Chương 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.3. Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm in silico của một số thành phần hóa học chính trong các mẫu tinh dầu
2.3.3.1. Phân tích dự đoán protein quan trọng của S. aureus và C. albicans - Bước 1: Thu thập và xử lý cơ sở dữ liệu
+ Dữ liệu gen quan trọng của S. aureus:
Từ ngân hàng dữ liệu DEG (https://tubic.org/deg/public/index.php/index), tìm kiếm và thu thập 351 gen quan trọng của vi khuẩn.
Sau đó, sử dụng công cụ BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) để lọc ra các protein không tương đồng với vật chủ (người) của S. aureus, thu được 257 protein quan trọng không tương đồng.
+ Dữ liệu gen quan trọng của C. albicans:
Thu thập 292 protein quan trọng của C. albicans không tương đồng với protein người từ các nghiên cứu trước đó [39].
- Bước 2: Xây dựng và phân tích mạng tương tác protein PPIN
Bước này nhằm xác định các gen trung tâm trong mạng lưới sinh học của vi sinh vật. Sử dụng cơ sở dữ liệu STRING (https://string-db.org/), thu thập thông tin tương tác giữa các protein quan trọng. Lưu lại dữ liệu tương tác rồi sử dụng Cytoscape để trực quan hóa mạng tương tác protein. Sử dụng Plug-in CytoNCA để xác định top các protein trung tâm (các protein có mức độ liên kết cao), dựa vào 3 thông số: bậc, độ trung tâm, độ gần. Lựa chọn 100 protein có giá trị lớn nhất về mỗi tham số trên thu được 3 tập hợp protein tiềm năng. Xác định giao của 3 tập hợp bằng biểu đồ Venn, thu được các đích trung tâm.
- Bước 3: Phân tích phân cụm, phân tích làm giàu GO và con đường sinh học KEGG pathway.
30
Sử dụng MCODE plug-in để phân tích phân cụm. Sử dụng công cụ ShinyGO (http://bioinformatics.sdstate.edu/go/) để xác định chức năng của các protein, ngoài ra sử dụng công cụ KEGG Pathway để xác định con đường sinh học mà các protein tham gia vào (https://www.genome.jp/kegg/pathway.html).
2.3.3.2. Sàng lọc hoạt chất có tác dụng trên đích đã chọn bằng phương pháp Docking phân tử
- Bước 1: Chuẩn bị cấu trúc của các hợp chất chính trong tinh dầu
Cấu trúc hóa học của các thành phần chính trong tinh dầu được tải xuống từ cơ sở dữ liệu Pubchem, sau đó đưa vào phần mềm MOE để tối thiểu hóa năng lượng, cài đặt trường lực AM1-BCC phù hợp.
- Bước 2: Chuẩn bị protein
Các protein có cấu trúc tinh thể được xác định bằng phương pháp nhiễu xạ tia X với chất lượng tương đối tốt được lựa chọn để tiến hành docking phân tử.
Cấu trúc tinh thể của protein được tải xuống từ cơ sở dữ liệu Protein Data Bank, https://www.wwpdb.org/) và đưa vào phần mềm MOE để tinh chỉnh cấu trúc protein. Quá trình xác định trạng thái proton được tiến hành, tiếp theo là xác định túi liên kết của protein. Trung tâm hoạt động sẽ được tách riêng phục vụ cho quá trình chạy docking.
- Bước 3: Mô phỏng docking
Năng lượng liên kết tự do (free binding energy) tính bởi hàm affinity được sử dụng làm tiêu chí đánh giá mức độ gắn kết với đích phân tử. Đây là một hàm mô tả các thay đổi năng lượng liên kết tự do (dG, kcal/mol) xảy ra khi phối tử (ligand) tương tác với protein. Hàm affinity bao gồm 4 yếu tố: năng lượng liên kết hydro giữa protein – ligand (external HB), năng lượng liên kết van der Waals giữa protein-ligand (external VDW), năng lượng van der Waals nội phân tử ligand (internal VDW) và năng lượng biến dạng xoắn của ligand (internal strain torsion).
Cuối cùng, 10 cấu dạng có năng lượng thấp nhất của mỗi cấu tử sẽ được
31 lưu lại và phân tích các tương tác.
2.3.3.3. Dự đoán thông số hóa lý, ADMET của các thành phần hóa học chính trong các mẫu tinh dầu
Dự đoán ADMET nhằm mục đích dự đoán các quá trình dược động học và độc tính của hợp chất trong cơ thể, để đánh giá tiềm năng trở thành thuốc của các hợp chất chiếm hàm lượng lớn trong các mẫu tinh dầu.
Các thông số hóa lý liên quan đến đặc tính “giống thuốc” (drug-likeness) bao gồm khối lượng phân tử MW (molecular weight), logP (hệ số phân bố Octanol – nước), logS (hệ số tan), TPSA (Topological polar surface area – Diện tích bề mặt phân cực), số nguyên tố đóng vai trò cho (donor) và nhận (acceptor) trong liên kết hydro, số liên kết linh động được tính toán và so sánh với các quy tắc giống thuốc của Lipinski, sinh khả dụng của Veber.
Các thông số ADMET được tính toán dựa trên các mô hình liên quan định lượng cấu trúc – tác dụng sinh học (Quantitative structure-Activity Relationship, QSAR) đã được phát triển và tích hợp trong các công cụ trực tuyến, được thiết kế một cách đơn giản, thân thiện và dễ sử dụng bao gồm SwissADME và ADMETlab 2.0.
Hai bộ công cụ này tích hợp hơn 210000 dữ liệu liên quan đến hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ, độc tính (ADMET) của hơn 96000 hợp chất. Các mô hình liên quan giữa cấu trúc và các thông số ADMET như tính thấm qua hàng rào máu não (blood brain barrier- BBB), tính thấm qua màng ruột, khả năng tương tác với một số enzym gan như CYP450 2C9, CYP 3A4, độc tính cấp trên mô hình chuột cống.
Việc tính toán thông qua cấu dạng SMILES (Simplified Molecular Input Line Entry Specification) - là dạng cấu trúc phân tử số hóa dưới dạng ký tự ASCII.
SMILES được sử dụng khá rộng rãi trong danh pháp hóa học và định dạng cấu trúc dữ liệu trên máy tính. Công thức SMILES của các phối tử được tải về từ cơ sở dữ liệu Pubchem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) và dùng làm dữ liệu đầu
32
vào cho công cụ SwissADME (http://www.swissadme.ch/index.php) và ADMETlab 2.0 (https://admetmesh.scbdd.com/).
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm in silico của một số thành phần hóa học chính trong các mẫu tinh dầu
33