Nghiên cứu tác dụng và cơ chế hạ glucose máu của dịch ép thân cây chuối tiêu (Musa x paradisiacal L.) trên thực nghiệm_2

xuất insulin giảm dần, cho đến khi nồng độ insulin không đủ để duy trì nồng độ glucose máu ở mức bình thường, khi các triệu chứng lâm sàng xuất hiện thì hầu hết các tế bào β của tiểu đảo

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ ĐÔNG

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG VÀ CƠ CHẾ

HẠ GLUCOSE MÁU CỦA DỊCH ÉP

THÂN CÂY CHUỐI TIÊU

(MUSA X PARADISIACA L.)

TRÊN THỰC NGHIỆM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI, NĂM 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THNGUYNGUYÊNNỄN THỊ ĐÔNGỊ ĐÔNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH DƯỢC

MÃ SỐ: 62720408

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phùng Thanh Hương

GS.TS Nguyễn Hải Nam

HÀ NỘI, NĂM 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ một công trình nào khác

Tác giả luận án

Nguyễn Thị Đông

LỜI CẢM ƠN

Trong suố t qua ́ trình học tập và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ quý báu của các nhà Khoa học, các thầy cô giáo, ca ́ c anh chi ̣, các em, các bạn bè đồng nghiệp và gia đình

Vơ ́ i lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được bày tỏ lòng

biết ơn chân thành tới PGS TS Phùng Thanh Hương, GS.TS Nguyễn

Hải Nam, hai người Thầy tâm huyết, tận tình luôn sát cánh bên tôi quan

tâm giúp đỡ cũng như động viên tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hòan thành luận án này

Lời cảm ơn tiếp theo, tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiê ̣u trường Trường Đại học Dược Hà Nội, Trường Cao đẳng Dược Trung ương Hải Dương, đã tạo điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thày giáo, cô giáo, anh chị em kỹ thuật viên Bộ môn Hóa sinh, Bộ môn Dược lực, Phòng Sau đại học Trường Đại Học Dược Hà Nội, Bộ môn Hóa dược Trường Cao đẳng Dược Trung ương Hải Dương, đã tạo mọi điều kiê ̣n thuận lợi giúp đỡ tôi trong quá tri ̀nh học tập và hoàn thành luận án

Trong quá trình làm thực nghiệm tại Khoa Sinh hóa và Huyết học, Khoa Giải phẫu bệnh- Bệnh viện Đa khoa tỉnh Hải Dương Viện Hóa sinh biển- Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam, Khoa Hóa sinh và Vi sinh, Đại học Hóa học và Công nghệ Praha, Cộng hòa Czech Tôi đã nhận được sự giúp đỡ về điều kiện về trang thiết bị, hóa chất và kỹ thuật giúp tôi hoàn thành luận án Xin được bày tỏ lòng biết ơn tới các chuyên gia,các Bác sĩ, Dược sĩ, các anh chị em kỹ thuật viên tại các cơ quan trên

Xin gư ̉ i lời cảm ơn tới bạn bè, các em sinh viên Trường Đại học Dược Hà Nội, các anh chi ̣ em đồng nghiệp Trường Cao đẳng Dược Trung ương Hải Dương, luôn động viên và giúp đỡ tôi trong thời gian qua

Lời cảm ơn cuối cùng tôi muốn giành tặng cho những người thân trong gia đình đã luôn ở bên cạnh động viên, giúp đỡ và giành mọi thời gian để tôi học tập làm viê ̣c và hoàn thành luận án này

NCS Nguyễn Thị Đông

NCS Nguyễn Thị Đông

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG 3

1.1.1 Định nghĩa, dịch tễ, phân loại đái tháo đường 3

1.1.1.1 Định nghĩa 3

1.1.1.2 Dịch tễ 3

1.1.1.3 Phân loại đái tháo đường 3

1.1.1.4 Tiêu chuẩn chẩn đoán 4

1.1.2 Cơ chế bệnh sinh 5

1.1.2.1 Bệnh sinh của đái tháo đường typ 1 5

1.1.2.2 Bệnh sinh của đái tháo đường typ 2 7

1.2 CÁC CƠ CHẾ GÂY HẠ GLUCOSE MÁU 10

1.2.1 Tăng cường số lượng insulin nội sinh 10

1.2.1.1 Tăng cường số lượng insulin thông qua ức chế kênh KATP, tăng nồng độ calci nội bào 10

1.2.1.2 Tăng cường số lượng insulin thông qua các incretin 12

1.2.1.3 Tăng cường số lượng insulin thông qua ức chế DPP-4 12

1.2.2 Tăng cường nhạy cảm của mô đích với insulin 14

1.2.2.1 Tăng cường nhạy cảm của mô đích với insulin thông qua hoạt hóa AMPK 14

1.2.2.2 Tăng cường nhạy cảm của mô đích với insulin thông qua receptor PPAR 15

1.2.2.3 Tăng cường nhạy cảm của mô đích với insulin thông qua quá trình truyền tín hiệu của insulin 16

1.2.3 Tác dụng điều hòa, chuyển hóa tương tự như insulin 17

1.2.3.1 Tác dụng tương tự insulin thông qua các enzym 18

1.2.4 Ức chế tiêu hóa carbohydrat 19

1.2.5 Các cơ chế khác gây hạ glucose máu 20

1.3 CÁC MÔ HÌNH THỰC NGHIỆM TRONG NGHIÊN CỨU THUỐC ĐIỀU TRỊ ĐÁI THÁO ĐƯỜNG 21

1.3.1 Các mô hình thực nghiệm in vivo 21

1.3.1.1 Mô hình gây bệnh ĐTĐ typ 1 21

1.3.1.2 Mô hình gây bệnh ĐTĐ typ 2 22

1.3.2 Các mô hình thực nghiệm in vitro 24

1.3.2.1 Đánh giá tác động lên hoạt tính của các enzym tiêu hóa và chuyển hóa glucid 24

1.3.2.2 Đánh giá khả năng bài tiết insulin của tế bào β đảo tụy 25

1.3.2.3 Đánh giá mức độ nhạy cảm của mô đích với insulin 25

1.4 CÂY CHUỐI TIÊU 26

1.4.1 Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật 26

1.4.1.1 Vị trí phân loại 26

1.4.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố 27

1.4.2 Bộ phận dùng 27

1.4.3 Các nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của cây chuối tiêu (Musa x paradisiaca L.) 27

1.4.3.1 Nghiên cứu về thành phần hoá học 28

1.4.3.2 Nghiên cứu về tác dụng dược lý 29

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 32

2.1.1 Dược liệu nghiên cứu 32

2.1.2 Động vật thí nghiệm 32

2.1.3 Các dòng tế bào cho nghiên cứu in vitro 33

2.2 DỤNG CỤ, HÓA CHẤT NGHIÊN CỨU 33

2.2.1 Thiết bị, dụng cụ 33

2.2.2 Thuốc và hóa chất nghiên cứu 34

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

2.3.1 Phương pháp điều chế mẫu nghiên cứu 38

2.3.1.1 Điều chế cắn toàn phần 38

2.3.1.2 Điều chế cắn phân đoạn 38

2.3.1.3 Phương pháp pha mẫu thử 38

2.3.2 Phương pháp đánh giá tác dụng hạ glucose máu thực nghiệm trên chuột 39 2.3.2.1.Trên chuột nhắt trắng tăng glucose máu thực nghiệm bởi STZ liều 150 mg/kg 39

2.3.2.2 Trên chuột cống trắng ĐTĐ typ 2 thực nghiệm 40

2.3.2.3 Trên khả năng dung nạp glucose của chuột cống trắng ĐTĐ typ 2 thực nghiệm 43

2.3.3 Các kỹ thuật định lượng hóa sinh trong thực nghiệm in vivo 44

2.3.3.1 Định lượng glucose máu 44

2.3.3.2 Định lượng insulin huyết thanh 45

2.3.3.3 Định lượng cholesterol toàn phần huyết thanh 46

2.3.3.4 Định lượng triglycerid huyết thanh 47

2.3.4 Kỹ thuật xét nghiệm mô bệnh học 47

2.3.5 Phương pháp xác định hoạt độ enzym G6Pase gan (EC 3.1.3.9) 48

2.3.6 Phương pháp đánh giá khả năng ức chế các enzym in vitro 49

2.3.6.1 Đánh giá khả năng ức chế enzym α-amylase (EC 3.2.1.1) 49

2.3.6.2 Đánh giá khả năng ức chế enzym α-glucosidase (EC 3.2.1.20) 51

2.3.6.3 Đánh giá khả năng ức chế protein tyrosin phosphatase 1B (PTP1B - EC 3.1.3.48) 52

2.3.7 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng trên sự phosphoryl hóa AMPK và IRS-1 53

2.3.8 Phương pháp đánh giá khả năng ức chế sự biệt hóa của tế bào mô mỡ 3T3-L1 56

2.3.9 Các phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học của cắn toàn phần thân cây chuối tiêu 57

2.3.9.1 Định tính các nhóm chất hóa học 57

2.3.9.3 Xác định cấu trúc 57

2.3.10 Xử lý số liệu 58

CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 59

3.1 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HẠ GLUCOSE MÁU TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM 59

3.1.1 Kết quả tác dụng hạ glucose máu của cắn toàn phần 59

3.1.1.1 Tác dụng của cắn toàn phần trên glucose máu của chuột tiêm STZ liều 150mg/kg 59

3.1.1.2 Tác dụng của cắn toàn phần trên glucose máu của chuột ĐTĐ typ 2 60

3.1.1.3 Tác dụng của cắn toàn phần trên khả năng dung nạp glucose của chuột ĐTĐ typ 2 62

3.1.2 Kết quả tác dụng của cắn phân đoạn 64

3.1.2.1 Tác dụng của cắn phân đoạn trên glucose máu của chuột tiêm STZ liều 150mg/kg 64

3.1.2.2 Tác dụng của cắn phân đoạn trên chuột ĐTĐ typ 2 66

3.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CẮN TOÀN PHẦN THÂN CÂY CHUỐI TIÊU 68

