TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐHQGHN, KHTN & CN T.XXIII, s ố 1, 2007 NGHIÊN CỨU CÁC CHẤT ứ c CHẾ TRIPXIN (TI) VÀ KIMOTRIPXIN (KI) CỦA HẠT THANH LONG (HYLOCEREUS UNDATUS (Haw.) B ritto n & Rose) Hoàng Thu Hà, Phạm Thị Trân Châu Trung tăm Công nghệ S in h học, Đại học quốc gia H N ội Mở đầu Cây th a n h long trồ n g phổ biến nước ta cũ n g n h nước Đ ông N am Á khác Q th a n h long có tác d ụ n g giải n h iệt, lợi tiểu, n h u ậ n tr n g [2] P h ầ n ăn chứa 82 - 83% nưốc, g iầu v itam in c m ột sơ' v ita m in nhóm B [5] Công bố P erez 2005 [6] cho b iế t n h iề u p h ậ n th a n h long tro n g có q u ả cịn có tác dụng làm liền v ết th n g ỏ người bị tiể u đường T heo n h iề u tá c giả, c h ấ t ức c h ế p ro tein az có th ể có n h iều triể n vọng sử dụ n g làm thuốc ch ữ a n h iề u b ệ n h tro n g có bệnh liên q u an đến v ế t th n g p h ầ n m ềm T uy n h iên chư a có cơng b ố n vể c h ấ t ức c h ế p ro te in a z loại q u ả qu í giá P h ầ n ăn củ a q u ả bao gồm n h iều h t r ấ t nhỏ xen lẫn với th ịt quả, rấ t khó tách riêng, có lẽ chưa có nghiên cứu phân tích riê n g h t th a n h long Để tìm h iểu kỹ h o t c h ấ t củ a q u ả th a n h long, tiế n h n h tá c h riê n g h t khỏi th ịt n g h iê n cứu đ iều tr a sơ c h ấ t ức ch ế p ro te in a z h t Nguyên liệu Phương pháp - Q uả th a n h long chín tách h t, ho n g khô n h iệ t độ b ìn h thường, bảo q uản tù lạn h , d ù n g cho lầ n p h â n tích k hác n h au - Xác đ ịn h h m lượng c h ấ t khô tu y ệ t đối b ằn g cân S caltex - Xác đ ịn h p ro te in th eo phương p h áp B rađíord [1] - Xác đ ịn h h o t độ pro tein az: b ằn g phương ph áp k h u ếch tố n tr ê n đ ĩa th ạch (điểu tra sơ bộ) phương p h áp A nson cải tiế n [7] với c h ấ t cazein - Xác định h o ạt độ ức chế tripxin (TIA), kim otripxin (KIA) thực hiên theo h phương p h p trê n n h n g enzim ủ với d u n g dịch n g h iên cứu tro n g 10 p h ú t n hiệt độ phòng trước xác định hoạt độ mô tả trước [3] Công trinh hỗ trợ kinh phí Chương trinh NCCB, đề tài 621306 Chơ viết tắt: DC: dịch chiết; DCTL: dịch chiết hạt long; Đ1: đỉnh 1; Đ2: đĩnh 2; HĐR: hoạt độ riỏng; KI: chát ú t chí kimotripxin; KIA: hoạt ức chố kimotripxin; LC: dịch lên cột; PA: hoạt độ proteỉnaz; PAGE: điện di gd poliacrylamit; TL: long; TI: chất ức chố tripxin; TIA: hoạt độ ứd chế tripxỉn; Rm: độ dỉ động* 26 27 N g h itn cứu chất ức c h ế tripxin (TI) ■ - Đ iện di p ro te in th e o phương p h p L aem m li [4], gel 12,5% - Đ iện di đ ể p h t h iệ n trự c tiếp p ro tein az, c h ấ t ức c h ế proteinaz: gel 12,5% đồng trù n g hợp với casein , nồn g độ casein tro n g gel 