Nghiên cứu tác dụng ức chế PTP1B in vitro của cao và một số chất phân lập từ dịch ép thân cây chuối tiêu (musa paradisiaca l )

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HUYỀN 1101229 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ỨC CHẾ PTP1B IN VITRO CỦA CAO VÀ MỘT SỐ CHẤT PHÂN LẬP TỪ DỊCH ÉP THÂN CÂY CHUỐI TIÊU MUSA PARADISIACA L... Tron

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HUYỀN

1101229 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ỨC CHẾ PTP1B

IN VITRO CỦA CAO VÀ MỘT SỐ CHẤT PHÂN LẬP TỪ DỊCH ÉP THÂN CÂY

CHUỐI TIÊU (MUSA PARADISIACA L.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

CHUỐI TIÊU (MUSA PARADISIACA L.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016

Người hướng dẫn:

1 PGS.TS Phùng Thanh Hương

2 NCS Ths Nguyễn Thị Đông

Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa sinh

- Trường Đại học Dược Hà Nội

LỜI CẢM ƠN

Với tấm lòng biết ơn sâu sắc nhất, trước tiên em xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể thầy cô giáo và các anh chị trong bộ môn Hóa Sinh, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho em trong quá trình thực hiện đề tài

Em xin cảm ơn người thầy trực tiếp dìu dắt em trong những bước đầu làm

khoa học, PGS.TS Phùng Thanh Hương Cô không những là người cô đáng kính

giúp chúng em có những định hướng và quyết định đúng đắn trong quá trình làm nghiên cứu mà cô luôn ở bên chúng em trong những lúc khó khăn nhất, động viên

và đưa ra những lời khuyên bổ ích cho chúng em Từ cô chúng em đã học được rất nhiều bài học quý giá trong nghiên cứu và trong cuộc sống Đó chính là những nền tảng vững chắc để từ đó em có thể tự bước đi trong sự nghiệp của em sau này

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cô NCS Ths Nguyễn Thị Đông đã

luôn nhiệt tình hỗ trợ hết mình chúng em trong quá trình học tập và nghiên cứu

Đồng thời em cũng xin cảm ơn tới những người thân trong gia đình và bạn

bè đã luôn động viên và tiếp sức mạnh cho em trong những lúc khó khăn nhất

Em xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên

Nguyễn Thị Huyền

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về enzym PTP1B 3

1.1.1 Danh pháp và phân loại 3

1.1.2 Cấu trúc 3

1.1.3 Cơ chế xúc tác 5

1.1.4 Vai trò của PTP1B trong điều trị đái tháo đường 6

1.1.6 Các nghiên cứu về chất ức chế PTP1B 10

1.2 Cây chuối tiêu 12

1.2.1 Vị trí, phân loại 12

1.2.2 Đặc điểm thực vật 12

1.2.3 Bộ phận dùng 13

1.2.4 Các nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của cây chuối tiêu 13

CHƯƠNG 2 : NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Nguyên vật liệu, trang thiết bị nghiên cứu 17

2.1.1 Nguyên liệu 17

2.1.2 Hóa chất 17

2.1.3 Thiết bị 17

2.1.4 Dụng cụ 17

2.2 Nội dung nghiên cứu 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Phương pháp thu mẫu nghiên cứu 19

2.3.3 Phương pháp đánh giá khả năng ức chế PTP1B 21

2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 25

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26

3.1 Kết quả 26

3.1.1 Đường chuấn sự phụ thuộc giữa mật độ quang và lượng phosphat tự do 26

3.1.2 Kết quả khảo sát khả năng ức chế PTP1B 27

3.1.2.1 Khả năng ức chế PTP1B của các cao 27

3.1.2.2 Khả năng ức chế PTP1B của các chất phân lập 29

3.2 Bàn luận 30

3.2.1 Về phương pháp nghiên cứu 30

3.2.2 Về khả năng ức chế enzym PTP1B của các cao và chất phân lập 32

KẾT LUẬN 36

KIẾN NGHỊ 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

ĐTĐ Đái tháo đường

EGF

ER

EtOAc

IC50

Epidermal grow factor (yếu tố tăng trưởng biểu bì)

Endoplasmic Reticulum (lưới nội chất)

Protein tyrosin phosphatase 1B

Protein tyrosin phosphatase

Reactive Oxygen Species (quá trình oxy hóa)

Receptor tyrosine kinases

Streptozocin

Thiazolidindion

Tryptophan – Prolin – Acid aspartic

Bảng 2.1 Thành phần phản ứng đánh giá tác dụng ức chế PTP1B

Bảng 3.1 Mật độ quang của các dung dịch Pi

Bảng 3.2 Khả năng ức chế PTP1B của các mẫu cao từ thân cây

chuối tiêu (Musa paradisiaca L.)