3.2.1 Kết quả định tính các nhóm chất 68

3.2.2 Kết quả phân lập các hợp chất trong phân đoạn ethylacetat 69

3.2.2.1 Nhận dạng hợp chất 1 (FE1C) 69

3.2.2.2 Nhận dạng hợp chất 2 (FE6B) 71

3.2.2.3 Nhận dạng hợp chất 3 (FE10A) 72

3.2.2.4 Nhận dạng các chất 4 (FE12A) 73

3.2.3 Kết quả phân lập các hợp chất trong phân đoạn n-butanol 75

3.2.3.1 Nhận dạng hợp chất 5 (FB2A) 76

3.3.3.2 Nhận dạng hợp chất 6 (FB2B) 78

3.3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ HẠ GLUCOSE MÁU CỦA CẮN TOÀN PHẦN THÂN CÂY CHUỐI TIÊU 79

3.3.1 Kết quả trên các mô hình thực nghiệm in vivo 79

3.3.1.1 Nồng độ insulin huyết thanh 79

3.3.1.2 Tình trạng mô tụy nội tiết và tế bào β của chuột ĐTĐ typ 2 84

3.3.1.3 Nồng độ lipid huyết thanh 85

3.3.1.4 Kết quả trên hoạt độ enzym G6Pase gan 86

3.3.2 Kết quả trên các mô hình thực nghiệm in vitro 89

3.3.2.1 Tác dụng ức chế enzym α-amylase 89

3.3.2.2 Tác dụng ức chế enzym α-glucosidase 90

3.3.2.3 Tác dụng ức chế enzym PTP1B 92

3.3.2.4 Tác dụng ức chế sự phosphoryl hóa IRS-1(Ser 307) trên dòng tế bào cơ vân chuột nhắt C2C12 93

3.3.2.5 Tác dụng hoạt hoá AMPK trên dòng tế bào cơ vân nguyên phát chuột nhắt C2C12 95

3.3.2.6 Tác dụng trên sự biệt hóa tế bào 3T3-L1 98

CHƯƠNG IV BÀN LUẬN 99

4.1.1 Lựa chọn liều thử nghiệm 99

4.1.2 Tác dụng của cắn toàn phần 100

4.1.2.2.Trên chuột tiêm STZ liều 150 mg/kg 100

4.1.2.2 Trên chuột cống ĐTĐ typ 2 102

4.1.2.3 Trên khả năng dung nạp glucose của chuột cống ĐTĐ typ 2 104

4.1.3 Tác dụng của cắn phân đoạn 105

4.2 VỀ VIỆC PHÂN LẬP CHẤT TRONG PHÂN ĐOẠN CÓ TÁC DỤNG HẠ GLUCOSE MÁU CHIẾM ƯU THẾ 106

4.3 VỀ CƠ CHẾ TÁC DỤNG HẠ GLUCOSE MÁU CỦA THÂN CÂY CHUỐI TIÊU 111

4.3.1 Cơ chế hạ glucose máu ở mức độ cơ thể 112

4.3.1.1 Về tác dụng trên nồng độ insulin huyết thanh 112

4.3.1.2 Về tác dụng tăng dung nạp glucose trong test dung nạp glucose bằng đường uống 114

4.3.1.3 Về tác dụng trên nồng độ lipid huyết thanh 114

4.3.2.1 Về tác dụng trên mô tụy nội tiết và tế bào β của chuột ĐTĐ typ 2 116

4.3.2.2 Về tác dụng trên sự biệt hóa tế bào mỡ 3T3-L1 118

4.3.2.3 Về khả năng ức chế enzym tiêu hóa glucid 119

4.3.2.4 Về tác dụng ức chế PTP1B 122

4.3.2.5 Về tác dụng ức phosphoryl hóa IRS-1(Ser 307) 124

4.3.2.6 Về tác dụng hoạt hóa AMPK 126

4.2.2.7 Về tác dụng ức chế G6Pase gan 127

4.4 BÀN LUẬN CHUNG 129

KẾT LUẬN 135

1 Tác dụng hạ glucose máu của cắn toàn phần thân cây chuối tiêu 135

2 Cơ chế hạ glucose máu của thân cây chuối tiêu 135

2.1 Trên chuyển hoá 135

2.2 Trên sự nhạy cảm của mô đích với insulin 136

2.3 Trên chuyển hoá và tăng nhạy cảm của tế bào mô đích với insulin 136

ĐỀ XUẤT 136 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ACC Acetyl-coA carboxylase Ac-CoA Acetyl-CoA

ADA Hiệp hội đái tháo đường Mỹ (American Diabetes

Association) AICAR Aminoimidazol-4-carboxamid Ribosid Akt The serine/threonine kinase

AMPK Adenosine monophosphate activated protein kinase ARB Angiotensin receptor blocker

Cho TP Cholesterol toàn phần CXCL Chemokine ligand DAG Diacylglycerol Db/db Diabetes DMEM Môi trường nuôi cấy tế bào (Dulbecco’s modified eagle

medium) DMSO Dimethyl sulfoxid DPP-4 Dipeptidyl peptidase-4 ĐTĐ Đái tháo đường

ECLIA Electro chemiluminessance Immuno Assay F1,6BPase Fructose-1,6-biphosphatase

FBS Huyết thanh bào thai bê (Fetal bovine serum) FDA Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (Food and

drug administration) FFA Acid béo tự do (Free fatty acid) G6Pase Glucose6phosphatase

GDH Glucose dehydrogenase GIP Glucose-dependent insulinotropic polypeptid

GK Glucokinase GLP-1 Glucagon-like peptide 1 GLP-1 Glucagonlike pepdid-1 GLUT Hệ vận chuyển glucose (Glucose-transporter) GOAT Ghrelin o-acyltransferase

GOD Glucose oxidase

GP Glycogen phosphorylase GPR G protein-coupled receptors

VIẾT TẮT TÊN ĐẦY ĐỦ

GSH Glutathione GSK-3 Glycogen synthase kinase-3 HbA1C Hemoglobin A1C

HDACs Histone deacetylase HEPES 4-(2- hydroxyethyl)-1-piperazineethane sulfonic acid HLA Kháng nguyên liên kết tế bào lympho (Human Leukocyte

Antigen) HMGB1 High-mobility-group 1 HOMA Homeostasis model assessment

HS Huyết thanh ngựa (Horse Serum)

IC 50 Nồng độ ức chế 50%

IKK Inhibitory κB kinase

IL Interleukin IRS Insulin receptor substrate JNK Jun N-terminal kinase LC-CoA Long chair-CoA

LDL Low densyti lipoprotein NaCMC Sodium carboxy methyl cellulose

NF-κB Nuclear factor κB NOD nonobese diabetic NPPH 2,2-diphenyl -1-picrylhydrazyl OB/OB Obese

p-AMPK Adenosine monophosphate activated protein kinase trong

đó phân tử threonin172 đã được phosphoryl hóa

PĐ Phân đoạn PI3 Phosphatidylinositol 3 PI3K Phosphatidylinositol 3-kinase PPAR Peroxisome proliferator-activated receptors PTP1B protein-tyrosine phosphatase 1B

SGLT Na + /glucose cotransporter STZ Streptozocin

SUR Sulfunylurea receptor

TG Triglycerid

TP Toàn phần WHO Tổ chức y tế thế giới (World Heath Organization)

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

1 Ba ̉ng 1.1 Tiêu chuẩn chẩn đoán ĐTĐ và tiền ĐTĐ của WHO

49

4 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase

51

5 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng đánh giá tác dụng ức chế PTP1B

70

12 Bảng 3.7 Dữ liệu phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của hợp chất FE6B và chất tham khảo

71

13 Bảng 3.8 Dữ liệu phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của hợp chất FE10A và chất tham khảo

72

14 Bảng 3.9 Dữ liệu phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR của hợp chất FB12A và chất tham khảo

74

15 Bảng 3.10 Số liệu phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của hợp chất FB2A và tài liệu tham khảo

77

16 Bảng 3.11 Số liệu phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của hợp chất FB2B và tài liệu tham khảo

78

11 Bảng 3.12 Nồng độ insulin huyết thanh của các lô chuột tiêm STZ 150 mg/kg sau 15 ngày uống mẫu thử

80

TT NỘI DUNG TRANG

(50 mg/kg) trên một số chỉ số sinh học của chuột cống trắng

19 Bảng 3.14 C hức năng tế bào β và chỉ số kháng insulin của các lô chuột cống béo phì tiêm STZ liều 50 mg/kg

22 Bảng 3.17 Hoạt độ G6Pase gan của các lô chuột tiêm STZ

150 mg/kg sau 15 ngày uống mẫu thử

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

1 Hình 1.1 Sự phá hủy của tế bào β trong cơ chế bệnh sinh của

3 Hình 1.3 Acid béo tự do với sự kháng insulin 9

4 Hình 1.4 Cơ chế tác dụng của các thuốc nhóm sulfunylure 11

5 Hình 1.5 Cơ chế tác dụng của các thuốc ức chế DPP4 13

6 Hi ̀nh 1.6 Cơ chế tác dụng giảm kháng insulin thông qua hoạt hoá

AMPK

14

7 Hi ̀nh 1.7 Cơ chế truyền tín hiê ̣u của PPAR 15

8 Hình 1.8 Liên quan giữa insulin và GLUT4 19

9 Hình 1.9 Cây chuối tiêu chụp ở xã Giang Sơn, huyện Gia Bình,

tỉnh Bắc Ninh (Musa x paradisiaca L.)*

27

10 Hình 2.1 Thân cây chuối tiêu thu hoạch tại xã Giang Sơn, huyện

Gia Bình, tỉnh Bắc Ninh*

32

11 Hình 2.2 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 37

12 Hình 2.3 Sơ đồ chiết các phân đoạn dịch chiết từ thân cây chuối

tiêu

38

13 Hình 2.4 Sơ đồ quy trình định lượng insulin huyết thanh 46

14 Hình 2.5 Sơ đồ quy trình thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của

mẫu thử trên sự phosphoryl hoá của IRS-1 và AMPK

54

15 Hình 3.1 So sánh mức hạ glucose máu của các lô chuột thí

nghiệm tiêm STZ (150 mg/kg) sau 15 ngày uống mẫu thử

60

16 Hình 3.2 Mức hạ glucose máu của các lô chuột ĐTĐ typ 2 sau 15

ngày uống mẫu thử

61

17 Hình 3.3 Sự thay đổi nồng độ glucose máu của chuột ĐTĐ typ 2

thực nghiệm trong test dung nạp glucose

63

18 Hình 3.4 Sự tồn lưu glucose trong máu của chuột cống ĐTĐ typ 2

thực nghiệm trong test dung nạp glucose đường uống sau 120 phút

64

19 Hình 3.5 Mức hạ glucose máu của các lô chuột tiêm STZ 150

mg/kg sau 15 ngày uống hỗn dịch cắn các phân đoạn

66

20 Hình 3.6 Mức hạ glucose máu của các lô chuột ĐTĐ typ 2 sau

15 ngày uống hỗn dịch cắn phân đoạn

68

TT NỘI DUNG TRANG

22 Hình 3.8 Cấu trúc hóa học của hợp chất FE6B 72

23 Hình 3.9 Cấu trúc hóa học của hợp chất FE10A 73

24 Hình 3.10 Cấu trúc hóa học của hợp chất FE12A 75

25 Hình 3.11 Cấu trúc hóa học của hợp chất FB2A 78

26 Hình 3.12 Cấu trúc hóa học của hợp chất FB2B 79

27 Hình 3.13 Mô bệnh học tụy của các lô chuột ĐTĐ typ 2 sau 15

ngày uống mẫu thử (nhuộm HE x 400 lần)

