Nghiên cứu tác dụng và cơ chế hạ glucose máu của dịch ép thân cây chuối tiêu (musa x paradisiacal l ) trên thực nghiệm (tt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ ĐÔNG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG VÀ CƠ CHẾ HẠ GLUCOSE MÁU CỦA DỊCH ÉP THÂN CÂY CHUỐI TIÊU (MUSA X PARADISIACA L.) TRÊN THỰC NGHIỆM Chuyên ngành: Hoá sinh Dược Mã số: 62720408 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI, NĂM 2017 Cơng trình đƣợc hồn thành tại: Bộ mơn Hoá sinh, trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Phùng Thanh Hƣơng GS.TS Nguyễn Hải Nam Phản biện : ………………………………………… ………………………………………… Phản biện : ………………………………………… ………………………………………… Phản biện : ………………………………………… ………………………………………… Luận án đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng đánh giá luận án cấp trƣờng họp tại: Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội Vào hồi ….giờ……ngày….tháng… năm 2017 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thƣ viện Quốc gia Việt Nam Thƣ viện Trƣờng ĐH Dƣợc HN ĐẶT VẤN ĐỀ Trong năm qua, số nghiên cứu về đái tháo đường đã tăng lên nhanh chóng Kết sự đời của thuốc mới ứng dụng điều trị Các thuốc điề u tri đái ̣ tháo đường đươ ̣c sử dụng cho thấy hiệu định Tuy nhiên, hiê ̣u quả lâu dài viê ̣c ngăn ngừa các biế n chứng của đái tháo đường thông qua kiể m soát glucose máuvẫn hạn chế, đờ ng thời những phản ứng bấ t lơ ̣i sử du ̣ng thuố c vẫn vấn đề đáng lưu ý Do đó, mô ̣t những mố i quan tâm hàng đầ u của các nhà khoa ho ̣c hiê ̣n là viê ̣c tìm thuốc mới điều trị đái tháo đường dựa sự khám phá đích tác dụng mới, nhằ m nâng cao hiê ̣u quả điề u tri ̣đái tháo đường , đồ ng thời giảm đươ ̣c những phản ứng bấ t lơ ̣iTừ hướng nghiên cứu đó, có nhiều loại thảo dược nghiên cứu chứng minh tác dụng hạ glucose máu như: Dây đau xương, Chè xanh, Thổ phục linh Cây Chuối tiêu (Musa x paradisiaca L.) biết đến loại thực phẩm vị thuốc Theo kinh nghiệm dân gian của đồng bào dân tộc thiểu số phía Bắc Việt Nam số quốc gia giới, phần thân chuối ép lấy nước uống để điều trị đái tháo đường, kết hạ glucose máu Tuy nhiên, thời điểm chưa có tài liệu khoa học của Việt Nam nghiên cứu về tác dụng sinh học của thân chuối tiêu Hiện nay, giới có vài nghiên cứu về tác dụng điều trị đái tháo đường của thân chuối tiêu mới mức độ sàng lọc, kết chưa thống nhất, chưa có nghiên cứu có hệ thống đánh giá tác dụng chế tác dụng hạ glucose máu của dược liệu Để có chứng khoa học về tác dụng chế tác dụng của thân chuối tiêu điều trị đái tháo đường luận án tiến hành đề tài “Nghiên cứu tác dụng chế hạ glucose máu dịch ép thân chuối tiêu (Musa x paradisiacal L.) thực nghiệm” với mục tiêu Đánh giá tác dụng hạ glucose máu cắn toàn phần từ dịch ép thân chuối tiêu chuột thực nghiệm Nghiên cứu chế hạ glucose máu cắn toàn phần số chất phân lập từ dịch ép thân chuối tiêu CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 ĐẠI CƢƠNG VỀ BỆNH ĐÁI THÁO ĐƢỜNG Trong phần đại cương về bệnh đái tháo đường, luận án trình bày nội dung: định nghĩa, dịch tễ, phân loại, tiêu chuẩ n chẩ n đoán, chế bệnh sinh của bệnh đái tháo đường 1.2 CÁC CƠ CHẾ GÂY HẠ GLUCOSE MÁU Tăng glucose máu mạn tính đặc trưng của bệnh đái tháo đường , gây biến chứng nguy hiểm Vì hầu hết thuốc điều trị bệnh đái tháo đường đều nhằm mục đích làm hạ glucose máu với chế khác Nhìn chung, chế hạ glucose máu phong phú Mỗi thuốc tác động theo nhiều chế khác Luận án trình bày số chế hạ glucose máu áp dụng điều trị nghiên cứu thực nghiệm như: Tăng cường số lượng insulin thông qua ức chế kênh KATP, tăng nồng độ calci nội bào, kích thích tiểu đảo tụy sản xuất insulin thông qua incretin, số hormon nguồn gốc từ ruột tăng tiết insulin Tăng cường nhạy cảm của mô đích với insulin thơng qua việc hoạt hóa AMPK, tăng gia nhâ ̣p glucose vào , giảm tân tạo glucose ở gan , tăng hoa ̣t đô ̣ng của ty thể gây ̣ glucose máu Thông qua receptor PPAR kích thích biệt hoá tế bào mỡ, kích thích enzym protein vận chuyển của tế bào mỡ, làm tăng nhạy cảm với insulin mô đích Thông qua trình truyền tín hiệu của insulin tế bào đích tác động vào nguyên nhân gây kháng insulin Tác dụng điều hòa, chuyển hóa tương tự insulin thông qua ức chế G6Pase thơng qua hoạt hóa GLUT4 Ức chế tiêu hóa carbohydrat thông qua ức chế enzym αamylase α-glucosidase làm hạ glucose máu sau ăn 1.3 CÁC MƠ HÌNH THỰC NGHIỆM TRONG NGHIÊN CỨU THUỐC ĐIỀU TRỊ ĐÁI THÁO ĐƢỜNG Luận án đề cập tới mô hình thực nghiệm in vivo in vitro Mô hình thực nghiệm in vivo luận án trình bày mô hình gây bệnh đái tháo đường typ typ Trong mơ hình gây bệnh đái tháo đường typ bao gồm phương pháp: Đái tháo đường typ di truyền, cắt bỏ tuyến tụy, nhiễm virus, sử dụng hóa chất (Streptozocin, Alloxan liều cao) Mô hình gây bệnh đái tháo đường typ gồm phương pháp: gây đái tháo đường typ đột biến gen, chế độ ăn nhiều carbohydrat, sử dụng hóa chất (Streptozocin liều thấp, Streptozocin kết hợp với nicotinamid, kết hợp STZ liều thấp chế độ ăn giàu chất béo) Mơ hình thực nghiệm in vitro bao gồm: Đánh giá tác động lên hoạt tính của enzym tiêu hóa chuyển hóa glucid Đánh giá khả tiết insulin của tế bào β đảo tụy (trên đảo tụy cô lập tế bào β đảo tụy, khả chết theo chương trình sự sinh sản, thay đổi kích thước tế bào β) Đánh giá mức độ nhạy cảm của mô đích với insulin (thông qua mức độ mức độ biểu hiện của protein có vai trò quan trọng hoạt động của insulin IRS-1, Akt, GSK3, AMPK, PPAR, GLUT4 dòng tế bào xương tế bào mô mỡ) Đánh giá thông qua ức chế PTP1B, GSK-3α giảm kháng insulin đường truyền tín hiệu của insulin 1.4 CÂY CHUỐI TIÊU Phần tổng quan về chuối tiêu, luận án trình bày nội dung về: vị trí phân loại đặc điểm thực vật, tên khoa học, phận dùng, nghiên cứu về thành phần hóa học tác dụng dược lý của chuối tiêu đặc biệt nghiên cứu về tác dụng hạ glucose máu liên quan đến đái tháo đường của thân chuối tiêu Mặc dù có số nghiên cứu bước đầu chứng minh tác dụng hạ glucose máu của thân chuối tiêu chuột thực nghiệm chưa có nghiên cứu vào tìm hiểu chế hạ glucose máu tác động chuyển hóa của phận dùng CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1 Dƣợc liệu nghiên cứu: Thân giả chuối tiêu (Musa x paradisiaca L.) thống gọi thân chuối tiêu 2.1.2 Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt chuột cống trắng 2.1.3 Các dòng tế bào: Tế bào vân chuột nhắt (C2C12) tế bào mô mỡ chuột nhắt (3T3-L1) 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Phƣơng pháp điều