Bảng 3.3 Khả năng ức chế PTP1B của của các chất phân lập từ thân

cây chuối tiêu (Musa paradisiaca L.)

Bảng 3.4 IC50 của các chất có tác dụng nổi bật

Hình 1.1 Cấu trúc không gian của PTP1B

Hình 1.2 Hai giai đoạn của quá trình xúc tác bởi PTP1B

Hình 1.3 Vai trò điều hòa âm tính của PTP1B trong con đường

truyền tín hiệu của insulin

Hình 2.1 Nội dung nghiên cứu

Hình 2.2 Thiết kế nghiên cứu

Hình 2.3 Phương pháp thu cao phân đoạn

Hình 2.4 Trình tự tiến hành thí nghiệm đánh giá tác dụng ức chế

ĐẶT VẤN ĐỀ

Đái tháo đường (ĐTĐ) typ 2 là typ phổ biến nhất, chiếm xấp xỉ 90% tổng

số ca mắc ĐTĐ Typ này đặc trưng bởi sự kháng insulin, một hormon được sản xuất bởi tế bào beta đảo tụy với vai trò duy trì cân bằng glucose nội môi Trong con đường truyền tín hiệu của insulin, tín hiệu mà receptor nhận được là kết quả của sự cân bằng giữa quá trình phosphoryl hóa tyrosin bởi protein tyrosin kinase

và quá trình khử phosphoryl tyrosin bởi các protein tyrosin phosphatase (PTP), đặc biệt là protein tyrosin phosphatase 1B (PTP1B) Tuy nhiên, nếu tăng hoạt tính của PTP1B quá mức có thể thay đổi cân bằng giữa 2 enzym, dẫn đến giảm

sự phosphoryl hóa tyrosin và giảm tính nhạy cảm với insulin của tế bào [36] Trong nhiều nghiên cứu, PTP1B tăng hoạt tính ở cả người bệnh ĐTĐ typ 2 và động vật thí nghiệm gây ĐTĐ typ 2, ức chế hoạt tính PTP1B làm giảm kháng insulin, cải thiện kiểm soát glucose máu [6], [41] Do đó hiện nay, PTP1B được coi là một đích tác dụng đầy triển vọng của thuốc điều trị ĐTĐ typ 2 Nhiều dược liệu trên thế giới đã được chứng minh cơ chế tác dụng giảm kháng insulin thông qua khả năng ức chế PTP1B như rễ cây dâu, cây nhàu, ngũ vị tử [36]

Cây chuối tiêu (Musa paradisiaca L.) được biết đến rộng rãi như một loại

thực phẩm và cũng là một vị thuốc Theo kinh nghiệm dân gian của đồng bào dân tộc thiểu số phía bắc Việt Nam và một số quốc gia trên thế giới, phần thân chuối ép lấy nước uống để điều trị đái tháo đường cho kết quả hạ glucose máu rất tốt Hiện nay, trên thế giới có một vài nghiên cứu về tác dụng chữa ĐTĐ của thân cây chuối tiêu nhưng chỉ mới ở mức độ sàng lọc, kết quả chưa thống nhất, chưa có một nghiên cứu có hệ thống nào đánh giá được tác dụng và cơ chế tác dụng hạ glucose máu của dược liệu này [29], [34] Để góp phần tìm những bằng

chứng khoa học về tác dụng và cơ chế tác dụng của thân cây chuối tiêu trong

điều trị đái tháo đường, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tác dụng ức

chế PTP1B in vitro của cao toàn phần và một số chất phân lập từ dịch ép

thân cây Chuối tiêu” với mục tiêu:

cây Chuối tiêu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về enzym PTP1B