0,1%, đ iện di khơ n g có SDS, khơng có ch ất khử, m ẫ u k h ô n g xử lý n h iệt K ết q u ả th ả o lu ậ n K ết q uả p h â n tích sơ th a n h long cho th ấ y Protein (mg) Trọng lượng qua (kg) Phần ăn (gam) Dịch thu (ml) Trọng lượng hạt (gam) s-f] hat 670 470(,) 10,8 328,3 301,4 (,) dịch ép n h ậ n từ p h ầ n th ịt q u ả (670g) bỏ h t (viết t ắ t 8-fj) K ết q u ả tr ê n cho th ấ y h t chiếm k h o ản g 1,6% trọ n g lượng p h ầ n ă n q u ả n h n g p ro te in củ a h t đ t k h o ản g g ần 92% p ro te in s-fj N goài ra, k h i p h â n tích dịch ép t h ị t q u ả cũ n g k h ô n g p h t h iện p ro te in a z, h o t độ ức c h ế trip x in (TIA) n h h o t độ ức c h ế k im o trip x in (KIA) Vì vậy, c h ú n g tơi tiế n h n h n g h iên cứu với h t th a n h long 3.1 Hàm lượng protein, hoạt độ ức c h ế trypxin (TIA) kimotripxin (KIA) củ a h ạt th a n h lo n g c h iế t d u n g d ịch đệm k h ác Đ ể lựa chọn d u n g dịch c h iế t c h ấ t ức c h ế try p x in (TI), k im o trip x in (KI), s d ụ n g loại d u n g dịch khác n h a u để ch iết r ú t K ết q u ả trê n b ả n g cho th sử d ụ n g nước M ili Q h a y d u n g dịch a x it axetic 0,005 M, TIA tổ n g 8ố cũ n g n h KLA tổng 80 tro n g d ịch c h iế t n y cao k h i sử d ụ n g d u n g dịch khác D ung dịch đệm S o ren sen c h iế t r ú t n h iểu p ro tein n h ấ t, n h n g TLA, KIA đểu th ấ p 80 với dịch c h iế t b ằ n g nước h a y b ằ n g a x it axetic Do đó, h o t độ riê n g dịch ch iết b ằn g đệm S o ren sen th ấ p h n k h i sử d ụ n g d u n g dịch khác Vì vậy, để tin h TI K3 cùa h t th a n h long có th ể d n g nưỏc M ili Q d u n g dịch a axetic 0,005M Bảng So sánh cầc loại dung d|ch khác dùng đ i c h iít TI vè KI từ hạt long TIA STT Dung dịch dùng để chiết rút Nước Mili Q Đêm Sorensen 1/15M pH 6.5 Protein (mg/100 gam hạt) KIA Hoat độ tổng số (IU/100g hạt) HĐR miu/mg protein Hoạt đô tổng số (IU/100g hạt) miu/mg 2831 872,6 237,10 227,9 80,51 4290 695,8 162,19 255,9 59,65 HĐR protein Đệm natri axetat 0.Ò2M pH 4,5 2925 626,2 214,10 188,9 64,58 Axit axetic 0.005M 3315 872,6 202,48 236,9 72,05 T jp c h í Klu>a học D H Q G H N K H T N & C N T J ữ ll, S à I 0 H oàng Thu Hà, Phạm Thị Trân Châiu 28 T heo k ế t q u ả n g h iên cứu củ a ch ú n g tôi, h m lượng c h ấ t k h ô củ a h t th a n h long l;à 91% đó, n ếu tín h h m lượng p ro te in trê n c h ấ t khô b ằ n g 3,1% 3.2 So sán h p hổ đ iện di p rotein củ a loại d ịch c h iế t Hình Phổ đỉện di proteỉn hạt long (TlL) dung dịch chiết khác Nước Mili Q Dung dịch đệm Sorensen 1/15M pH 6,5 Dung dịch đệm Natri axeỉat f02M pH 4,5 Dung dịch axit axetic 0.005M (ghi dùng cho hình 3) Hlnh Phổ điện di PA hạt TL dung dịch chiết khác Hình Phổ điện di TIA hạt TL dung dịch chiết kháo Để so sá n h tiế p k h ả n ă n g c h iế t r ú t p ro te in d u n g dịch trê n , tiế n h n h điện di p ro tein có tro n g loại d u n g dịch trê n K ết q u ả trê n h ìn h cho th ấ y phổ điện di p ro te in củ a d u n g dịch tư ờng tự n h a u 3.3 So sán h p hổ đ iện di PA* TI, KI củ a lo i d ịch c h iế t Sử d ụ n g phư ơng p h p đ iện di trê n gel p o ly acrilam it 12,5% đồng tr ù n g hợp với c h ấ t cazein 0,1% phư ơng p h p n h ạy , cho phép p h t h iệ n trự c tiế p p ro te in a z, c h ấ t ức c h ế p ro te in a z từ dịch c h iế t n g u y ên liệu m không c ầ n p h ả i tin h S au điện di, giữ gel tro n g đ iều k iệ n th ích hợp, vị tr í có p ro te in a z , ca se in tro n g gel bị p h ân giải, gel k h ông b ắ t m ầ u k h i n h u ộ m với Coom asie B lue, tạ o th n h n h ữ n g b ă n g sán g trê n n ề n gel m ầu đậm K ết q u ả trê n h ìn h cho th ấ y tấ t loại dịch c h iế t đ ều có m ột b ăng sáng, ng tỏ h t th a n h long có proteinaz T p c h i K h o a h ọ c Đ H Q G H N , K H T N ả C N , T X Q Ì Ì S ổ ì 2007 29 Nghiên cứu chất ức ch ế tripxin ( T I ) Đ iện di T I có tro n g dịch ch iết (hình 3) p h t h iệ n b ăn g TI (băng m àu đậm gel): b ă n g c h ín h có độ di động (Rm) » 0,97, b ă n g nhỏ có R m w 0,53 Điểu n ày ch ứ n g tỏ p h ầ n lớn T I h t th a n h long có th ể có tín h a x it có khơi lượng p h ân tử th ấ p K ết q u ả đ iện di song song vối p ro tein c h u ẩ n (khơng trìn h bày đây) cho th ấ y b ăn g T I/K I ch ín h có khối lượng p h â n tử th ấ p hơ n 14,4 kD Đ iện di KI c ũ n g n h ậ n phổ đ iện di tư ơng tự với phổ điện di TI T k ế t q u ả trê n , tro n g th í nghiệm tiếp th eo ch ú n g đ ã sử dụ n g nước M ili Q để ch iết r ú t T I KI củ a h t th a n h long, vừa đơn g iản rẻ tiền 3.4 S ắc ký qua c ộ t S ep h a d ex G-25 Để sơ tá c h từ n g p h ầ n p ro tein dịch ch iết, đ ã tiế n h n h sắc ký qua cột S ephad ex G-25 C â n b ằ n g cột c h iế t r ú t p ro tein b ằ n g d u n g dịch a x it axetic 0.005M , pH 4,5 Xác đ ịn h p ro te in tro n g p h â n đoạn th u b ằ n g phư ơng p h áp B radíord, n h ận đ ỉn h p ro te in (h ìn h 4), ký h iệu Đ l Đ2 th e o th ứ tự r ú t xuống cột OD595nm •protein xuống CỘI Thể tích rút (ml) khơng kể 20ml ban đáu Hlnh Sắc kỷ mẫu TL qua cột Sephadex G-25 Kích thước cột: 1,2x55cm ; vận tốc 17ml/h ; thể tích mỗỉ phân đoạn 1ml — ♦— proteỉn: (xác định thớo Bradíord) Đ I đ ĩn h c h ín h (bảng 2), có th ể tích r ú t 38m l (tương đương Ve riòonucleaz); Ve c ủ a Đ2 54m l (trước m uối llm l) N h v ậy Đ2 có th ể p ro tein /p o ly p ep tit có