84

28 Hình 3.14 Phần trăm hạ cholesterol và triglyceride của các lô

chuột thí nghiệm trước và sau khi uống mẫu thử

86

29 Hình 3.15 Phần trăm ức chế hoạt độ enzym G6Pase của các lô

chuột tăng glucose máu bởi STZ liều 150mg /kgsau 15 ngày uống mẫu thử

87

30 Hình 3.16 Phần trăm ức chế hoạt độ enzym G6Pase của các lô

chuột ĐTĐ typ 2 sau 15 ngày uống mẫu thử

89

31 Hình 3.17 Tác dụng của cắn toàn phần ở các nồng độ khác nhau

trên lượng IRS-1 phosphoryl hóa ở Ser307

94

32 Hình 3.18 So sánh lượng p-IRS-1 (Ser307) giữa các lô ủ với cắn

toàn phần ở các nồng độ khác nhau

94

33 Hình 3.19 Ảnh hưởng của cycloeucalenon (H1) và daucosterol

(H2) ở các nồng độ khác nhau trên lượng IRS-1 phosphoryl hóa ở Ser307

95

34 Hình 3.20 So sánh lượng p-IRS-1 (Ser307) giữa các lô ủ với

cycloeucalenon (H1) và daucosterol (H2) ở các nồng độ khác nhau

95

35 Hình 3.21 Tác dụng của cắn toàn phần ở các nồng độ khác nhau

trên lượng AMPKα phosphoryl hóa ở Thr172

96

36 Hình 3.22 So sánh lượng p-AMPKα (Thr172) giữa các lô ủ với

cắn toàn phần ở các nồng độ khác nhau

96

37 Hình 3.23 Tác dụng của cycloeucalenon (H1) và daucosterol

(H2) trên lượng AMPK phosphoryl hóa ở Thr172

97

38 Hình 3.24: So sánh lượng p-AMPKα (Thr172) giữa các lô ủ với

cycloeucalenon (H1) và daucosterol (H2) ở các nồng độ khác nhau

97

39 Hình 3.25 So sánh mức độ tổng hợp triglycerid của tế bào mô mỡ

3T3-L1

98

40 Hình 4.1 Các cơ chế tác dụng hạ glucose máu đã được phát hiện

của thân cây chuối tiêu

131

ĐẶT VẤN ĐỀ

Đái tháo đường (ĐTĐ) là một bệnh nội tiết đặc trưng bởi tình trạng tăng glucose máu kèm theo nhiều biểu hiện rối loạn chuyển hóa Hậu quả của sự tăng glucose máu là những biến chứng nghiêm trọng, có thể đe dọa đến tính mạng của người bệnh Theo nghiên cứu của Hiệp hội Đái tháo đường quốc tế, năm

2015 số lượng bệnh nhân mắc bệnh là 415 triệu người, chiếm 8,8% dân số thế giới và vẫn tiếp tục gia tăng mạnh, ước tính đến năm 2040 sẽ có khoảng 642 triệu người mắc bệnh ĐTĐ [67] Sự gia tăng đột biến về tỷ lệ người mắc bệnh ĐTĐ hiện nay đang là một gánh nặng cho ngành y tế Chi phí để quản lý, chăm sóc và điều trị bệnh rất tốn kém Theo công bố của tổ chức Y tế thế giới (WHO), chi phí trực tiếp mỗi năm cho bệnh nhân ĐTĐ ước tính khoảng 673 tỷ đô la Mỹ, chiếm khoảng 16,2% ngân sách chăm sóc sức khoẻ của toàn thế giới [181]

Trong những năm qua, số các nghiên cứu về đái tháo đường đã tăng lên nhanh chóng Kết quả là sự ra đời của các thuốc mới và các ứng du ̣ng trong điều trị, cho phép thầy thuốc cũng như bê ̣nh nhân có nhiều sự lựa cho ̣n hơn Các thuốc điều tri ̣ ĐTĐ đang được sử du ̣ng cho thấy những hiê ̣u quả nhất đi ̣nh [19], [181] Tuy nhiên, hiệu quả lâu dài trong viê ̣c ngăn ngừa các biến chứng của ĐTĐ thông qua kiểm soát glucose máu vẫn còn hạn chế, đồng thời những phản ứng bất lợi khi sử du ̣ng thuốc vẫn là một vấn đề đáng lưu ý [110] Do đó, mô ̣t trong những mối quan tâm hàng đầu của các nhà khoa ho ̣c hiê ̣n nay là viê ̣c tìm ra những thuốc mới điều tri ̣ ĐTĐ dựa trên sự khám phá các đích tác du ̣ng mới, nhằm nâng cao hiê ̣u quả điều tri ̣ đái tháo đường, đồng thời giảm được những phản ứng bất lợi Kế thừa nền y học cổ truyền của dân tộc để từ đó nghiên cứu, sản xuất ra các loại thuốc có nguồn gốc từ thảo dược thiên nhiên hiệu quả và an toàn đang là hướng lựa chọn hợp lý để giải quyết vấn đề này Từ hướng nghiên cứu đó, đã có nhiều loại thảo dược được nghiên cứu và chứng minh tác dụng hạ glucose máu như: Dây đau xương, Chè xanh, Thổ phục linh [7], [8],[13]

Cây Chuối tiêu (Musa x paradisiaca L.) được biết đến như một loại thực

phẩm và cũng là một vị thuốc Theo y học cổ truyền, quả chuối tiêu xanh chữa tiêu chảy, kiết lỵ Chuối tiêu chín có tác dụng nhuận tràng, chữa táo bón, vỏ quả

chuối tiêu chữa lỵ, nhựa quả chuối tiêu xanh chữa hắc lào, lá chuối tiêu non giã nát cầm máu vết thương, làm dịu vết bỏng [3] Nhiều bộ phận dùng của cây chuối tiêu như quả, lá rễ đã được nghiên cứu và chứng minh tác dụng hạ glucose máu [89], [150], [151] Theo kinh nghiệm dân gian của đồng bào dân tộc thiểu số phía bắc Việt Nam và một số quốc gia trên thế giới, phần thân chuối

ép lấy nước uống để điều trị ĐTĐ có hiệu quả làm hạ glucose máu [103], [153] Tuy nhiên, cho đến thời điểm này chưa có tài liệu khoa học nào của Việt Nam nghiên cứu về tác dụng sinh học của thân cây chuối tiêu Hiện nay, trên thế giới

có một vài nghiên cứu về tác dụng hạ glucose máu của thân cây chuối tiêu [89],[163] Các nghiên cứu chỉ mới ở mức độ sàng lọc, kết quả chưa thống nhất, chưa có một nghiên cứu có hệ thống nào đánh giá được tác dụng và cơ chế tác dụng hạ glucose máu của dược liệu này Để có những bằng chứng khoa học về tác dụng và cơ chế tác dụng của thân cây chuối tiêu hướng tới ứng dụng trong

điều trị ĐTĐ, luận án tiến hành đề tài “Nghiên cứu tác dụng và cơ chế hạ

glucose máu của dịch ép thân cây chuối tiêu (Musa x paradisiacal L.) trên thực nghiệm” với 2 mục tiêu:

1 Đánh giá tác dụng hạ glucose máu của cắn toàn phần từ dịch ép thân cây chuối tiêu trên chuột thực nghiệm

2 Nghiên cứu cơ chế hạ glucose máu của cắn toàn phần và một số chất phân lập từ dịch ép thân cây chuối tiêu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG

1.1.1 Định nghĩa, dịch tễ, phân loại đái tháo đường

1.1.1.1 Định nghĩa

Theo Hiệp hô ̣i Đái tháo đường Hoa Kỳ, bê ̣nh đái tháo đường là mô ̣t tâ ̣p hợp những rối loa ̣n chuyển hóa ma ̣n tính đă ̣c trưng bởi sự tăng glucose máu do suy giảm sản xuất insulin và/ hoă ̣c do giảm đáp ứng với insulin ta ̣i các mô Sự tăng glucose máu mạn tính trong bê ̣nh đái tháo đường có liên quan mâ ̣t thiết với những tổn thương lâu dài, rối loa ̣n và suy giảm chức năng của nhiều cơ quan khác nhau, đă ̣c biê ̣t là mắt, thâ ̣n, thần kinh, tim và ma ̣ch máu [19]

1.1.1.2 Dịch tễ

Đái tháo đường là bê ̣nh thường gă ̣p nhất trong các bê ̣nh nô ̣i tiết, là mô ̣t trong 3 bệnh có tốc đô ̣ phát triển nhanh nhất trên thế giới (ung thư, tim ma ̣ch và ĐTĐ) Trong những năm cuối thế kỷ 20, đầu thế kỷ 21, ĐTĐ là bê ̣nh không lây phát triển nhanh nhất [19] Theo thống kê của Hiệp hội Đái tháo đường quốc tế, năm 2015 số người mắc bệnh ĐTĐ ở các khu vực điển hình như sau: Bắc Mỹ 44,3 triệu người, Châu Âu 58,9 triệu người, Đông Bắc Phi 35,4 triệu người, Nam Mỹ 29,6 triệu người, Đông Nam Á 78,3 triệu người và phía Tây Thái Bình Dương 153 triệu người Dự tính đến năm 2040, số người mắc bệnh ĐTĐ tại các vùng này càng gia tăng nhanh chóng với số lượng ước tính: Bắc Mỹ 60,5 triệu người, Châu Âu 71,1 triệu người, Đông Bắc Phi 72,1 triệu người, Nam Mỹ 48,8 triệu người, Đông Nam Á 140,2 triệu người và phía Tây Thái Bình Dương 214,8 triệu người [67] Mă ̣c dù có sự gia tăng cả về ĐTĐ typ 1 và typ 2 nhưng

tốc đô ̣ phát triển của ĐTĐ typ 2 tăng ma ̣nh do sự gia tăng tỷ lê ̣ béo phì và lối

sống ít hoa ̣t đô ̣ng thể lực ở các nước phát triển, cứ 10 người mắc ĐTĐ thì có 9 người mắc ĐTĐ typ 2

Ở Viê ̣t Nam, năm 2015, số người trong đô ̣ tuổi từ 20 đến 79 tuổi mắc ĐTĐ

vào khoảng 3,5 triệu, chiếm 6,0 % dân số trong đô ̣ tuổi này [67] Đặc biệt tỷ lệ

mắc ĐTĐ ở nhóm đối tượng có yếu tố nguy cơ, tuổi từ 30 đến 64 chiếm tỷ lê ̣ là cao nhất Tần suất các yếu tố nguy cơ như BMI (Body mass index) cao, vòng eo

rộng, ít vâ ̣n đô ̣ng thể lực, gia đình có người thuô ̣c các thế hê ̣ câ ̣n kề mắc ĐTĐ cao rõ rê ̣t ở khu vực đồng bằng, đô thi ̣ so với miền núi và trung du [1]

1.1.1.3 Phân loại đái tháo đường

Theo phân loại của Hiê ̣p hô ̣i Đái tháo đường Hoa Kỳ (ADA) năm 2017, ĐTĐ

- Đa ́ i tháo đường typ 1: Chiếm 5-10% trong số những người mắc ĐTĐ với

đặc điểm tế bào β đảo tu ̣y bi ̣ phá hủy gây thiếu hu ̣t insulin tuyê ̣t đối Nguyên nhân củ a sự phá hủy này có thể là do tự miễn di ̣ch