1.1.1 Danh pháp và phân loại

PTP1B (EC 3.1.3.48) là tên viết tắt của protein tyrosin phosphatase 1B Đây là một enzym thuộc phân họ pTyr PTP cổ điển - một trong bốn phân họ của siêu họ enzym Protein Tyrosin Phosphatase [5]

1.1.2 Cấu trúc

PTP1B là protein chứa 435 acid amin, trong đó vùng xúc tác từ acid amin

30 đến acid amin 278 Đầu tận C kị nước chính là vị trí để enzym gắn vào bề mặt lưới nội chất Đặc điểm cấu trúc đặc trưng của PTP1B là vòng xúc tác gồm đơn phân xúc tác Cys215, vòng WPD (tryptophan, prolin, acid aspartic) và vị trí liên kết aryl-phosphat thứ cấp [12], [31]

Trung tâm hoạt động của PTP1B có cấu trúc phổ biến như của các PTP nói chung Vị trí xúc tác cơ bản được xác định từ acid amin 214-221 (His-Cys-Ser-Ala-Gly-Ile-Gly-Arg) - đây là vòng của 8 acid amin có cấu trúc bền vững, giúp phối hợp với gốc aryl-phosphat của cơ chất Vòng này cũng chứa vị trí ái nhân Cys215 Bốn vòng khác tạo thành các cạnh của khe xúc tác góp phần vào quá trình xúc tác và nhận diện cơ chất (Asp181, Phe182, Tyr46, Val49, Lys120

và Gln262) Chiều sâu của khe xúc tác là 8-9Å cho cơ chất đặc hiệu [10], [31]

Vòng WPD: sự thay đổi hình dạng của PTP1B liên quan đến hoạt động xúc tác của enzym khi liên kết với cơ chất Vòng WPD (acid amin 79-187) di chuyển tới 12Å để đóng vòng phenyl của cơ chất, làm tăng tương tác kị nước Asp181 di chuyển tới vị trí mà nó có thể hoạt động giống một acid phổ biến để

chuyển proton cho nhóm tyrosyl rời đi Arg221 cũng thay đổi vị trí để tối ưu hóa tương tác “cầu muối” với cơ chất phosphat Trong quá trình chuyển dạng này, Cys215 là vị trí liên kết ái nhân vào nguyên từ phospho của cơ chất Vì vậy tác nhân ức chế PTP1B có thể tác động vào cả quá trình chuyển dạng “mở” và

“đóng” của PTP1B

Vị trí liên kết aryl-phosphat thứ cấp: đây là vị trí xúc tác không hoạt động, tạo ra liên kết yếu hơn so với vị trí hoạt động cơ bản do tiếp xúc với môi trường nhiều hơn Tuy nhiên vị trí này quan trọng trong thiết kế tác nhân ức chế PTP1B [31]

Hình 1.1: Cấu trúc không gian của PTP1B [31]

Giai đoạn 2: Khi gốc phosphat đã được chuyển đến gốc cystein, cơ chất rời khỏi enzym và bước cuối cùng là sự thủy phân gốc phosphat Sự liên hợp của một phân tử nước và glycin giúp sự thủy phân gốc phosphat xảy ra dễ dàng hơn Khi gốc phosphat rời khỏi, vị trí hoạt động sẵn sàng để tiếp tục xúc tác cho phản ứng tiếp theo Trong quá trình đó, gốc phosphat ở cơ chất đầu tiên được chuyển đến tiểu phân cystein ở vị trí xúc tác trước khi bị thủy phân bởi nước để giải phóng anion phosphat [22]

Hình 1.2: Hai giai đoạn của quá trình xúc tác bởi PTP1B [22]

1.1.4 Vai trò của PTP1B trong điều trị đái tháo đường

Insulin là hormon do tế bào beta đảo tụy tiết ra, có vai trò quan trọng trong việc duy trì nồng độ glucose máu và điều hòa quá trình chuyển hóa carbohydrat, lipid và protein Insulin tạo ra được tác dụng sinh học khi gắn vào thụ thể của nó

