Kết quả nghiên cứu in silico trên Candida albicans- 123docz.net

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.3. Kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm in silico của một số thành phần hóa học chính trong các mẫu tinh dầu

3.3.2. Kết quả nghiên cứu in silico trên Candida albicans

3.3.2.1. Kết quả phân tích dự đoán protein quan trọng của Candida albicans Dựa trên cơ sở dữ liệu tương tác protein STRING (https://string-db.org/), mạng lưới tương tác protein-protein được xây dựng từ 292 protein quan trọng không tương đồng với protein người được thu thập từ các nghiên cứu trước đó [39]. Tương tác giữa các protein được phân làm 3 nhóm: (1) các tương tác đã được kiểm chứng, (2) các tương tác dự đoán dựa trên các phương pháp toán học, và (3) một số loại tương tác khác. Mạng được xây dựng cho các nút với tương tác có độ tin cậy cao, tức giá trị điểm tương tác tối thiểu (minimum required interaction score) ≥ 0.7 . Kết quả tạo được mạng PPIN có 140 nút và 707 cạnh như hình 3.8.

Hình 3.8. Mạng lưới tương tác protein (PPIN) của các gen quan trọng trên Candida albicans

Chú thích: Mỗi chấm tròn trên hình đại diện cho một protein với mã gen tương ứng hoặc mã Uniprot với những protein chưa có tên thông dụng. Kích thước các nút thể hiện bậc, màu sắc thể hiện độ trung tâm, độ dày cạnh thể hiện độ gần của nút.

Các nút trong mạng được phân tích 3 tham số: Bậc, Độ trung tâm, Độ gần thông qua Plug-in CytoNCA. Lựa chọn 100 protein có giá trị lớn nhất về mỗi tham số trên thu được 3 tập hợp protein tiềm năng. Xác định giao của 3 tập hợp ta thu được 82 protein trung tâm như biểu đồ ven hình 3.9. Danh sách 82 protein trung tâm được trình bày trong phụ lục 10.

Hình 3.9. Biểu đồ Venn phân tích các tham số trong mạng tương tác protein của Candida albicans

Thực hiện phân tích cụm (cluster) bằng thuật toán MCODE và trực quan hóa trong phần mềm Cytoscape. Từ đó xác định được 5 cụm từ 82 đích trung tâm.

Kết quả phân tích cụm (MCODE) các protein trung tâm trong mạng tương tác protein của C. albicans được trình bày tại phụ lục 11.

Để hiểu rõ hơn về chức năng của các đích phân tử, phân tích chú giải chức năng gen GO (Gene Ontology) của 82 protein trung tâm được tiến hành. Kết quả phân tích chức năng phân tử (molecular function), thành phần tế bào (cellular component) và các quá trình sinh học (biological process) được trình bày tại phụ lục 12.

Phân tích chức năng phân tử (molecular function) cho thấy các gen trung tâm chủ yếu liên quan đến chức năng protein liên kết sợi đơn ADN, carbon-carbon lyases, protein liên kết kẽm, hoạt tính methyltransferase, hoạt tính lyase, protein liên kết với kim loại chuyển tiếp… từ đó có thể thấy, các protein trung tâm của mạng lưới đóng vai trò quan trọng trong hầu hết các quá trính sinh học của nấm C. albicans như quá trình sao chép ADN hay enzym xúc tác cho các phản ứng chuyển hóa quan trọng.

Phân tích thành phần tế bào (cellular component), các protein trung tâm đóng các vai trò như protein kinetochore, thành phần màng ngoài ty thể, thành phần của phức hợp ERMES, phức hợp DASH… những protein này là những protein thiết yếu của nhóm nấm men, chúng điều hòa quá trình phân bào và trao đổi chất của tế bào.

Đối với phân tích quá trình sinh học (biological process), đa số các gen liên quan đến quá trình lưới nội chất-ty thể, duy trì bộ gen ty thể, gắn các vi ống vào kinetochore, vận chuyển photpholipid, vận chuyển lipid,… đều là những quá trình sinh học sống còn đối với tế bào vi sinh vật.

Bên cạnh phân tích làm giàu GO, phân tích con đường sinh học KEGG pathway cũng cho thấy chức năng sinh học của các đích trung tâm. Kết quả của phân tích này thu được danh mục các gen liên quan đến các con đường chuyển hóa quan trọng của Candida albicans (phụ lục 13).

Từ kết quả phân tích con đường KEGG, cho thấy đa phần các gen được tìm thấy liên quan đến 4 con đường chủ yếu: (1) Cấu trúc Ribosome, (2) Quá trình

phosphoryl hóa oxy hóa, (3) Sinh tổng hợp acid amin thơm, (4) Sinh tổng hợp các acid amin. Hình ảnh mô tả 4 con đường này được trình bày tại phụ lục 13.