- Đa ́ i tháo đường typ 2: ĐTĐ typ 2 chiếm khoảng 90% số người mắc ĐTĐ

Đó là mô ̣t tâ ̣p hợp những rối loa ̣n chuyển hóa do nhiều nguyên nhân khác nhau, nhưng đều có chung đă ̣c điểm: có sự đề kháng insulin ở mô đích và tiếp theo là

sự suy giảm tiết insulin ở tuyến tu ̣y

- Đa ́ i tháo đường thứ phát: ĐTĐ có thể là hê ̣ quả của những bê ̣nh lý khác

như: các khuyết tâ ̣t di truyền của tế bào β, giảm hoa ̣t tính của insulin do khiếm khuyết gen, các bê ̣nh lý tu ̣y ngoa ̣i tiết (u tu ̣y, chấn thương, cắt bỏ tu ̣y…), các

bệnh nô ̣i tiết khác (u tủy thượng thâ ̣n, u tiết glucagon, u tiết somatostatin, hô ̣i chứ ng Cushing…), do dùng thuốc hoă ̣c hóa chất, do nhiễm trùng và mô ̣t số hô ̣i chứ ng về gen khác…

- Đa ́ i tháo đường thai kỳ: Đái tháo đường ở phu ̣ nữ mang thai thường khởi

phát từ tuần lễ thứ 24 của thai kỳ, đôi khi sớm hơn Nguyên nhân là sự tăng nhu

cầu insulin khi thai phát triển do nhu cầu cung cấp năng lượng của người me ̣ Đồng thời trong quá trình mang thai, sự thay đổi nồng đô ̣ estrogen và progesteron làm thay đổi chức năng tế bào đảo tu ̣y, gây hiê ̣n tượng rối loa ̣n dung

nạp glucose tiềm tàng Hơn nữa, trong giai đoa ̣n này, cơ thể người me ̣ cũng sản xuất ra các nô ̣i tiết tố khác như các lactogen ở nhau thai có tác du ̣ng kháng insulin và tăng thoái hóa lipid

1.1.1.4 Tiêu chuẩn chẩn đoa ́ n

Hiệp hô ̣i Đái tháo đường Hoa Kỳ (ADA) và Tổ chức Y tế thế giới (WHO)

đã đưa ra các tiêu chuẩn chẩn đoán ĐTĐ được áp du ̣ng rô ̣ng rãi Tiêu chuẩn chẩn đoán ĐTĐ của 2 tổ chức này được tóm tắt trong bảng 1.1 [19],[181]

Ba ̉ ng 1.1 Tiêu chuẩn chẩn đoán ĐTĐ và tiền ĐTĐ của WHO và ADA

Chẩn đoa ́ n

HbA1c (%)

FPG (mmol/L)

G2h

(mmol/L)

HbA1c (%)

FPG (mmol/L)

G2h

(mmol/L) Đái tháo

đói 6,1 - 6,9 < 7,8 5,6 - 6,9 < 7,8

FPG: fasting plasma glucose – glucose huyết tương lu ́ c đói

G 2h : Glucose huyết tương 2h sau khi uô ́ng 75g glucose (test dung nạp glucose)

Như vậy, theo WHO và ADA đều đưa ra các tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh đái tháo đường là glucose huyết tương lúc đói ≥ 7,0 mmol/L hoặc glucose huyết tương 2h sau khi uống 75g glucose ≥ 11,1mmol/L hoặc HbA1c ≥ 6,5%

Tuy nhiên, khi đưa ra tiêu chuẩn để chẩn đoán tiền ĐTĐ thì tiêu chuẩn của ADA (5,6 mmol/L) thấp hơn tiêu chuẩn của WHO (6,1 mmol/L) Điều này có tác

đô ̣ng đáng kể đến sự can thiê ̣p vào tiến triển của ĐTĐ, cũng như giúp có các biê ̣n pháp phòng rối loạn glucose vì tỷ lê ̣ những người bi ̣ tiền ĐTĐ (rối loa ̣n glucose hoặc suy giảm glucose máu) chuyển thành ĐTĐ trong vòng 5 năm rất cao

1.1.2 Cơ chế bệnh sinh

1.1.2.1 Bệnh sinh của đái tháo đường typ 1

Đái tháo đường typ 1 là tình trạng thiếu hụt insulin tuyệt đối do tế bào β của đảo tụy bị tổn thương, thường khởi phát ở tuổi trẻ Cho tới nay chưa tìm ra nguyên nhân chính, chỉ biết đây là một bệnh tự miễn.Về cơ chế bệnh sinh có nhiều bằng chứng cho thấy bệnh bệnh sinh của ĐTĐ typ 1 là sự kết hợp giữa ba yếu tố di truyền, miễn dịch và môi trường Hậu quả cuối cùng của quá trình này

là tế bào β bị phá hủy, biểu hiện lâm sàng là ĐTĐ phụ thuộc insulin [52]

Cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ typ 1 trước hết phải kể đến di truyền có liên quan chặt chẽ với yếu tố kháng nguyên bạch cầu người (human leucocyte antigen- HLA) HLA là những phân tử nằm trên bề mặt các tế bào trình diện kháng nguyên Nguy cơ mắc bệnh ĐTĐ sẽ tăng lên đối với những cá thể mang kháng nguyên HLA như: HLA- DR3, HLA- DR4, HLA- DW3, HLA- DW4, HLA- B8, HLA- B15 [68] Các nghiên cứu sàng lọc về di truyền học đã chỉ ra ít nhất 15 vị trí gen khác liên quan đến bệnh ĐTĐ typ 1, trong đó, có 2 gen liên quan tới cơ chế hoạt hóa lympho T Đó là gen mã hóa kháng nguyên lympho T gây độc tế bào (CTLA-4), thuộc nhiễm sắc thể số 2 và gen mã hóa lymphoid

tyrosine phosphatase (PTPN22), được biểu thị đặc hiệu ở tế bào lympho T [58]

Yếu tố thứ hai phải kể đến trong cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ typ 1 là sự tác động của môi trường: Virus, chế độ ăn, các chất độc, stress, yếu tố địa lý Các yếu tố này thúc đẩy quá trình khởi động quá trình tự miễn Khi tiến hành gây nhiễm với virus Coxsacki ở động vật thí nghiệm cho thấy tế bào β bị nhiễm virus

và xuất hiện ĐTĐ typ 1 ở những động vật này [52]

Hình 1.1 Sự phá hủy của tế bào β trong cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ typ 1 [52]

Tiếp theo, các tế bào β của đảo tụy bị phá hủy theo cơ chế tự miễn dịch

Về cơ chế bệnh sinh có nhiều bằng chứng cho thấy bệnh có liên quan đến hai loại là miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào Các yếu tố khởi phát của môi trường sẽ tấn công những cá thể có yếu tố di truyền nhạy cảm đối với ĐTĐ typ 1 Chỉ một tổn thương rất nhỏ của tế bào β cũng làm giải phóng ra kháng nguyên, kích thích cơ thể sinh tự kháng thể gây hoạt hóa phản ứng viêm tiểu đảo tự miễn (hình 1.1) Hiện tượng thâm nhiễm đảo tụy ở các cá thể nhạy cảm về di truyền với bệnh bắt đầu xảy ra ở tế bào β, từ đó sẽ tiếp tục dẫn đến quá trình phá hủy của toàn bộ tiểu đảo tụy Tế bào β có thể bị phá hủy bởi 2 cơ chế

- Các lympho T hiệu ứng giải phóng các hạt chứa perforin vào tế bào đích Cơ chế này cần có sự liên kết giữa receptor của lympho T đặc hiệu với tự kháng nguyên và phức hợp hòa hợp tổ chức của tế bào đích

- Cơ chế làm chết tế bào β theo chương trình (apoptosis) thông qua Fas (CD95) và FasL (CD95L) Cơ chế này không cần sự liên kết giữa receptor của tế bào T với phức hợp hòa hợp tổ chức [68]

Sau khi “khởi động”, một loạt phản ứng miễn dịch sẽ diễn ra: các tiểu đảo tụy bị thâm nhiễm bởi các tế bào đơn nhân, các đại thực bào và tế bào lympho T độc (quá trình thâm nhiễm này được gọi là viêm tiểu đảo tụy) Ở giai đoạn này, trong huyết thanh người bệnh xuất hiện nhiều kháng thể kháng tiểu đảo tụy, đây gọi là giai đoạn tiền ĐTĐ typ 1 Tế bào β bị tổn thương làm cho quá trình sản

Virus

Độc tế bào

MHC +TCR

Hoạt hóa

Sự gia tăng kháng nguyên CD4+ Tế bào β

xuất insulin giảm dần, cho đến khi nồng độ insulin không đủ để duy trì nồng độ glucose máu ở mức bình thường, khi các triệu chứng lâm sàng xuất hiện thì hầu hết các tế bào β của tiểu đảo Langerhan đã bị phá hủy, khả năng bài tiết insulin của tế bào β còn lại ít và cạn kiệt dần, bệnh ĐTĐ thật sự sẽ xuất hiện [176]

1.1.2.2 Bệnh sinh của đái tháo đường typ 2

Đái tháo đường typ 2 là bệnh rối loạn chuyển hóa với đặc điểm là tăng glucose máu mạn tính và sự đề kháng insulin ở mô đích [1], [47]

Cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ typ 2 khá phức tạp, là hậu quả của sự tương tác giữa những rối loạn liên quan đến di truyền và yếu tố môi trường dẫn đến sự xuất hiện các cơ chế gây bệnh Cơ chế diễn biến của bệnh đái tháo đường typ 2 bao gồm: kháng insulin tại mô đích, tiếp theo là hiện tượng bù và sự suy kiệt của

tế bào β [1], [47]

- Hiện tượng kháng insulin

Kháng insulin là tình trạng giảm hoặc mất tính nhạy cảm của mô đích với insulin Kháng insulin xuất hiện từ giai đoạn tiền ĐTĐ typ 2, là cơ chế bệnh sinh chủ yếu và quan trọng nhất trong bệnh sinh của ĐTĐ typ 2 [139]

Có nhiều cơ chế gây kháng insulin Kháng insulin có thể do bất thường tại các vị trí trước, sau và ngay tại receptor insulin ở mô đích Giảm số lượng receptor insulin là yếu tố bất thường tại receptor hoặc có kháng thể kháng receptor insulin là yếu tố ức chế trước receptor [139]

Ở mức độ phân tử, kháng insulin chủ yếu do bất thường trong con đường truyền tín hiệu của insulin (hình 1.2)

Hình 1.2 Con đường truyền tín hiệu của insulin trong chuyển hóa glucose

Insulin thực hiê ̣n quá trình truyền tín hiệu nhờ gắn với receptor nằm ở

màng tế bào Những receptor này có ở hầu hết các tế bào trong cơ thể người và

đô ̣ng vâ ̣t có vú bao gồm cả những tế bào đích đă ̣c trưng của insulin như tế bào gan, cơ, tế bào mô mỡ và những loa ̣i tế bào khác như tế bào máu, tế bào thần kinh…

Receptor củ a insulin (IR) là mô ̣t glycoprotein xuyên màng có phân tử lượng lớn, cấu ta ̣o gồm 2 tiểu đơn vi ̣ α và 2 tiểu đơn vi ̣ β, nối với nhau bởi các

cầu disulfid, có da ̣ng β-α-α-β Trong đó các tiểu phân α nằm ở mă ̣t ngoài tế bào, chứ a phần gắn với insulin, các tiểu phân β nằm xuyên màng Sự gắn insulin vào receptor ở màng tế bào làm hoa ̣t hóa mô ̣t chuỗi tín hiê ̣u dưới da ̣ng dòng thác với