ở các mô đích (mô cơ, mô gan, mô mỡ) và dẫn đến một loạt các tín hiệu tế bào Thụ thể insulin (IR) (KLPT 340 000), được cấu tạo bởi hai tiểu đơn vị (α và β)

có bản chất glycoprotein Tiểu đơn vị β có hoạt tính tyrosin kinase Khi insulin liên kết với IR làm thay đổi hình dạng của IR, hoạt hóa hoạt tính kinase, gây ra

sự tự phosphoryl hóa tiểu đơn vị β Sự hoạt hóa IR làm phosphoryl hóa một số

cơ chất protein phía dưới bao gồm cơ chất của insulin receptor (IRS) và một số protein khác (Gab1 và Shc), gây ra tác dụng sinh học của insulin Một trong những chìa khóa của tín hiệu insulin là phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) Hoạt hóa PI3K giúp hoạt hóa PI3K-dependent kinase 1 (PDK1), tiếp theo là hoạt hóa protein kinase (Akt) Akt rất cần thiết cho vận chuyển glucose vào tế bào và tổng hợp glycogen Nồng độ glucose máu ổn định là kết quả của sự cân bằng giữa quá trình phosphoryl hóa tyrosin bởi protein tyrosin kinase và quá trình khử phosphoryl tyrosin bởi các protein tyrosin phosphatase (PTP) [18], [32]

Hình 1.3: Vai trò điều hòa âm tính của PTP1B trong con đường

truyền tín hiệu của insulin [32]

Một trong những cơ chế của ĐTĐ typ 2 là tình trạng kháng insulin, ảnh hưởng đến sự vận chuyển và chuyển hóa glucose ở gan, cơ và mô mỡ Ở cấp độ

tế bào, kháng insulin biểu hiện ở sự giảm đáp ứng với một số lượng cực đại của insulin hoặc giảm tính nhạy cảm với sự kích thích vận chuyển glucose và chuyển hóa Mặc dù khiếm khuyết ở phân tử gây nên sự kháng insulin chưa được biết rõ tuy nhiên hầu hết các bằng chứng cho thấy có thể nó liên quan đến sự truyền tín hiệu ở IR Xuất phát từ cơ chế kết thúc con đường truyền tín hiệu của insulin bằng phản ứng khử phosphoryl của IR, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các PTP có liên quan đến tình trạng kháng insulin thông qua tăng hoạt tính hoặc tăng biểu hiện Trong các PTP, PTP1B được nghiên cứu nhiều hơn cả, nó có vai trò điều

hòa âm đối với hoạt động của insulin ở mô đích PTP1B phân bố khá rộng, bao gồm cả các mô đích chủ yếu của insulin như gan, cơ và mô mỡ Sự biểu hiện quá mức của PTP1B dẫn đến ức chế IR PTP1B có khả năng tương tác và di chuyển tyrosin phosphat từ IR PTP1B cũng có thể khử phosphoryl của protein IRS qua

đó làm giảm và gián đoạn quá trình truyền tín hiệu của insulin Nghiên cứu trên chuột cho thấy rằng, khi bị giảm hoạt tính của PTP1B sẽ làm tăng sự phosphoryl hóa ở IR và IRS-1 ở mô cơ và gan Kết quả là chuột đột biến mất gen PTP1B tăng nhạy cảm với insulin ở mô cơ và gan cũng như giảm được glucose máu [32]

1.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzym PTP1B

Bên cạnh các yếu tố ảnh hưởng chung đến hoạt tính các enzym, các quá trình ảnh hưởng đặc trưng đến hoạt tính enzym PTP1B gồm quá trình oxy hóa, nitrosyl hóa, sulfurhydro hóa, sumoyl hóa, phosphoryl hóa và quá trình phân giải protein

Quá trình oxy hóa (ROS): tương tự như các enzym khác của phân họ PTP

cổ điển, PTP1B dễ bị oxy hóa bởi các nhóm oxy hoạt động có trong môi trường hóa học ở khe xúc tác của nó Quá trình oxy hóa vị trí hoạt động cystein làm mất tính chất ái nhân và ức chế hoạt động của PTP1B ROS có chức năng như một

cần cho sự hoạt hóa receptor và bất hoạt PTP1B Yếu tố phát triển biểu bì và sự kích thích insulin gây ra sự oxy hóa thuận nghịch PTP1B và làm giảm hoạt tính của nó