Từ các kết quả phân tích cụm, phân tích làm giàu GO và KEGG pathway, lựa chọn ra các đích tác dụng tiềm năng là những protein đã có cấu trúc tinh thể được xác thực trên cơ sở dữ liệu Protein Data Bank (PDB: https://www.rcsb.org/) thu được 3 đích tác dụng tiềm năng trong mạng lưới protein, đó là: ARO1, MET6 và FBA1. Đặc điểm các đích phân tử được thể hiện trong bảng 3.7. Những đích tiềm năng này được sử dụng để nghiên cứu docking phân tử với các thành phần chính của các tinh dầu.

Bảng 3.7. Các đích tác dụng tiềm năng trên Candida albicans

Mã gen Tên protein Chức năng

sinh học

Mã PDB

ARO1 Pentafunctional AROM polypeptide

Sinh tổng hợp amino acid

thơm

7TBU, 6C5C, 7TBV MET6 5-methyltetrahydropteroyltriglutamate--

homocysteine methyltransferase

Sinh tổng hợp amino acid methionine

3PPC FBA1 Fructose-bisphosphate aldolase Sinh tổng hợp

amino acid 6LNK 3.3.2.2. Kết quả docking phân tử trên Candida albicans

Kết quả docking phân tử của 11 hợp chất thành phần chính trong 3 mẫu tinh dầu với 4 đích tác dụng tiềm năng trên C. albicans được thể hiện qua năng lượng liên kết được trình bày trong hình 3.10 và phụ lục 14, 15.

Kết quả docking phân tử cho thấy các hợp chất chính trong 3 mẫu tinh dầu đều có khả năng liên kết với các đích tác dụng tiềm năng của Candida albicans với năng lượng tự do liên kết âm. Trong các đích tác dụng tiềm năng thì ARO1 và MET6 có năng lượng liên kết thấp nhất với các hợp chất chính trong tinh dầu.

Trong đó ARO1 là một đa enzym (multi-enzyme) với 4 miền hoạt động trên Candida albicans là ARO1epsps, ARO1dhqs, ARO1sk, ARO1dhsd, trong số đó

ARO1epsps cho kết quả điểm số docking tốt nhất. Hai hợp chất trans- sesquisabinen hydrat (tinh dầu P. pierrei ) và 4-allyl-1,2-diacetoxybenzen (tinh dầu P. betle) cho thấy khả năng tương tác tốt nhất với vị trí hoạt động ARO1epsps;

hai hợp chất trong tinh dầu P. betle là 4-allyl-1,2-diacetoxybenzene và chavicol acetat có khả năng tương tác tốt với protein MET6, điều đó được thể hiện qua năng lượng liên kết và những tương tác tạo được với trung tâm hoạt động.

Tinh dầu

Hợp chất

ARO1 epsps

ARO1 dhqs

ARO1 sk

ARO1

dhsd MET6 FBA1 LD36

1 2 3

4 5 6 7 8

DN8

1 9 10

3 8 11

Hình 3.10. Biểu đồ nhiệt thể hiện năng lượng liên kết được tính toán từ kết quả docking phân tử của các hợp chất chính trong tinh dầu với các đích tác

dụng tiềm năng trên Candida albicans

Chú thích: Màu đỏ thế hiện giá trị năng lượng liên kết thấp hơn (ái lực tốt), màu xanh thể hiện giá trí năng lượng liên kết cao hơn (ái lực kém), màu vàng cam là trung gian.

Các hợp chất: (1) – β-pinen, (2) – sabinen, (3) – α-pinen, (4) – 3-allyl-6- methoxyphenyl acetat, (5) – 4-allyl-1,2-diacetoxybenzen, (6) – chavicol acetat, (7) – eugenol, (8) – caryophyllen, (9) – linalool, (10) – trans-sesquisabinen hydrat, (11) – D-limonen.

Hình 3.11. Hình ảnh 3D và 2D mô phỏng tương tác của 2 hợp chất có ái lực cao nhất trên miền hoạt động ARO1epsps của protein ARO1

Chú thích: Màu vàng: 4-allyl-1,2-diacetoxybenzen, màu cam: trans- sesquisabinen hydrat

Hình 3.12. Hình ảnh 3D và 2D mô phỏng tương tác của 2 hợp chất có ái lực cao nhất tại trung tâm hoạt động của protein MET6

Chú thích: Màu vàng: 4-allyl-1,2-diacetoxybenzen, màu xanh dương:

chavicol acetat