2 con đường truyền tin Trong đó, con đường qua trung gian Insulin receptor substrate (IRS) cụ thể là qua IRS-1 IRS-1, IP3 và Akt có vai trò quan trọng trong điều hòa nhiều chuyển hóa của tế bào (hình 1.2) Đầu tiên là sự khởi đô ̣ng hoạt tính tyrosinkinase của 2 tiểu đơn vi ̣ β của IR, dẫn tới mô ̣t chuỗi phosphoryl

hóa liên tiếp ở các tiểu đơn vi ̣ β và các cơ chất đă ̣c hiê ̣u là IRS-1, IP3, Akt Ta ̣i những tế bào đích của insulin như tế bào cơ, xương và tế bào mô mỡ, con đường qua IP3 tới Akt dẫn tới sự chuyển vi ̣ glucose transporter 4 (GLUT4) từ nô ̣i bào

ra màng bào tương, ta ̣o điều kiê ̣n cho sự vâ ̣n chuyển glucose vào trong tế bào, từ

đó dẫn tới các chuỗi phản ứng chuyển hóa theo hướng làm giảm glucose máu [61] Trên con đường truyền tín hiệu của insulin trong tế bào có nhiều yếu tố tham gia hoặc ảnh hưởng đến quá trình này như IRS-1, IP3, Akt,… chính vì vậy

sự bất thường trong con đường truyền tín hiệu này sẽ gây kháng insulin [139]

Cơ chế kháng insulin do bất thường trong con đường truyền tín hiệu của insulin được giải thích như sau: do giảm hoạt tính tyrosin kinase của vùng sau receptor insulin làm cho insulin khi gắn vào receptor không phát huy được tác dụng sinh học Vì vậy không kích thích được sự vận chuyển glucose vào tế bào [92] Bất hoạt IR có thể do tăng hoạt tính của các enzym khử phosphoryl tại tyrosin của các protein trong con đường truyền tín hiệu nội bào của insulin Một

số enzym đã được nghiên cứu như các protein tyrosinphosphatase (PTP) trong

đó chủ yếu là PTP1B [169] Sự gia tăng phosphoryl hóa các phân tử serin hoặc threonin không những làm giảm khả năng hoạt hóa IP3 mà còn làm giảm quá trình phosphoryl hóa tyrosin tại của insulin receptor, tăng thoái hóa IRS-1 do đó làm giảm nhạy cảm với insulin [139] Bất hoạt IP3 thông qua ức chế tiểu đơn vị điều hòa ngược p85 nằm trên IP3K Sự biểu hiện quá mức dạng hoạt động p100

trên PI3K hoặc kích thích quá mức Akt đều ức chế p85 làm giảm tác dụng sinh

học của insulin [177]

Nguyên nhân chính làm gia tăng sự biểu hiện của các yếu tố gây kháng insulin là thừa cân, béo phì Theo Venables, khoảng 80% bệnh nhân ĐTĐ typ 2 liên quan đến béo phì và lối sống ít vận động [171] Theo báo cáo của trung tâm kiểm soát và phòng bệnh Hoa Kỳ, khoảng 55% bệnh nhân ĐTĐ đồng thời mắc béo phì, 85% bệnh nhân ĐTĐ bị thừa cân [19] Một trong các nguyên nhân gây béo phì là do chế độ ăn nhiều chất béo và ít vận động Ở những bệnh nhân béo phì, nồng độ acid béo tự do (FFA) tăng cao cạnh tranh với glucose trong chuyển hóa tại cơ vân, gia tăng FFA gây rối loạn sử dụng glucose ở ngoại vi [145]

Ở bệnh nhân béo phì, sử dụng năng lượng từ acid béo tự do (FFA) tăng do

đó tạo thành acyl-CoA chuỗi dài (LCFA-CoA) trong bào tương (hình 1.3) [145]

Hình 1.3 Acid béo tự do với sự kháng insulin [145]

Khi được vận chuyển vào trong ty thể, LCFA-CoA được β-oxy hóa một phần tạo thành gốc tự do oxy hóa (ROS - reactive oxygen species), hoạt hoá JKK gây kháng insulin [145]

Nồng độ LCFA-CoA tăng trong bào tương làm tăng diacylglycerol (DAG) Cả DAG và LCFA-CoA hoạt hoá PKC, JKK Cả PKC và JKK làm tăng phosphoryl hóa serin của IRS-1 gây kháng insulin [145]

Mặt khác, nồng độ LCFA-CoA tăng làm tăng nồng độ ceramid do đó ức chế sự phosphoryl hóa Akt/PKB, gây ức chế sự di chuyển GLUT4 ra màng tế bào, giảm thu nạp và sử dụng glucose trong tế bào và làm tăng nồng độ glucose máu [145]

Ở giai đoạn đầu của ĐTĐ typ 2, có sự tăng tiết insulin nhằm bù lại sự giảm nhạy cảm của insulin đối với các mô đích, duy trì tình trạng ổn định của glucose máu Sự làm việc quá mức của tế bào β sau một thời gian sẽ gây suy kiệt Bên cạnh đó, các yếu tố nguy cơ còn có tác động trực tiếp đến tế bào β

Nồng độ FFA và glucose trong máu tăng làm tăng chuyển hóa tại ty thể, tăng các gốc tự do gây gia tăng tình trạng viêm (hình 1.3) Mặt khác, tăng tổng hợp insulin ở tế bào β gây ra hiện tượng stress lưới nội chất Cả hai nguyên nhân này đều dẫn đến sự chết theo chương trình của tế bào β Ở giai đoạn này, sự sản xuất và bài tiết insulin ở tụy giảm đi kèm theo hiện tượng kháng insulin sẵn có gây ra tình trạng mất kiểm soát nồng độ glucose máu kéo theo nhiều biến chứng [145]

1.2 CÁC CƠ CHẾ GÂY HẠ GLUCOSE MÁU

Giá trị nồng độ glucose ở thời điểm 2 giờ sau ăn <7,8 mmol/L là bình thường, từ 7,7- 11,0 mmol/L là rối loạn dung nạp glucose và >11,0 mmol/L là đái tháo đường Sự tăng nhanh glucose trong máu sau ăn tạo ra các đáp ứng của mô và góp phần vào việc hình thành biến chứng của đái tháo đường [181] Tăng glucose máu mạn tính là đặc trưng cơ bản của bệnh ĐTĐ, gây ra các biến chứng nguy hiểm [67] Vì vậy hầu hết các thuốc điều trị bệnh ĐTĐ đều nhằm mục đích làm hạ glucose máu với các cơ chế khác nhau Nhìn chung, cơ chế hạ glucose máu rất phong phú, mỗi thuốc có thể tác động theo một hoặc nhiều cơ chế khác nhau Dưới đây là một số cơ chế làm hạ glucose máu đã được

áp dụng trong điều trị hoặc trong các nghiên cứu thực nghiệm

1.2.1 Tăng cường số lượng insulin nội sinh

Insulin là một hormon quan trọng được tiết ra từ tế bào β tuyến tụy với vai trò sinh học là hạ glucose máu, qua đó giúp cơ thể kiểm soát và sử dụng glucose một cách hiệu quả Bên cạnh sử dụng insulin ngoại sinh, vốn chỉ được chỉ định trong ĐTĐ typ 1 và ĐTĐ typ 2 khi bệnh nhân không đáp ứng hoặc đáp ứng kém với các loại thuốc điều trị ĐTĐ bằng đường uống khác [19], có nhiều giải pháp khác nhằm tăng cường số lượng insulin nội sinh Tác động của thuốc trên tụy chủ yếu bao gồm tác dụng kích thích tiểu đảo tụy sản xuất insulin hoặc bảo vệ và phục hồi tế bào β đã bị tổn thương do sự tấn công của các cytokin hoặc các tác nhân bệnh sinh khác [77], [129]

1.2.1.1 Tăng cường số lượng insulin thông qua ức chế kênh K ATP, tăng nồng

độ calci nội bào

Đây là cơ chế tăng tiết insulin của các thuốc điều trị ĐTĐ phổ biến hiện nay

Sulfonylurea gắn vào thụ thể bề mặt của màng tế bào β (ở tụy) và ức chế kênh K+ nhạy cảm với ATP ngăn không cho K+ thoát ra, làm màng tế bào β bị khử cực Sự khử cực màng tế bào gây mở kênh calci phụ thuộc điện thế, calci ngoài tế bào vào trong tế bào, lượng calci được tăng lên trong bào tương sẽ kích thích giải phóng insulin từ các hạt tiết của tế bào β (hình 1.4) [77]

Hình 1.4 Cơ chế tác dụng của các thuốc nhóm sulfunylure [77]

Thuốc được sử dụng để điều trị đái tháo đường tác dụng theo cơ chế này điển hình là các sulfunylure Ngoài ra, có 3 hoạt chất thuộc nhóm meglitinid cũng đã được đưa vào sử dụng là repaglinid, glimepirid và nateglinid [19] Bên cạnh đó, một số dược liệu cũng được chứng minh tác dụng tăng sản xuất insulin theo cơ chế này Nghiên cứu chứng minh tác dụng kích thích tế bào β sản xuất insulin trên dược liệu được các nhà khoa học nghiên cứu chủ yếu thông qua định lượng insulin huyết thanh sau khi dùng thuốc/chế phẩm thử hoặc qua thực

nghiệm in vitro trên đảo tụy cô lập và tế bào β đơn dòng Các dòng tế bào hay

được sử dụng nhất là β-TC-6, BRIN-BD11, RIN-5F, HIT-T15 của chuột [24],

[129], [167] Ví dụ như trong thí nghiệm in vitro với dịch chiết methanol của cây

cáp gai đen (Capparis zeylanica ) trên dòng tế bào MIN6-β, kết quả cho thấy nồng độ insulin tăng do tăng nồng độ Ca2+ nội bào [24] Ranjbari (2016) khi

nghiên cứu cây tầm ma (Urtica dioicand) cho thấy dịch chiết nước từ dược liệu

này tăng tiết insulin trên tế bào RIN-5 F của chuột [129] Trong nghiên cứu của

Thomas về dịch chiết nước của cây dây cóc (Tinospora crispain) thể hiện tác

dụng tăng tiết insulin trên tế bào HIT-T15 và BRIN-BD11 [167]

Ngoài cơ chế tăng cường sản xuất insulin thông qua ức chế kênh KATP,

tăng nồng độ calci nội bào, một tác động quan trọng khác đối với sự tăng sản

hoặc các yếu tố gây chết theo chương trình (apoptosis) của tế bào β cũng đang được các nhà khoa học nghiên cứu [49],[156] Chemokine CXC là các thụ thể của protein G, có trên màng tế bào, cùng với các cytokine tạo ra các phản ứng viêm Có bảy ligan chemokine CXC đã được phát hiện ở động vật có vú Trong

đó mức độ lưu hành CXCL10 (phối tử của CXCR3) cao ở những bệnh nhân ĐTĐ typ 1 Ức chế CXCL10 / CXCR3 là một chiến lược tiềm năng để điều trị ĐTĐ typ 1 Một thuốc mới có tên là pCAGGS-CXCL10 đang được thử nghiệm với cơ chế trung hòa CXCL 10, tăng sinh tế bào β, cải thiện tình trạng bị phá hủy của tế bào β trên chuột ĐTĐ typ 1 [49]

