phân tử trung tính DPPHH Trong phản ứng H1, liên kết O-H bị phá vỡ, liên kết đơi với ngun tử N liền kề hình thành, kết từ định vị electron độc thân O Điều xảy phản ứng H2 Tuy nhiên phản ứng H3, cho liên tiếp hai nguyên tử hidro liên kết O-H N-H, tạo nên liên kết đôi N=O Và phân tử PHA phản ứng với nhiều gốc tự DPPH* Cơ chế phản ứng ASC với DPPH* tương tự PHA, nhiên cần lưu ý ASC có nhiều nhóm OH có khả cho ngun tử H Vì làm cho ASC có hoạt tính chống oxy hóa cao xét theo chế chuyển hidro phản ứng với gốc tự DPPH* 3.4 Mối liên hệ nồng độ (số gam chất chống oxi hóa/số kg DPPH*) % DPPH*còn lại trạng thái ổn định Bảng thể động học chất chống oxy hóa nồng độ khác nhau, chúng tn theo mơ hình tổng qt sau: ln[DPPH*cịn lại] = b thời gian + a, b hệ số góc a hệ số chắn Các hệ số tương quan cao thu Nồng độ cao, hệ số góc mơ hình lớn lượng DPPH* cịn lại thấp Do đó, độ dốc thơng số hữu ích để so sánh hành vi động học chất chống oxy hóa khác nồng độ Bảng Khảo sát yếu tố động hóa PHA ASC Chất khảo sát Nồng độ (số gam chất chống oxi hóa/số kg DPPH*) Hệ số góc (%DPPH*/phút) Hệ số tương quan (R2) %DPPH* lại trạng thái ổn định 5.375 -189.2 0.82 97.76 10.75 -52.26 0.97 88.87 107.5 -7.998 0.89 57.66 537.5 81.07 0.87 13.59 1.736 -0.07 0.90 96.67 17.36 -0.066 0.98 96.24 86.77 1.023 0.98 44.5 173.6 1.433 0.89 5.2 PHA ASC Nồng độ chất chống oxy hóa cần thiết để giảm 50% nồng độ DPPH* ban đầu (EC50) tham số sử dụng rộng rãi để đo khả chống oxy hóa Giá trị EC50 thấp, khả chống oxy hóa cao Giá trị EC50 PHA ASC 266,25 88,84 (Bảng 3.4) Giá trị EC50 axit ascorbic phù hợp với kết thu Sánchez-Moreno C cộng [8] Bảng Giá trị EC50 chất chống oxy hóa phân loại động học chúng Chất khảo sát EC50 Khoảng thời gian để nồng độ khảo sát đạt trạng thái ổn định (phút) TEC50 (phút) Phân loại PHA 266.25 0.5-55 35 Chậm ASC 88.84 0.58-2.5 1.2 Rất nhanh 164 KỶ YẾU HỘI NGHỊ KHOA HỌC SINH VIÊN | 12/2019 Trước đây, phân loại động học khả chống oxy hóa dựa thời gian đạt đến trạng thái ổn định công bố Brand-William cộng vào năm 1995 [3], nhiên họ lại không quan tâm đến thời gian trạng thái ổn định phụ thuộc vào nồng độ chất chống oxy hóa Sau Sánchez-Moreno C cộng đưa đại lượng TEC50 (thời gian cần thiết để đạt trạng thái ổn định nồng độ EC50) thông số để đánh giá khả chống oxi hóa hợp chất Dựa nghiên cứu C Sánchez-Moreno, thông số TEC50 đưa đánh giá báo (Bảng 4) Thông số nhận cách vẽ đồ thị mô tả ảnh hưởng thời gian trạng thái ổn định nồng độ chất chống oxy hóa (Hình 3) Thời gian trạng thái ổn định (phút) 70 60 50 40 30 20 10 0 100 200 300 400 Nồng độ (g chất chống oxi hóa/kg 500 600 DPPH•) (a) PHA Thời gian trạng thái ổn định (phút) 2.5 1.5 0.5 0 50 100 150 200 Nồng độ (g chất chống oxi hóa/kg DPPH•) (b) ASC Hình Xác định thời gian cần thiết để đạt đến trạng thái ổn định nồng độ EC50 (a) PHA (b) ASC Dựa giá trị TEC50, phân loại theo tính chất động học chất chống oxy hóa sau: < phút (nhanh), 5-30 phút (trung bình) lớn 30 phút (chậm) Hình minh họa biểu mặt động học chất chống oxy hóa nghiên cứu Phần trăm nồng độ DPPH* lại theo nồng độ hợp chất chống oxy hóa diễn tả theo phương trình sau: [DPPH*cịn lại]= a.