chế mẫu nghiên cứu - Điều chế cắn toàn phần: Thân chuối tiêu ép lấy dịch, cất quay chân không thu cắn, sấy áp xuất giảm, thu cắn toàn phần - Điều chế cắn phân đoạn: Dịch ép toàn phần lắc với dung môi hữu (n-hexan, chloroform, ethylacetat, n-butanol, cắn nước lại), sấy áp xuất giảm thu cắn phân đoạn Cắn toàn phần cắn phân đoạn pha dung môi NaCMC 0,5% thành hỗn dịch Sử dụng liều 1000mg/kg chuột nhắt 500mg/kg chuột cống Thí nghiệm in vitro phụ thuộc mơ hình thực nghiệm để sử dụng dung môi pha mẫu thử cho thích hợp 2.3.2 Đánh giá tác dụng hạ glucose máu chuột thực nghiệm - Trên chuột nhắt trắng tăng glucose máu thực nghiệm Streptozocin (STZ) liều 150 mg/kg + Đánh giá tác dụng cắn toàn phần: Chuột nhắt thí nghiệm gây tăng glucose máu cách tiêm màng bụng STZ liều 150 mg/kg Sau 72 giờ, chọn chuột có glucose máu 11,0 mmol/L chia thành lô (chứng bệnh, gliclazid, metformin, mẫu thử), song song tiến hành thí nghiệm với lơ chuột bình thường Chuột uống mẫu thử liên tục 15 ngày Ngày thứ 16 chuột nhịn đói 10h, thu máu tồn phần để định lượng glucose, insulin huyết thanh, xác định hoạt độ G6Pase - Trên chuột cống đái tháo đƣờng typ thực nghiệm + Mơ hình gây bệnh đái tháo đường typ thực nghiệm: chuột cống trắng, nuôi chế độ ăn 60% tổng số calo của phần ăn chất béo Sau 60 ngày tiêm màng bụng STZ với liều 50 mg/kg Sau 72 giờ định lượng glucose máu lúc đói của chuột Chọn chuột có glucose máu 11 mmol/L để làm thí nghiệm + Đánh giá tác dụng cắn toàn phần: Chuột đái tháo đường typ chia thành lô (chứng bệnh, chứng dương, mẫu thử) lô chuột bình thường uống dung môi pha hỗn dịch thử Ngày thứ 16, chuột nhịn đói 10h, định lượng glucose, insulin huyết thanh, triglycerid (TG), cholesterol toàn phần (Cho TP), hoạt độ G6Pase gan, tình trạng đại thể vi thể của tụy - Trên khả dung nạp glucose chuột cống đái tháo đƣờng typ thực nghiệm Chuột đái tháo đường typ uống mẫu thử 15 ngày, cho chuột nhịn đói 10 giờ, sau cho uống dung dịch glucose g/kg thể trọng Định lượng glucose máu sau uống dung dịch glucose thời điểm phút; 30, 60, 90 120 phút - Đánh giá tác dụng cắn phân đoạn: Tiến hành chuột tiêm STZ liều 150 mg/kg để tìm phân đoạn có tác dụng hạ glucose máu chiếm ưu Sau chọn phân đoạn thử nghiệm chuột đái tháo đường typ thực nghiệm Từ lựa chọn phân đoạn phân lập chất định hướng điều trị đái tháo đường 2.3.3 Các kỹ thuật định lượng hóa sinh thực nghiệm in vivo Định lượng glucose máu, insulin, cholesterol toàn phần, triglycerid huyết thanh, xác định hoạt độ enzym G6Pase 2.3.4 Kỹ thuật xét nghiệm mô bệnh học Nguyên tắc: Theo phương pháp nhuộm (HE) thường quy nhân tế bào beta bắt màu xanh đen, bào tương bắt màu hồng 2.3.5 Phương pháp xác định hoạt độ enzym G6Pase gan (EC 3.1.3.9) - Nguyên tắ c G6 Pase Glucose-6-phosphat + H2O  Glucose + phospho vô (Pi) 2.3.6 Phƣơng pháp đánh giá khả ức chế enzym in vitro - Đánh giá khả ức chế protein tyrosin phosphatase 1B (PTP1B - EC 3.1.3.48) Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng loại bỏ nhóm phosphat phân tử tyrosin phosphoryl hóa (pTyr 1158) tiểu đơn vị beta của insulin receptor dưới tác dụng của PTP1B Phần phospho tự (Pi) tạo từ phản ứng định lượng phương pháp đo quang bước sóng 595nm - Đánh giá