Quá trình nitrosyl hóa: giống như ROS, các nhóm nitrogen hoạt động làm bất hoạt PTP1B Đặc biệt, S-nitrosyl hóa ngăn chặn sự oxy hóa vị trí hoạt động cystein do stress oxy hóa và do đó có tác dụng bảo vệ chống lại sự oxy hóa không thuận nghịch

Quá trình sulfurhydro hóa: PTP1B bị bất hoạt thuận nghịch bởi hydrogen sulphid nội sinh do đáp ứng với quá trình stress lưới nội chất (ER) thông qua sulfurhydro hóa vị trí hoạt động cystein Quá trình sulfurhydro hóa PTP1B là một cơ chế hữu hiệu để điều hòa đáp ứng stress của ER

Quá trình sumoyl hóa: PTP1B bị sumoyl hóa ở hai đơn phân lysin (Lys335 và 347) Đáng chú ý, insulin gây ra sự sumoyl hóa PTP1B, làm giảm hoạt tính của enzym và ức chế tác dụng điều hòa âm của PTP1B trong quá trình truyền tín hiệu của insulin Hơn nữa sự thay đổi này cũng ảnh hưởng gián tiếp đến sự khử phosphoryl của emerin- một protein phía trong màng nhân điều hòa

sự cấu tạo nhân tế bào

Quá trình phosphoryl hóa: PTP1B bị phosphoryl hóa ở đơn phân tyrosin

và serin, có thể làm tăng hoặc giảm hoạt tính enzym Insulin gây ra sự phosphoryl hóa PTP1B tyrosin làm giảm hoạt tính của nó ở cơ xương và mô mỡ của chuột Thêm vào đó PTP1B cũng bị phosphoryl hóa ở các đơn phân serin trong quá trình phân bào và stress Hơn nữa sự phosphoryl hóa PTP1B (Ser50) bởi Akt cũng làm giảm hoạt tính xúc tác của enzym và khả năng khử phosphoryl

IR, đó có thể là một cơ chế điều hòa dương tính của tín hiệu insulin

Quá trình phân giải protein: trong quá trình hoạt hóa tiểu cầu xảy ra quá trình phân giải gián tiếp PTP1B từ ER, giải phóng enzym hòa tan vào tế bào

chất Sự oxy hóa thuận nghịch PTP1B có thể ảnh hưởng đến sự phân giải protein [3]

1.1.6 Các nghiên cứu về chất ức chế PTP1B

a) Các chất tổng hợp

Thiazolidindion (TZD) là 1 thuốc điều trị ĐTĐ typ 2 đang được dùng phổ biến trên thế giới với cơ chế làm giảm kháng insulin ở các mô ngoại vi và gan Nhiều nghiên cứu đã chứng minh TZD ức chế PTP1B thông qua làm giảm biểu hiện enzym này ở gan và cơ [4]

Một trong những nhóm chất ức chế PTP1B được nghiên cứu đầu tiên và nhiều nhất là các hợp chất diflorophosphonat Các hợp chất tương tự có phospho như phosphonat, monofluromethyl phosphonat, hydroxymethyl phosphonat… cũng được thử nghiệm khá nhiều Cơ chế ức chế PTP1B của các hợp chất dạng này được cho là ức chế cạnh tranh với enzym [12]

Các hợp chất của vanadi từ lâu được coi là có triển vọng trong điều trị ĐTĐ ở người Vanadat và pervanadat là 2 chất ức chế PTP1B được nghiên cứu lâm sàng rộng rãi [5], [33]

Một vấn đề quan trọng trong nghiên cứu tìm kiếm các chất ức chế PTP1B

để điều trị ĐTĐ là khả năng ức chế chọn lọc, bởi PTP là 1 họ enzym lớn với nhiều vai trò quan trọng trong cơ thể Một nhóm chất ức chế PTP1B chọn lọc đã được tìm ra là các dẫn chất bidentat Đây là những hợp chất phân tử nhỏ, có thể gắn với cả trung tâm hoạt động và vị trí liên kết phosphat thứ cấp đặc trưng của enzym [16]

b) Các hợp chất tự nhiên

Bên cạnh việc thiết kế tổng hợp các chất ức chế PTP1B, một hướng đi song song đang được chú ý là tìm kiếm các thảo dược và hợp chất tự nhiên có tác dụng ức chế PTP1B để điều trị ĐTĐ typ 2