khơi lượng p h â n tử th ấ p Đ l K ết q u ả trê n b ả n g cho th ấ y TTA củ a Đ I gấp h n lầ n TIA Đ2 T uy n h iên , tổ n g TIA đ ỉn h Đ I Đ2 Tẹo c h i K h o a học D H Q G H N , K H T N & C N TX X H Ị S ổ ỉ , 0 Hoàng Thu Hà, Phạm Thị Trán Chiâu 30 b ằn g 73,1% TIA củ a dịch lên cột, h o t độ riê n g đ ỉn h Đ I D bị giảm so với dịch lên cột P h ả i ch ăn g TI h t th a n h long k h ông b ền ? H o ạt đ ộ ức c h ế k im o trip x in lại k h ô n g bị giảm tậ p tru n g Đ l: KIA củ a Đ I chiêm đên 98'% KIA dịch lên cột, gấp k h o ản g 10,8 lầ n KIA Đ2; h o t độ riê n g củ a đ ỉn h n ày t ă n g lên gần 1,6 lầ n so với dịch lên cột N hư vậy, để tin h KI từ h t th a n h long c ầ n th u Đ l Đ iện di p ro te in củ a đ ỉn h đ ỉn h cho th ấ y b ă n g p ro te in có R m = 0,97 chiếm tỉ lệ lớn (h ìn h 5) Đ iện di T I (h ìn h 6) ng tỏ b ă n g p ro te in với R m = 0,97 có h o t tín h lức chê trip x in Đ iện di KI (h ìn h 7) p h t h iện Đ I Đ2 có b ă n g KI với Rm = 0,97, b ă n g này, Đ2 cịn có th ê m băn g K I n h ỏ với R m =0,53, giông với D»c lên cột (cột 1, h ìn h 7) Bảng Tóm tắt kết sắc ký dịch chỉất hạt long qua cộ t Sephadex G-25 Prolein mg % miu % 100 20 592 100 Mau Dich chiết hat 81,60 t L đả cô đặc TIA HĐR miu/mg protein Số lần tinh m iu % 252,35 488 100 KIA HĐR miu/mg protein Số lần tinih 42,74 Sau qua cột Sephadex G25 Đỉnh 51,00 62.5 11 494 55,8 225.37 0,893 425 98,2 67,15 1,57 Đỉnh 30,30 37.5 577 17,3 116,89 0,463 316 9.0 10,33 0,24 Hỉnh Phổ điện di protein DCTL qua cột G25 1.DC lên c ộ t; 01 ; Đ2 ; Hỉnh Phổ điện di TIA DCTL qua cột G25 1.DC lên cộ t; Đ1 ; Đ2 ; DC lên cột pha loăng DC lên cột pha lỗng T p c h í K h o a h ọ c Đ tìQ G H N , K tì T N & C N , TJO ữH S ố ỉ , 2007 31 Nghiẽn cứu chát ức ch ế tripxin ( T I ) Rm ỊgyịTv 1■ , 1'^ •ỈKỈàĐaSĨÉÌÌsẫ&kL'' I t e S " '" jv '■■uysị M nL' ■ K IA ị B i _J k ia V #-> ỵ, ' k ' y H H B H B H l (0,53)W :• KV I in n i ■■11 ■V 1, - t (0,97) H ai-; Hinh Phổ diện di KIA DCTL qua cột G25 1.LC ; Đ1 ; Đ2 Hinh Đ1 DCTL qua cột G25 ức chế sinh trưỏng Pseudomonas aeruginosa K ết q u ả kiểm tr a h o t tín h k h n g k h u ẩ n (hình 8) cho th : ngồi h o t tín h ức c h ế trip x in , k im o trip x in , Đ l cịn có tác d ụ n g ức c h ế s in h trư n g P seudom onas aeruginosa p h â n lậ p từ m ủ v ế t thư ơng bỏng b ện h n h â n K ết lu â n - H àm lượng p ro te in hòa ta n h t th a n h long vào k h o ản g 3% châ't khô h t - H t th a n h long có p ro te in a z c h ấ t ức c h ế trip x in (T I), k im o trip x in (KI) Để ch iết r ú t TI, KI từ h t th a n h long tiếp tục tin h 8ạch, n ê n d ù n g d u n g dịch a x it axetic 0,005M nước