1.2.1.2 Tăng cường số lượng insulin thông qua các incretin

Những kỹ thuâ ̣t xét nghiệm miễn dịch đã chứng tỏ tác động của glucose tại tụy không phải là yếu tố duy nhất gây tăng tiết insulin Nghiên cứu của Nauck cho thấy đáp ứng tăng tiết insulin với glucose đường uống vượt xa so với glucose đưa vào bằng đường tiêm tĩnh mạch, hiện tượng này gọi là hiệu ứng incretin Một số hormon nguồn gốc từ ruột đã được chứng minh là có thể gây ra hiệu ứng incretin, gọi chung là các hormon incretin Trong số đó, quan trọng nhất là glucagon-like peptid -1(GLP-1) Đây là hormon có tác dụng tăng sản xuất insulin Tác dụng của hormon này trên sự chuyển hóa glucose đã được chứng minh qua nhiều thử nghiệm [108]

GLP-1 gây tăng tiết insulin qua cơ chế hoạt hóa GLP-1R ở tế bào β đảo tụy dẫn tới sự tăng AMP vòng và hoạt hóa PKA làm đóng kênh K+, tăng tiết insulin [122] Các thuốc là những chất chủ vận của GLP-1 đã được phê duyệt trong điều trị hiện nay là: exenatid, liraglutid, albiglutide, dulaglutid [19] Ngoài ra taspoglutid có cấu trúc tương tự GLP-1 đang được nghiên cứu và thử nghiệm [48] Bên cạnh các chất trực tiếp tác động lên receptor GLP-1R, hướng tiếp cận thứ hai là tăng cường số lượng GLP-1 nội sinh Một chất có tên là PTU-cellulose

là chất chủ vận của receptor TAS2R38 được thử nghiệm trên chuột, kết quả cho thấy tăng tiết insulin thông qua tăng nồng độ GLP-1 [122] Hiệu ứng tăng tiết GLP-1 còn phụ thuộc một receptor khác là GPR119 thuộc nhóm A trong các receptor liên kết với protein G Kích hoạt GPR119 làm tăng GLP-1 ở ruột, tăng tiết insulin ở tụy và hạ glucose máu [34] 76 dẫn chất khác nhau là chất chủ vận trên GPR119 đã được công bố và đang tiến hành thử nghiệm lâm sàng pha I và

II [134]

1.2.1.3 Tăng cường số lượng insulin thông qua ức chế DPP-4

Trong cơ thể, GLP-1 dễ dàng bị bất hoạt bởi sự phân cắt của DPP-4 (hình 1.5) Do đó tăng tác dụng của GLP-1 bằng cách ức chế DPP-4 theo cơ chế ức chế cạnh tranh là cơ chế tác dụng của 1 số thuốc đã được phê duyệt điều trị ĐTĐ hiện nay là sitagliptin, saxagliptin, linagliptin, alogliptin [19]

Hình 1.5 Cơ chế tác dụng của các thuốc ức chế DPP4 [175]

Ngoài các cơ chế làm tăng cường số lượng insulin đã nêu ở trên, các nhà khoa học còn nghiên cứu sự tăng tiết insulin thông qua các cơ chế khác như:

- Ức chế ghrelin (peptid điều hòa sự tiết hormon) [162] Một số dẫn chất quinazolinon đang được thử nghiệm với khả năng đối vận với receptor của ghrelin, từ đó tăng nồng độ insulin nội sinh, làm giảm glucose máu [137]

- Tăng tiết insulin do kích thích của glucose (GSIS) thông qua receptor của acid béo Fasiglifam (chất chủ vận của GPR40) đang được nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng pha III với cơ chế này TAK-875 là một chất chủ vận mới của GPR40 cũng đã được các nghiên cứu về khả năng tăng tiết insulin phụ thuộc nồng độ glucose [160] Một nghiên cứu khác cũng chỉ ra rằng hoạt hóa receptor ephinA cũng tăng cường số lượng của insulin phụ thuộc nồng độ glucose CYN154806 là chất chủ vận của ephrin A với tác dụng giảm nồng độ glucose máu, tăng dung nạp glucose, tăng tiết insulin ở chuột ĐTĐ typ 2 [66]

1.2.2 Tăng cường nhạy cảm của mô đích với insulin

Khi tế bào của mô đích không đáp ứng với insulin trong chuyển hóa glucose Do đó, tế bào không sử dụng được glucose làm cho nồng độ glucose trong máu tăng lên Các nghiên cứu đã ghi nhận nhiều thuốc có tác dụng làm tăng nhạy cảm của tế bào mô đích với insulin thể hiện qua sự giảm glucose máu, giảm nồng độ insulin huyết thanh lúc đói và giảm các chỉ số lipid máu [100], [157]

1.2.2.1 Tăng cường nhạy cảm của mô đích với insulin thông qua hoạt hóa AMPK

AMP-Activated protein kinase (AMPK) là mô ̣t enzym serin/threonin protein kinase có mă ̣t rất phổ biến trong cơ thể AMPK được go ̣i là “máy đo nhiên liệu”, nó có khả năng cảm biến tra ̣ng thái năng lượng ở cả tế bào biê ̣t lâ ̣p

và toàn bô ̣ cơ thể Khi được hoa ̣t hóa, AMPK sẽ khởi đô ̣ng quá trình di ̣ hóa ta ̣o

ra ATP đồng thời ức chế quá trình đồng hóa sử du ̣ng ATP Có 3 enzym là LKB1, CaMKK và TAK1 có khả năng hoa ̣t hóa AMPK nhờ khả năng xúc tác kinase ngược dòng, gây phosphoryl hóa AMPK Ngoài tác dụng trên chuyển hoá như tăng hấp thu glucose, tăng tổng hợp glycogen và giảm tổng hợp lipid, AMPK còn hoạt hoá IRS-1 trong chuỗi truyền tín hiệu của insulin, làm giảm kháng insulin (hình 1.6) [100] AMPK tham gia vào nhiều quá trình chuyển hóa trong cơ thể (hình 1.6) Sự hoa ̣t hóa AMPK có thể gây tăng gia nhâ ̣p glucose vào

cơ, giảm tân ta ̣o glucose ở gan, tăng oxy hóa acid béo ở gan và cơ, giảm tổng

hợp acid béo ở gan và mô mỡ, tăng hoa ̣t đô ̣ng của ty thể, hoa ̣t hóa AMPK ở gan gây hạ glucose máu [43], [100]

Hi ̀nh 1.6 Cơ chế tác dụng giảm kháng insulin thông qua hoạt hóa AMPK [100]

Nhó m biguanid, mà đa ̣i diê ̣n là metformin đã được sử dụng điều tri ̣ đái tháo đường theo cơ chế gây hoa ̣t hóa AMPK [100] Bên cạnh thuốc kinh điển là metformin, các hợp chất phân lập từ dược liệu cũng đã được chứng minh cơ chế giảm kháng insulin thông qua hoạt hóa AMPK ví dụ như quecertin và berberin [43]

1.2.2.2 Tăng cường nhạy cảm của mô đích với insulin thông qua receptor PPAR

Một trong những cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ typ 2 là sự đột biến hoặc thay đổi biểu hiện gen của receptor PPAR (peroxisome proliferator-activated receptor) PPAR là những receptor ở màng nhân tế bào, khi gắn với các ligand

đă ̣c hiê ̣u, PPAR ta ̣o thành dimer với receptor X retinoid (RXR), phức hợp này sẽ

gắn với ADN làm điều hòa quá trình phiên mã và dịch mã của một số protein quan trọng trong quá trình biệt hóa tế bào cũng như chuyển hóa glucose và lipid PPAR có hai loại PPARα và PPAR (hình 1.7) [123]

Hi ̀nh 1.7 Cơ chế truyền tín hiê ̣u của PPAR [123]

Nghiên cứu liên quan đến thuốc điều trị ĐTĐ tác dụng theo cơ chế hoạt hoá PPAR tập trung với PPAR bởi vì một trong những đáp ứng sinh học quan trọng nhất liên quan đến receptor PPAR là kích thích biệt hóa tế bào mỡ, kích thích các enzym và protein vận chuyển của tế bào mỡ như lipoprotein lipase, protein vận chuyển acid béo để thu nạp acid béo PPAR-γ phân bố nhiều nhất ở

mô mỡ và ruô ̣t già Ligand nô ̣i sinh đă ̣c hiê ̣u với PPAR-γ là mô ̣t số loa ̣i chất béo như prostaglandin, leukotrien [123] Khi PPAR gắn vào ligan có tác dụng làm giảm nồng độ acid béo tự do trong huyết tương, tức là gián tiếp cải thiện nguyên

Aid béo tự do

Màng tế bào Chất béo

Nhân

tế bào

nhân gây kháng insulin ở mô đích Bên cạnh đó, còn làm tăng nhạy cảm với insulin thông qua sự thay đổi các hormon đặc hiệu do tế bào mỡ sản xuất (adipokin) Hoạt hóa PPAR- gây kích thích sự tạo thành adiponectin, một hormon có tác dụng làm tăng oxi hóa acid béo, tăng đáp ứng với insulin và giảm

sự tạo thành mảng vữa xơ, đồng thời làm giảm các cytokin cản trở hoạt động của insulin như TNF-, resistin, IL6 Tổng hợp của tất cả các tác dụng nói trên là làm tăng đáng kể tác dụng của insulin tại mô đích [123]

Các thiazolidinedion là nhóm chất chủ vâ ̣n cho ̣n lo ̣c trên receptor PPAR thông qua hoạt hóa PPAR-, thiazolidindion (TZD) làm tăng nha ̣y cảm với insulin ở mô đích Hiện nay, do nhiều tác dụng không mong muốn của các thiazolidindion, nhóm thuốc này đã không còn được sử dụng Các nhà khoa học đang tiếp tục mở rộng tìm kiếm các chất chủ vận khác trên receptor PPAR với

17 chất chủ vận trên receptor PPAR có tác dụng giảm kháng insulin [25]

1.2.2.3 Tăng cường nhạy cảm của mô đích với insulin thông qua quá trình truyền tín hiệu của insulin

Tăng cường nhạy cảm của mô đích với insulin thông qua quá trình truyền tín hiệu của insulin ở tế bào đích với đặc trưng là sự phosphoryl hóa Tyr hậu receptor Thực tế, hiện tượng kháng insulin trong bệnh ĐTĐ typ 2 cũng có nguyên nhân quan trọng là sự giảm phosphoryl hóa Tyr, tăng phosphoryl hóa Ser hoặc Thr của insulin receptor Nhiều thuốc đã được chứng minh tác dụng ức chế phosphoryl hóa Ser của insulin receptor, do đó trực tiếp tác động vào nguyên nhân gây kháng insulin như exendin-4, rosiglitazon, pioglitazon Các thuốc khác như neprhilin, anephril đang trong giai đoạn nghiên cứu thử nghiệm [92] Nghiên cứu về dược liệu tác dụng theo cơ chế này của Sridha (2007) cho thấy

dịch chiết quả Mướp đắng (Momordica charantia L.) có tác dụng khôi phục khả

năng phosphoryl hóa Tyr của insulin receptor trên chuột cống béo phì ĐTĐ typ 2 [157]