Nhiều thảo dược sau khi được chứng minh hiệu quả làm giảm glucose máu, cải thiện dung nạp glucose đã được phát hiện cơ chế tác dụng thông qua ức chế PTP1B như : rễ cây dâu, cây nhàu, ngũ vị tử…[7], [15], [20]

Không chỉ dừng ở việc đánh giá tác dụng của các dịch chiết thảo dược lên hoạt tính PTP1B, nhiều hợp chất phân lập từ thảo dược đã được chứng minh tác

dụng ức chế PTP1B in vitro và cả in vivo

Năm 2002, 5 flavonoid bao gồm

3’-(3-methylbut-2-enyl)-3’,4’,7-trihydroxyflavan, quercetin, uralenol, broussochalcone A được phân lập từ cây

Broussonetia papyrifera được chứng minh tác dụng ức chế PTP1B với IC50 trong khoảng 4,3 - 36,8 μmol/L [41]

Tất cả các hợp chất phân lập được từ thân cây Angelica keiskei đều có tác

dụng ức chế PTP1B, trong đó 6 chalcon thể hiện tác dụng ức chế PTP1B mạnh

Dịch chiết từ cây ngũ vị tử (Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.) có tác

dụng ức chế PTP1B, dịch chiết ether (IC50 = 1,77 ± 0,20 μg/mL) và dịch chiết

Các hợp chất phenolic phân lập từ lá cây Cyclocarya paliurus (Batal.) có

2,67 µg/mL [39]

Dịch chiết EtOAc của cây Acanthopanax senticosus (Rupr & Maxim.)

Harms phân lập được hai diphenyl ethers mới và 8 hợp chất đã biết Tất cả các hợp chất phân lập được đều có tác dụng ức chế PTP1B Trong đó 2 hợp chất mới

Tại Việt Nam, một số thảo dược đã được chứng minh tác dụng ức chế PTP1B và song song là tác dụng điều trị ĐTĐ typ 2 như rễ cây chóc máu, giảo

Phân bố: Chuối tiêu mọc hoang hoặc được trồng ở nhiêu nơi ở nước ta và các nước vùng Đông Nam Á [1]

a) Nghiên cứu về quả

- Năm 2010, Suneetha.B và cộng sự đã nghiên cứu và chứng minh được trong dịch ép quả chuối tiêu có tác dụng hạ glucose máu trên chuột ĐTĐ bởi alloxan (150mg/kg) Kết quả của nghiên cứu này còn cho thấy dịch ép quả chuối tiêu còn

có tác dụng hạ triglycerid máu, cholesterol toàn phần và chống oxy hóa trên chuột bị ĐTĐ bởi alloxan [29]

- Năm 2011, Imam M Z và cộng sự đã chứng minh được trong quả chuối tiêu

có chứa các sitoindosid (1, 2, 3, 4) và các sitosterol, β-D-glucosid,…Nghiên cứu này đã chứng minh được tác dụng chống viêm ruột, điều trị tiêu chảy, chống oxy hóa của quả chuối tiêu xanh [9] Tiếp theo, năm 2012 Paul C và cộng sự đã nghiên cứu dịch ép của quả chuối tiêu chín trên chuột cống trắng Kết quả cho thấy sau 28 ngày ở lô chuột được uống dịch ép tác dụng điều hòa miễn dịch thể hiện khác biệt so với lô không được uống dịch ép (p<0,05) [23]

- Tác dụng hạ glucose máu trên chuột cống ĐTĐ typ 2 của dịch ép quả chuối tiêu đã điều chế thành bột thô được Sidiqat A.S và cộng sự nghiên cứu năm

2012 Kết quả cho thấy bột thô được điều chế từ dịch ép quả chuối tiêu (với liều

2g/kg chuột) đã có ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase trên chuột cống bị ĐTĐ typ 2 [27]