M iliQ - P h ổ điện di T I, KI củ a dịch ch iế t từ h t th a n h long k h giống n h a u số băng, độ di động n h tỉ lệ giữ a băng: có b ă n g T I/K I, b ăn g ch ín h có độ di động n h a n h với Rm = 0,97; b ă n g p h ụ có độ di động vào k h o ả n g 0,53 - Sắc ký q u a cột S ep h ad ex G-25 n h ậ n đ ỉn h p ro te in (xác đ ịn h theo B radíord), đ ỉn h (Đ l) đ ỉn h chính, có TIA gấp lầ n KIA gấp k h o ản g 10,6 lầ n đỉnh (Đ2) - Đ l cịn có h o t tín h ức c h ế sin h trư ng P seudom onas aeruginosa p h â n lập từ mù v ế t th n g bỏn g b ện h n h ân Tạp c h i K h o a h ọ c D H Q G H N K H T N & C N Txau S ố l / '07 32 Hoàng Thu Hà, Phạm Thị Trân C hau TÀI LIỆU THAM KHẢO B d íị r d M M , A r a p id a n d s e n s itiv e M e th o d fo r t h e q u a n t i t a t i o n o f m ic ro g m q u a n t i t i e s of protein ultilizing the principle of protein - dye binding, Anal Biochem 1976, 72: 248-253 Đỗ H Bích, Đặng Q Chung, Bùi X Chương, Nuyễn T Dong, Đỗ T Đàm, Phạm V Hiển, V ũ N L ộ, P h m D M a i, P h m K M ã n , Đ o n T N h u , N g u y ễ n T ậ p , T r ầ n T o n , C â y th u ố c động vật làm thuốc Việt N am , NXB Khoa học & Kỷ thuật, Hà Nội 2004, Tập II, 1256 tr a n g , p p -8 H o àn g T h u H à, P h m T h ị T râ n C h â u , M ột s ố th n h p h ầ n hó a s in h h o t tín h s in h học dịch ép từ th ịt mướp đắng (Momordica charantia L.), Tạp chí Sinh học V.28, NOI (2 0 ), p p -8 Laemmli U.K., Cleavage of structure proteins during assembly of the head of bacteriophage T4 Nature 227(1970), p 341-349 Morton, Julia F., Miami, FL Morton, J 1987 In: Fruits o f wam climates Strawberry Pear p 347 - 348 P e r e z G R M , V a r g a s S R ,O rtiz H Y D , W o u n d h e a lin g p r o p e r tie s o f H y lo c e re u s u n d a t u s o n d ia b e te s , P h y to th e r a p y R e s e a rc h V 19, N (2 0 ), p 6 -6 Pietrowa J.s., Wincjunajte M M.f Opredelenie proteolyticheskoi aktivnosti fermentnykh p r e p a r a to m ic r o b io lo g ic h e s k o v o p r o is k h o z h d e n ỉe , P r i k l a d B io c h e m M ik ro b io l., (1 6 ), p - ( tiế n g N g a) VNU JOURNAL OF SCIEN CE, Nat., Sci., & Tech., T.XXI1I, NọỊ, 2007 STUDY ON TRYPSIN INHIBITOR (TI) AND CHYMOTRYPSIN INHIBITOR (KI) FROM SEEDS OF BLƯE DRAGON (HYLOCEREUS UNDATUS (Haw.) B ritton & Rose) Hoang Thu Ha, Pham Thi Tran Chau C enter fo r Biotechnology, V ietnam N a tio n a l U niưersity, H anoi Blue d ragon (or s tra w b e rry pear) p la n ts have b e e n w idely p la n te d in V iet Nam an d o th e r co u n tries of S o u th E a st A sian region T h e ir fru it juice h a s been enjoyed as a cool d rink M oreover, th e w ound