Tăng cường nhạy cảm của mô đích với insulin thông qua con đường truyền tín hiệu nội bào của insulin còn bị ảnh hưởng bởi số lượng và ái lực gắn hormon của receptor ở tế bào đích Các nghiên cứu chủ yếu được thực hiện trên

đối tượng là dược liệu Lá cây dâu (Folium Mori) được nghiên cứu với sự giảm

glucose máu, tăng dung nạp glucose, giảm kháng insulin, giảm cholesterol, triglycerid toàn phần đi kèm với sự tăng biểu hiện mRNA và protein của IRS-1, PI3K P85α [30]

Quá trình truyền tín hiệu của insulin ở tế bào đích gây ra chuỗi phosphoryl hóa IR, IRS-1,2, hoạt hóa IP3 kinase và protein PDK1, Akt, dẫn tới phosphoryl hóa và gây bất hoạt GSK-3αβ Hiện nay, người ta đã tìm ra nhiều vai trò quan trọng của GSK-3 trong điều hòa hoạt động tế bào, đặc biệt là trong quá trình truyền tín hiệu của insulin GSK-3 gây ra sự phosphoryl hóa gốc Ser307 và Ser332

của IRS-1, làm ức chế sự phosphoryl hóa tyrosin và làm giảm đi sự truyền tín hiệu của insulin Do đó, bất hoạt GSK-3 làm tăng nhạy cảm của mô đích với insulin [59] 7-hydroxy-benzimidazol là một hoạt chất có tác dụng theo cơ chế này [147] Tương tự như vậy muối lithium cũng là một trong những chất có tác dụng ức chế GSK-3 [31] Theo một nghiên cứu tổng quan của Pandey (2016) cho thấy nhiều chất ức chế GSK-3 hiện nay đang được nghiên cứu thử nghiệm [119]

Quá trình phosphoryl hóa Tyr là thuận nghịch, chiều nghịch được xúc tác bởi protein tyrosin phosphatase (PTP) Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng nồng độ cao PTP-1B nội bào làm giảm sự phosphoryl hóa IR và IRS-1 Do đó, ức chế PTP-1B tăng nhạy cảm của mô đích với insulin [169] Theo một nghiên cứu tổng quan, đã có 44 chất có tác dụng ức chế PTP1B [96] Rễ cây Chóc máu nam được nghiên cứu tại Việt Nam cũng được chứng minh có tác dụng ức chế PTP1B [11] Nghiên cứu của Nguyen P.H (2015) về chất selariscinin được phân lập từ cây

trường sinh thảo (Selaginella tamariscina) cũng cho thấy tác dụng ức chế

PTP1B [109]

Một yếu tố gây kháng insulin cũng được đề cập tới là histone deacetylase (HDAC) (các enzym xúc tác cho quá trình khử eacetyl nhóm -N-acetyl lysine amino acid ở phần đuôi của histon) [143] HDAC không chỉ ức chế IRS-1 trong chuỗi truyền tín hiệu của insulin mà còn gắn vào promoter của gen mã hóa tổng hợp GLUT4, làm giảm quá trình tổng hợp GLUT4, giảm thu nạp glucose Vorinostat, trichostatin A và acid valproic là các chất có tác dụng giảm chế ức chế HDAC trên chuột ĐTĐ typ 2 [60], [83],

1.2.3 Tác dụng điều hòa, chuyển hóa tương tự như insulin

Insulin là hormon có vai trò đặc biệt quan trọng trong điều hòa glucose máu Khi glucose máu tăng cao, insulin tăng cường sự thu nhận glucose từ máu vào tế bào cơ và mô mỡ thông qua kích thích GLUT4 Ngoài ra, insulin còn tham gia vào quá trình điều hòa các enzym chủ chốt trong quá trình tổng hợp và thoái hóa glucose [64] Nghiên cứu cho thấy một số thuốc, hoạt chất và dược

1.2.3.1 Tác dụng tương tự insulin thông qua các enzym

Trước hết phải kể đến cơ chế ức chế các enzym trong quá trình tạo glucose nội sinh như glucose-6-phosphatase (G6Pase), fructo1,6 biphosphatase (F1,6BPase) và glycogen phosphorylase (GP)

Glucose-6-phosphatase (G6Pase) là mô ̣t phức hê ̣ enzym xúc tác phản ứng phân cắt glucose-6-phosphat (G6P) thành glucose và gốc phosphat vô cơ, đây là khâu cuối cùng trong cả hai quá trình thoái hóa glycogen và tân ta ̣o glucose Ức chế G6Pase cũng là một trong các đích của thuốc điều trị ĐTĐ đang được quan tâm [155],[185] Metformin là thuốc điều trị ĐTĐ typ 2 kinh điển được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay Ngoài cơ chế làm tăng nhạy cảm của mô đích với insulin thông qua AMPK, metformin còn ức chế G6Pase làm giảm tổng hợp glucose tại gan Tác dụng này của metformin là do ức chế biểu hiện gen của G6Pase và hòan toàn độc lập với con đường truyền tín hiệu của insulin Một hợp chất khác

là eugenol khi sử dụng cho chuột ĐTĐ typ 2 cũng có giảm glucose máu và giảm hoạt độ enzym G6pase gan [159]

Một enzym chủ chốt khác trong con đường tân ta ̣o glucose là fructo1,6 biphosphatase (F1,6BPase) F1,6BPase xú c tác chuyển F1,6BP thành F6P trong con đường tân ta ̣o glucose do đó ức chế F1,6Bpase gây hạ glucose máu [124] CS-917 là một hoạt chất được phát triển bởi Metabasis với tác dụng ức chế F1,6BPase đang được đưa vào thử nghiê ̣m lâm sàng [186] Trong nghiên cứu của Srinivasan, uegenol không chỉ có tác dụng ức chế G6Pase mà còn có cả tác dụng ức chế F1,6BPase trên chuột ĐTĐ typ 2 [159]

Ngoài cơ chế hạ glucose máu thông qua ức chế hai enzym tân tạo glucose

là G6Pase và F1,6Bpase, sự ức chế glycogen phosphorylase (GP), (một enzym chủ chốt trong quá trình thoái hóa glycogen cũng glucose máu Đây cũng là một đích triển vọng trong điều trị ĐTĐ thực nghiệm được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm [44], [63]

Cơ chế gây hạ glucose máu bởi hoạt hóa các enzym trong quá trình thoái hóa glucose như glucokinase/hexokinase (GK), phosphofructokinase-1 (PFK-1) cũng được nghiên cứu [6], [21] Bên cạnh sự hoạt hóa các enzym trong quá trình thoái hóa glucose gây hạ glucose máu Với tác dụng hoạt hóa enzym glycogen

synthase, dịch chiết ethanol lá cây cà ri (Murraya koenigii) khi sử dụng cho

chuột ĐTĐ thực nghiệm gây bởi STZ, cho thấy sự khôi phục lượng glycogen gan, tăng hoạt độ glycogen synthase và giảm hoạt độ GP [21] Kết quả nghiên

cứu trên cây hương nhu tía (Ocimum sanctum L) ở mô hình ĐTĐ thực nghiệm

bởi alloxan cho thấy có sự giảm glucose máu, kèm theo tăng nồng độ glycogen trong gan [82]

1.2.3.2 Tác dụng tương tự insulin thông qua hoạt hóa GLUT4

GLUT4 bình thường được dự trữ trong các hạt Khi insulin gắn với receptor, các hạt chuyển ra bề mặt tế bào, hòa lẫn vào màng, làm tăng số lượng GLUT4 ở màng tế bào để vận chuyển glucose vào trong tế bào Khi lượng insulin giảm, GLUT4 được tách khỏi màng tế bào nhờ cơ chế thực bào, hình thành các hạt nhỏ, sau đó hòa vào nhau thành các hạt endosome lớn hơn Các hạt endosome này chứa nhiều GLUT4 tiếp tục được phân chia thành các hạt nhỏ, sẵn sàng vận chuyển ra màng tế bào khi nồng độ insulin tăng lên (hình 1.8) [182]

Hình 1.8 Liên quan giữa insulin và GLUT4 [182]

Hạ glucose máu thông qua cơ chế kích thích GLUT4 đã được chứng minh

trong một số nghiên cứu [42], [70] Nghiên cứu về tác dụng của lá cây sung ngọt

(Ficus carica L) trên chuột béo phì ĐTĐ typ 2 thực nghiệm, cho thấy có sự giảm

nồng độ glucose máu kèm theo tăng biểu hiện gen GLUT4 [70] Nghiên cứu mới đây của Dehghan (2016) về một chế phẩm có tên là Saffron được sản xuất từ

nhụy hoa cây nghệ tây (Autumn Crocus) cho thấy tác dụng hoạt hoá và tăng biểu hiện gen của GLUT4 trên cả in vivo và in vitro [42]

1.2.4 Ức chế tiêu hóa carbohydrat

Sự tăng nhanh glucose máu sau bữa ăn góp phần vào sự hình thành các biến chứng của ĐTĐ Các nghiên cứu với mục đích hạn chế tăng glucose máu sau ăn thường tập trung vào các enzym tham gia vào quá trình tiêu hóa glucid

Enzym đã được biết đến từ lâu là α-glucosidase xú c tác phản ứng thủy phân maltose thành D-glucose, làm tăng nồng độ glucose máu sau ăn Nhóm thuốc tác dụng theo cơ chế ức chế α-glucosidase, hạn chế tăng glucose máu sau

ăn như acarbose, miglitol và voglibose đã được sử dụng rộng rãi trong điều trị ĐTĐ [19],[80]

Tăng nồng độ glucose máu sau ăn do thủy phân liên kết α của các polysaccharid, tinh bột và glycogen còn phụ thuộc vào vai trò quan trọng của enzym α-amylase Nghiên cứu ức chế enzym α-amylase, hạn chế tăng glucose

máu sau ăn như dịch chiết lá chè xanh (Camellia sinensis L.), chàm mèo (Strobilanthes cusia N.) ức chế α-amylase giúp làm giảm glucose máu sau ăn

[38],[76]

1.2.5 Các cơ chế khác gây hạ glucose máu

Ngoài các cơ chế gây hạ glucose máu nói trên, một số nghiên cứu đã chứng minh nồng độ glucose máu còn bị ảnh hưởng bởi các yếu tố khác

90% glucose được tái hấp thu bởi hệ vận chuyển protein SGLT2 ở ống lượn gần Do vậy, ức chế SGLT2 sẽ làm giảm glucose máu [125] Các thuốc dapagliflozin, canagliflozin, empagliflozin tác dụng theo cơ chế này đã được phê duyệt sử dụng trong điều trị [19] Một số chất đang trong giai đoạn nghiên cứu lâm sàng như sergliflozin, remogliflozin, ASP-1941, BI-10.773 và BI-44.847 [125], [178]

Sự tái hấp thu glucose tại ống thận còn được điều hoà bởi receptor của yếu

tố tăng trưởng β (Transforming growth factor-β/TGF-β receptor), một yếu tố gây

xơ hóa thận từ đó dẫn đến giảm sức lọc của cầu thận gây tăng glucose máu Do

đó ức chế TGF-β sẽ làm tăng sức lọc của cầu thận giảm glucose máu sau ăn [50], [85] Nghiên cứu của Kim và cộng sự với hyperosid và quercitin có trong dịch

chiết ethanol cây Osteomeles schwerinae, cho thấy 2 chất này có tác dụng hạ

glucose máu đi kèm với ức chế sự biểu hiện gen của TGF-β [85]