đã chứng minh được phân đoạn n-butanol của lá cây chuối tiêu (với liều 50mg/kg chuột) làm tăng dung nạp glucose trong test dung nạp glucose đường uống, tăng nồng độ glycogen ở gan và kích thích đáng kể sự bài tiết insulin của chuột cống trắng bị ĐTĐ bởi alloxan (150mg/kg) khi so sánh với nhóm chứng uống nước cất

- Nghiên cứu tiếp theo tháng 2 năm 2014 Enechi Osmund C và cộng sự đã chứng minh được trong dịch chiết ethanol của lá cây chuối tiêu có chứa rất nhiều các chất khác nhau như: vitamin A, C, E với hàm lượng tương ứng là 0,197; 0,686 và 1,88 mg/100g Các alkaloid, flavonoid, protein, carbon hydrat, tanin, saponin, chất béo, streroid, terpenoid, glycoside cũng được tìm thấy trong dịch chiết lá cây chuối tiêu [9]

c) Nghiên cứu về hoa

- Nghiên cứu của Sunil Jawla và cộng sự năm 2012 cho thấy dịch chiết ethanol của hoa cây chuối tiêu có tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm chống lại các

chủng vi khuẩn như B subtilis, B cereus, E coli, K pneumoniae, P mirabilis,

P aeruginosa, S pneumoniae,…tác dụng này so với amikacin và clotrimazol là

tương đương [30]

- Dịch chiết hoa của cây chuối tiêu đã được Shanmuga S C và cộng sự nghiên cứu năm 2011, kết quả của nghiên cứu này cho thấy dịch chiết ethanol của hoa với liều 200mg/kg chuột cống trắng có tác dụng hạ glucose máu trên chuột gây ĐTĐ bởi STZ (45mg/kg) [25]

e) Các nghiên cứu về thân cây chuối tiêu

- Năm 2013 Priyanka Soni và cộng sự đã chứng minh dịch chiết ethanol của thân cây chuối tiêu có tác dụng tăng estrogen ức chế quá trình rụng trứng của chuột cống trắng thí nghiệm [28]

- Ekpo.B và cộng sự (2011) đã nghiên cứu cao toàn phần thân cây chuối tiêu trên chuột cống đã bị ĐTĐ bởi alloxan (150mg/kg) với các liều 250, 500, 1000 mg/kg chuột Kết quả cho thấy sau 20 ngày điều trị bằng cắn toàn phần thân cây

chuối tiêu glucose máu tại các thời điểm khác biệt so với lô đối chứng uống nước cất và tác dụng này phụ thuộc vào liều [9]

- Nghiên cứu tiếp theo vào năm 2014, các nhà khoa học Ấn Độ là Vijai Lakshmi

và cộng sự đã chiết xuất thân cây chuối tiêu bằng ethanol, sau đó chiết xuất phân đoạn với các dung môi n-hexan, chloroform, n-butanol Cắn các phân đoạn dịch chiết được thử nghiệm trên chuột cống trắng đã bị ĐTĐ bởi STZ (45mg/kg) Nghiên cứu này chưa chứng minh được tác dụng hạ glucose máu của thân cây

chuối tiêu (Musa paradisiaca L.) [34]

Như vậy, các bộ phận phận dùng khác nhau của cây chuối tiêu (Musa

paradisiaca L.) được nghiên cứu khá nhiều, riêng về phần thân chuối tiêu, số

lượng nghiên cứu rất ít và đặc biệt với tác dụng hạ glucose máu thì các nhiên cứu còn rất sơ sài và kết quả chưa thống nhất

Ở Việt Nam cho đến nay, mới chỉ có nhóm của Phùng Thanh Hương, Nguyễn Thị Đông và cộng sự nghiên cứu về tác dụng chữa ĐTĐ của dịch ép thân cây chuối tiêu Những kết quả ban đầu cho thấy mẫu thử có tác dụng hạ glucose máu, giảm lipid máu và hoạt tính G6Pase ở gan giảm đáng kể trên chuột ĐTĐ typ 2 thực nghiệm [24] Một số chất cũng đã được phân lập từ thân cây chuối tiêu và xác định cấu trúc Những kết quả này chứng minh vì sao dịch ép thân chuối tiêu được dùng làm giảm glucose máu có hiệu quả ở bệnh nhân ĐTĐ theo kinh nghiệm dân gian Mặt khác, các kết quả này cũng đặt ra câu hỏi: thân cây chuối tiêu làm hạ glucose máu theo cơ chế nào? Nghiên cứu này của chúng tôi nhằm khám phá một phần cơ chế tác dụng của thân cây chuối tiêu