h ealin g p ro p erties of fru it pulp have also been found recently H ence, it is w o rth y to in v estig ate biochem ical com ponents of th is fru its In th is work, we focused on try p sin an d chym otrypsin in h ib ito rs of seeds s e p a te d frcm edible p ortion of íru its T p c h i K h o a h ọ c Đ H Q G H N , K tìT N & C N , T.XXIII, S ô '1 ,2 (0 33 Nghiên cứu chấl ức chế tripxin ( T I ) T he o b tain ed re su lts in d icated th a t soluble p ro te in s c o n ten t of th e seeds w as aro u n d 3% of d ry su b sta n c e s of seeds By u sin g sev e l m ethods docum ented th a t H u n d a tu s seeds co n ta in in g p ro tein ase, try p sin in h ib ito rs an d ch y m o try p sin inhibitors, w hich could be e x tra c te d by e ith e r Mili Q w ater, or acetic acid 0.005M , S orensen b u íĩer pH 6.5, n a tr i a c e ta te b u íĩe r pH 4.5 T he to ta l an d speciíic in h ib ito ry activ ity in th e fĩrst two e x tra c t so lu tio n s w ere h ig h er th a n those of th e la te r ones H owever, th e electro p h o retic p a tte r n s of pro tein , PA, T I an d KI from th e se seed e x tra c ts w ere th e r sim ilar: One PA b an d an d two in h ib ito r b a n d s on polyacrylam ide gel copolym erized w ith casein w ere detected T he m obility (Rm) of th e m ajor TI/KI ban d w as a ro u n d 0.97 an d th a t of th e m inor TI/K I w as a ro u n d 0.53 By íra c tio n a tin g seed aq u eo u s e x tra c t on S ep h ad ex G-25 colum n, two protein peaks w ere o b tain ed , d esig n a te d as D l a n d D2 B oth of th em exhibited inhibitory activity a g a in s t try p sin (TIA) an d chym otrypsin (KIA) M oreover, in h ib ito ry activity co n cen trated on p eak 1: TIA an d KIA of D l w ere h ig h e r th a n th o se of D2 three- an d teníold, respectively I t 18 in te re ste d th a t D l also in h ib ited grow th of Pseudom onas aeruginosa iso lated from pus of p a tie n t’s infected b u rn w ound T ip c h i K hoa h ọ c D H Q G H N K IỈT N & C N T XXIII Sứ' 0 ... ức c h ế trip x in (TIA) n h h o t độ ức c h ế k im o trip x in (KIA) Vì vậy, c h ú n g ti? ?? n h n h n g h iên cứu với h t th a n h long 3.1 Hàm lượng protein, hoạt độ ức c h ế trypxin (TIA) kimotripxin. .. khác Vì vậy, để tin h TI K3 cùa h t th a n h long có th ể d n g nưỏc M ili Q d u n g dịch a axetic 0,005M Bảng So sánh cầc loại dung d|ch khác dùng đ i c h iít TI vè KI từ hạt long TIA STT Dung... a n h long có p ro te in a z c h ấ t ức c h ế trip x in (T I), k im o trip x in (KI) Để ch iết r ú t TI, KI từ h t th a n h long ti? ??p tục tin h 8ạch, n ê n d ù n g d u n g dịch a x it axetic 0,005M