khả ức chế α-amylase (EC 3.2.1.1) Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng thủy phân chất 2chloro-4-nitrophenyl-α-D-maltotriosid enzym α-amylase tạo thành 2-chloro-4-nitrophenol, phát hiện màu của 2-chloro-4nitrophenol bước sóng 400 nm - Đánh giá khả ức chế α-glucosidase (EC 3.2.1.20) Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng thủy phân chất pnitrophenyl-α-D-glucopyranosid (PNP-G) α-glucosidase tạo p-nitrophenol (PNP) Định lượng p-nitrophenol/môi trường kiềm phương pháp đo quang bước sóng 405nm 2.3.4 Đánh giá ảnh hƣởng phosphoryl hóa AMPK IRS-1 Nguyên tắc: AMPK hoạt hóa phosphoryl hóa gốc Threonin 172 tiểu đơn vị α của AMPK Trong IRS-1 bị hoạt tính, từ làm gián đoạn chuỗi truyền tín hiệu nội bào của insulin gốc Serin 307 protein phosphoryl hóa Đánh giá khả phosphoryl hóa AMPK ức chế sự phosphoryl hóa IRS-1 (Ser307) thông qua bán định lượng p-AMPKα (Thr 172) p-IRS-1 (Ser 307) tế bào C2C12 sau ủ với mẫu thử kĩ thuật Western Blot 2.3.5 Đánh giá khả ức chế biệt hóa TB mô mỡ 3T3-L1 Nguyên tắc: Tế bào 3T3-L1 mơi trường ni cấy thích hợp biệt hóa để tạo thành tế bào mô mỡ thông qua khả tổng hợp triglycerid (TG) Lượng TG hòa tan dầu đỏ (Oil Red) định lượng phương pháp đo quang bước sóng 500nm 2.3.7 Phƣơng pháp nghiên cứu thành phần hóa học Định tính nhóm chất hóa học phản ứng hố học thường quy, phân lập chất từ phân đoạn có tác dụng hạ glucose máu chiếm ưu sắc ký cột pha thường pha đảo Xác định cấu trúc thơng qua nhiệt độ nóng chảy, liệu phổ 2.3.8 Xử lý số liệu Kết biểu diễn dưới dạng Xtb±SD (giá trị trung bình của lô độ lệch chuẩn) Xử lí số liệu phần mềm SPSS 16 Microft Excel 2007, Graphpad Prism 7.03, Wolframalpha, Image J, khác biệt p < 0,05 CHƢƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HẠ GLUCOSE MÁU TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM 3.1.1 Kết tác dụng hạ cắn toàn phần 3.1.1.1 Tác dụng cắn toàn phần glucose máu chuột tiêm STZ liều 150mg/kg Sau 15 ngày uống mẫu thử, mức hạ glucose máu của lô chuột thí nghiệm so với ngày trình bày hình 3.1 Hình 3.1 Mức hạ glucose máu lơ chuột thí nghiệm tiêm STZ (150 mg/kg) sau 15 ngày uống mẫu thử Nhận xét: sau 15 ngày uống mẫu thử, mức hạ glucose máu của lơ chuột uống hỗn dịch cắn tồn phần khác biệt (p < 0,01) so với lô chứng bệnh 3.1.1.2 Tác dụng cắn toàn phần nồng độ glucose máu chuột đái tháo đƣờng typ Sự thay đổi nồng độ glucose máu của lô chuột đái tháo đường typ sau 15 ngày điều trị thể hiện bảng 3.2 Bảng 3.2 Nồng độ glucose máu chuột cống đái tháo đường typ sau 15 ngày uống mẫu thử Lô chuột Mẫu thử Lô (chứng sinh lý) Lô (chứng bệnh) Lô (chứng dương) Lô (Thử) DM pha hỗn dịch thử DM pha hỗn dịch thử Metformin Cắn TP Glucose máu (mmol/L) Ngày Ngày 16 *** 5,88  0,94 5,69  0,88*** 18,95  2,48 18,75  2,00 19,18  1,97 9,01  1,37** 19,07  2,17 14,02  1,66* Nhận xét: sau 15 ngày uống mẫu thử, nồng độ glucose máu của lô giảm khác so với lô chứng bệnh (p < 0,05) Kết mức hạ glucose máu của lô chuột thử nghiệm sau 15 ngày uống mẫu thử thể hiện hình 3.2 Hình 3.2 Mức hạ glucose máu lơ chuột đái tháo đường typ sau 15 ngày uống mẫu thử Nhận xét: lơ chuột uống hỗn dịch cắn tồn phần có mức hạ glucose máu khác so với lơ chứng bệnh (p