Hạn chế sự tăng glucose máu sau bữa ăn có còn liên quan đến amylin, một hormon peptid được bài tiết từ tế bào β đảo tụy đồng thời với insulin sau khi ăn,

có tác dụng làm giảm tiết glucagon Các nghiên cứu đã chứng minh có sự lắng đọng và kết tu ̣ amylin trong bệnh ĐTĐ typ 2 [93] Pramlintid là một chất tổng hợp hóa học với ưu điểm không bi ̣ kết tu ̣ như amylin và có những đă ̣c tính dược

đô ̣ng ho ̣c và dược lực ho ̣c tương tự như amylin nô ̣i sinh đã được phê duyê ̣t để điều tri ̣ đái tháo đường typ 1 và đái tháo đường typ 2 [19]

Các nghiên cứu đã chứng minh béo phì có liên quan chặt chẽ với bệnh sinh của ĐTĐ typ 2 Béo phì liên quan đến leptin, một hormon do các tế bào mô mỡ bài tiết ra, nhiệm vu ̣ truyền tín hiê ̣u của gen ob cho não nhận biết cảm giác no,

dẫn tới ngừng đưa thức ăn vào cơ thể Trên tu ̣y, leptin làm tăng nha ̣y cảm của insulin và giảm triglycerid, cholesterol toàn phần Sử dụng leptin điều trị cho chuột ĐTĐ typ 2 béo phì làm giảm nồng độ glucose máu [35], [165]

1.3 CÁC MÔ HÌNH THỰC NGHIỆM TRONG NGHIÊN CỨU THUỐC ĐIỀU TRỊ ĐÁI THÁO ĐƯỜNG

1.3.1 Các mô hình thực nghiệm in vivo

1.3.1.1 Mô hình gây bệnh ĐTĐ typ 1

ĐTĐ typ 1 là do tổn thương thường do tự miễn tế bào β đảo tụy Do vậy, các mô hình ĐTĐ typ 1 cũng được phát triển dựa trên nguyên tắc gây suy giảm

về cấu trúc và hoặc chức năng của đảo tụy Có nhiều phương pháp khác nhau để gây ĐTĐ typ 1 thực nghiệm trên động vật, từ đơn giản đến phức tạp Dưới đây

là một số phương pháp được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu dược lý thực nghiệm

- Đái tháo đường typ 1 do di truyền

Gây bệnh ĐTĐ typ 1 theo phương pháp lai tạo và chọn giống bằng cách chuyển gen hoặc gây đột biến gen Trên mô hình này, các nhà khoa học đã tìm ra

nhiều loại gen liên quan đến sự phá hủy tế bào β như: Idd1, Idd5, Idd 9 trên chuột NOD; Ins2 trên chuột Akita hay Iddm1 trên chuột BB [97] Mô hình này

còn có những hạn chế nhất định như quy trình gây bệnh phức tạp và khả năng thành công giữa các cá thể là không ổn định phụ thuộc vào đáp ứng miễn dịch của từng cá thể Mặt khác, thời gian gây bệnh kéo dài 18-20 tuần, chi phí tốn kém Hiện nay, chưa thấy có các giống chuột ĐTĐ typ 1 do di truyền tại Việt Nam

- Đái tháo đường typ 1 do cắt bỏ tuyến tụy

Mô hình gây ĐTĐ typ 1 bằng cách cắt bỏ tuyến tụy là một phương pháp kinh điển gây ĐTĐ typ 1 ở một số loài động vật với các triệu chứng tương tự như ĐTĐ typ 1 ở người Mức độ trầm trọng của bệnh phụ thuộc vào mức độ phá hủy tụy (một phần hay hòan toàn) Điểm hạn chế của mô hình này là sự tái sinh của tuyến tụy còn lại Do đó mô hình này chỉ thích hợp cho các nghiên cứu về cơ chế thích nghi của tế bào β tuyến tụy Cắt bỏ một phần tuyến tụy là yêu cầu kỹ thuật cao, phải sử dụng thuốc mê và kháng sinh phòng nhiễm khuẩn, có thể gây ảnh hưởng đến kết quả nghiên cứu Sau khi cắt bỏ phần lớn tụy, động vật ít đáp ứng với các tác động nhằm hạ glucose máu Hơn nữa, trong quá trình làm thí nghiệm cần phải thường xuyên bổ xung các enzym tụy ngoại tiết khác cho động vật thực nghiệm [75]

Hiện nay, mô hình gây bệnh ĐTĐ týp 1 thường được tạo ra bằng một số tác nhân phá hủy tế bào β tuyến tụy trong đó có streptozptocin (STZ) hoặc alloxan đã thực hiện trên các loài động vật như chó, mèo, thỏ và các động vật thuộc bộ gặm nhấm [32], [75]

+ Sử dụng alloxan liều cao (120-150 mg/kg)

Alloxan, một hợp chất pyrimidin triceton có cấu trúc tương tự glucose, tích lũy gây độc trực tiếp và chọn lọc trên tế bào β của tuyến tụy Alloxan phá hủy tế bào β gây ra tình trạng ĐTĐ phụ thuộc insulin Alloxan cũng có tác dụng

ức chế glucokinase do đó ức chế bài tiết insulin Động vật được gây ĐTĐ bằng alloxan có những biểu hiện lâm sàng giống biểu hiện ĐTĐ ĐTĐ typ 1 trên người [28] Liều dùng để gây ĐTĐ trên động vật thực nghiệm tùy thuộc vào từng nghiên cứu [26], [28] Ưu điểm của mô hình này là dễ thực hiện, gây được mức glucose máu tăng cao ổn định trong một thời gian ngắn sau khi tiêm alloxan nhưng nhược điểm là tế bào gan, thận và các cơ quan khác cũng bị ảnh hưởng bởi sự oxy hóa của alloxan [26]

+ Streptozocin (STZ) liều cao (150-200 mg/kg)

Giữa thập niên 60 của thế kỷ trước, các nhà khoa học đã phát hiện ra độc tính chọn lọc của STZ trên các tế bào β đảo tụy, gợi ý cho sử dụng STZ để gây ĐTĐ typ 1 STZ có khả năng gây tăng glucose máu ổn định hơn alloxan, đồng thời ít gây ra nhiễm toan ceton và ít gây chết động vật nghiên cứu hơn alloxan Hiện nay, STZ được dùng thay thế dần alloxan trong các nghiên cứu ĐTĐ thực nghiệm trên động vật Liều STZ gây ĐTĐ typ 1 trên động vật thực nghiệm thay đổi tùy từng nghiên cứu và tùy từng loài [32], [75]

- Đái tháo đường typ 1 do nhiễm virus

Trên cơ sở sự liên quan của một số loại virus với bệnh sinh ĐTĐ typ 1, có thể gây ĐTĐ typ 1 thực nghiệm với virus coxsacki hoặc một số virus khác như: quai bị, rubella, rota, parvo, herpes, entero viêm gan B, C Sau đó xác định nồng

độ interleukin 10 (IL-10) và theo dõi quá trình tự phá hủy của tế bào tại các mạch bạch huyết [114] Mô hình này chưa được áp dụng tại Việt Nam

1.3.1.2 Mô hình gây bệnh ĐTĐ typ 2

ĐTĐ typ 2 là sự rối loạn phức tạp liên quan đến các yếu tố di truyền, dịch

tễ học, chuyển hóa và môi trường Mô hình gây bệnh ĐTĐ typ 2 thường được các nghiên cứu áp dụng dựa trên yếu tố di truyền, chế độ dinh dưỡng và hóa chất với mục đích làm tăng glucose máu và kháng insulin ở mô ngoại vi [32], [75]

- ĐTĐ typ 2 do đột biến gen

Gen leptin trên chuột béo phì (ob/ob) và chuột ĐTĐ (db/db) đóng vai trò

điều chỉnh lượng thức ăn, tiêu hao năng lượng và duy trì chuyển hóa năng lượng Những chuột thiếu hụt gen leptin và receptor của nó, có thể dẫn đến béo phì và kháng insulin [165] Mô hình gây bệnh ĐTĐ typ 2 bằng đột biến gen leptin được thực hiện trên các chủng chuột: C57BL/6, Zucker, Sprague Dawley [86], [165] Mặt khác, các nhà khoa học, cũng đã tìm ra được 1 số loại gen nhạy cảm với

ĐTĐ typ 2 như Tbc1d, Pctp, Abcg1, Nmur2, Nob3, Zfp69 Sự đột biến các gen

nhạy cảm trên dẫn đến khởi phát ĐTĐ typ 2 [86], [165] Ngoài ra, đột biến gen

gây ức chế biểu hiện gen GLUT2 và GLUT4 cũng dẫn đến xuất hiện sự kháng

insulin và tăng glucose máu [86]

Mô hình ĐTĐ typ 2 di truyền có béo phì hoặc không béo phì có bệnh sinh gần giống với bệnh sinh ĐTĐ typ 2 ở người Trong mô hình này các chủng chuột di truyền đã được chọn lựa và phát triển bệnh ĐTĐ typ 2 một cách tự nhiên Tuy nhiên, mô hình này đòi hỏi điều kiện kỹ thuật lai tạo phức tạp, kinh phí tốn kém nên cũng chưa được thực hiện tại Việt Nam

- Gây ĐTĐ typ 2 bằng cách sử dụng hóa chất

+ Sử dụng STZ liều thấp

Thông qua lựa chọn liều STZ, có thể gây được những biểu hiện tương tự ĐTĐ typ 2 Các liều STZ thường được sử dụng là liều thấp (35-65mg/kg tiêm màng bụng) [37], Ưu điểm của mô hình sử dụng STZ liều thấp để gây ĐTĐ typ

2 là sự tăng glucose máu ổn định Hạn chế lớn nhất là thiếu những bằng chứng

rõ ràng về tình trạng kháng insulin Hiện nay, các nhà khoa học hạn chế sử dụng đơn độc liều STZ để gây mô hình ĐTĐ typ 2 cho động vật mà thường kết hợp STZ với nicotinamid hoặc với chế độ ăn giàu chất béo [33],[168]

+ Kết hợp STZ và nicotinamid: Nicotinamid là một chất chống oxi hóa bảo vệ tế bào bằng cách trung hòa các gốc tự do được sinh ra bởi STZ và hạn chế tổn thương tế bào β đảo tụy Do đó, sự kết hợp sử dụng STZ với nicotinamid cũng được sử dụng để gây bệnh ĐTĐ typ 2 Liều thường sử dụng trong mô hình này từ 60 - 240 mg/kg nicotinamid tùy từng nghiên cứu Sự kết hợp này cùng với chế độ ăn giàu chất béo cũng được sử dụng để gây bệnh ĐTĐ typ 2 trên chủng chuột C57BL/6J [168] Ưu điểm của mô hình này là sự tăng glucose máu

ổn định, và, mô hình gây bệnh đơn giản, có thể thực hiện được tại Việt Nam

+ Kết hợp STZ liều thấp và chế độ ăn giàu chất béo là phương pháp được