[chất chống oxi hóa] + b Hệ số tương quan R2 0.999 cho PHA ASC 165 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM, ĐẠI HỌC HUẾ | HNKH 2019 Dựa phân loại Sánchez-Moreno C [8], (AE  x 10-3: chậm; x 10-3  AE  x 10-3: trung bình; x 10-3  AE  10-2: nhanh, AE >10-2: nhanh), AE axit ascorbic 9x10-3 chứng tỏ ASC chất bắt gốc nhanh Còn AE PHA 10-4 chứng tỏ chất bắt gốc chậm Phần trăm DPPH lại (%) 100 5,37 10,75 80 60 107,5 40 20 537,5 0 10 20 30 40 50 60 Thời gian (phút) (a) PHA 100 1,736 Phần trăm DPPH lại (%) 17,36 80 60 86,77 40 20 173,6 0 Thời gian (phút) (b) ASC Hình Phần trăm nồng độ DPPH* lại theo thời gian hai chất (a) PHA (b) ASC Bảng Hiệu suất bắt gốc tự chất chống oxy hóa Chất khảo sát PHA Hệ số tương quan 0.999 Hiệu suất bắt gốc tự (AE) 10-4 Phân loại Chậm ASC 0.999 9.10-3 Nhanh 166 KỶ YẾU HỘI NGHỊ KHOA HỌC SINH VIÊN | 12/2019 KẾT LUẬN Động học N-phenylhydroxylamine (PHA) axit ascorbic (ASC) phản ứng với gốc tự DPPH* khảo sát nghiên cứu khả chống oxy hóa chúng Từ kết nghiên cứu trên, rút kết luận sau: - AE cao axit ascobic lại thấp với PHA chứng tỏ axit ascorbic có khả chống oxy hóa vượt trội - N-phenylhydroxylamine có khả chống oxy hóa nhiên tốc độ bắt gốc chậm so với axit ascorbic Lời cảm ơn: Nghiên cứu tài trợ quỹ nghiên cứu khoa học đề tài cấp trường trường đại học sư phạm, đại học Huế năm 2019 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] Battin E E., Brumaghim J L (2009), Antioxidant activity of sulfur and selenium: a review of reactive oxygen species scavenging, glutathione peroxidase, and metal-binding antioxidant mechanisms, Cell Biochem Biophys., 55, 1, 1-23 Blois M S (1958), Antioxidant Determinations by the Use of a Stable Free Radical, Nature, 181, 1199 Brand-Williams W., Cuvelier M E., Berset C (1995), Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity, LWT, 28, 1, 25-30 Garcia E J., Oldoni T L C., Alencar S M., Reis A., Loguercio A D., Grande R H M (2012), Antioxidant activity by DPPH assay of potential solutions to be applied on bleached teeth, Brazilian Dental Journal, 23, 22-27 Kedare S B., Singh R P (2011), Genesis and development of DPPH method of antioxidant assay, J Food Sci Technol., 48, 4, 412-22 Klein E., Lukeš V., Cibulková Z., Polovková J (2006), Study of N–H, O–H, and S–H bond dissociation enthalpies and ionization potentials of substituted anilines, phenols, and thiophenols, J Mol Struct., 758, 2, 149-159 Polovka M., Brezova V., Stasko A (2003), Antioxidant properties of tea investigated by EPR spectroscopy, Biophys Chem., 106, 1, 39-56 Sánchez-Moreno C., Larrauri J A., Saura-Calixto F (1998), A procedure to measure the antiradical efficiency of polyphenols, J Sci Food Agric, 76, 2, 270-276 Wright J S., Johnson E R., DiLabio G A (2001), Predicting the Activity of Phenolic Antioxidants: Theoretical Method, Analysis of Substituent Effects, and Application to Major Families of Antioxidants, J Am Chem Soc., 123, 6, 1173-1183 167 ... học chất chống oxy hóa khác nồng độ Bảng Khảo sát yếu tố động hóa PHA ASC Chất khảo sát Nồng độ (số gam chất chống oxi hóa/ số kg DPPH* ) Hệ số góc ( %DPPH* /phút) Hệ số tương quan (R2) %DPPH* lại... axit ascorbic có khả chống oxy hóa vượt trội - N-phenylhydroxylamine có khả chống oxy hóa nhiên tốc độ bắt gốc chậm so với axit ascorbic Lời cảm ơn: Nghiên cứu tài trợ quỹ nghiên cứu khoa học đề... 12/2019 2.2 Phương pháp nghiên cứu Ảnh hưởng chất chống oxy hóa dựa khả bắt gốc DPPH* đánh giá theo quy trình Brand-William [3] 0,1 ml dung dịch etanol có nồng độ chất chống oxy hóa khác thêm