CHƯƠNG 2 : NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, trang thiết bị nghiên cứu

- Các hóa chất khác: DMSO, nước cất 2 lần Các hóa chất này đều đạt tiêu chuẩn phân tích

2.1.3 Thiết bị

- Hệ thống máy ELISA (Bio Tek Instrument)

- Máy ủ (ASYS Hitech)

2.1.4 Dụng cụ

- Đĩa 96 giếng đáy bằng CP4096 (Supplex Inc, Mỹ)

- Các micropipet và đầu côn phù hợp

- Các dụng cụ thủy tinh: bình cầu, pipet, cốc có mỏ,…

Các dụng cụ đạt tiêu chuẩn phân tích

2.2 Nội dung nghiên cứu

Để thực hiện được những mục tiêu của đề tài, quá trình nghiên cứu bao gồm những nội dung chính như hình 2.1

Hình 2.1: Nội dung nghiên cứu

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Thân cây chuối tiêu

Hình 2.2: Thiết kế nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp thu mẫu nghiên cứu

- Thu cao toàn phần: thân cây chuối tiêu được cắt khúc nhỏ sau đó ép kiệt

lấy dịch, cất quay chân không áp suất giảm (160mHg) thu được cắn, đem

bột có hàm ẩm < 6%

- Thu cao phân đoạn: Dịch ép toàn phần thân cây chuối tiêu, bay hơi bớt

nước dưới áp suất giảm, lần lượt chiết với các dung môi hữu cơ có độ phân cực tăng dần (n-hexan, choloroform, ethyl acetat, n-butanol), cất

thể hiện trong hình 2.3

Hình 2.3: Phương pháp thu cao phân đoạn

- Phân lập chất: dịch chiết phân đoạn sau khi thu được đưa lên cột

Sephadex, tinh chế thu được các chất phân lập

- Xác định cấu trúc của các chất phân lập được bằng các phổ 1H-NMR, 13C-NMR, ESI-MS

2.3.2 Phương pháp xây dựng đường chuẩn sự phụ thuộc giữa mật độ quang

và lượng phosphat tự do

- Cho vào mỗi giếng lần lượt 100; 97,5; 95; 90; 80; 70µL dung dịch đệm

- Thêm tiếp vào các giếng theo thứ tự đó 0; 2.5; 5; 10; 20; 30µL dung dịch phosphat chuẩn 100µM

- Như vậy mỗi giếng chứa lần lượt 0; 0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 nmol phosphat

vô cơ

- Đo quang ở bước sóng 595nm

- Làm 3 lần lấy kết quả trung bình Vẽ đồ thị sự phụ thuộc của mật độ quang vào số mol phosphat

2.3.3 Phương pháp đánh giá khả năng ức chế PTP1B

a) Nguyên tắc

Dựa vào phản ứng loại nhóm phosphat ở phân tử tyrosin (Tyr) đã được phosphoryl hóa (p-Tyr1158) trong tiểu đơn vị beta của insulin receptor dưới tác dụng của PTP1B Cụ thể, trong thí nghiệm này, cơ chất của PTP1B được sử dụng là một đoạn polypeptid của tiểu đơn vị beta của insulin receptor trong đó

phosphat tự do (Pi) tạo ra từ phản ứng này được định lượng dựa trên phản ứng xanh malachit

Định lượng xanh malachit phosphomolybdat tạo thành bằng phương pháp đo quang ở bước sóng 595nm Lượng xanh malachit phosphomolybdat tạo thành tỉ

lệ với lượng phosphat tự do (Pi) trong hỗn hợp phản ứng

Sử dụng bộ kít định lượng PTP1B (Merck Millipore Corporation- Germany)

b) Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được tiến hành song song giữa mẫu thử và mẫu trắng Các mẫu nghiên cứu được hòa tan trong dung dịch DMSO 10%