Nghiên cứu tác dụng và cơ chế hạ glucose máu của dịch ép thân cây chuối tiêu (musa x paradisiaca l ) trên thực nghiệm

xuất insulin giảm d n, cho đến khi nồng độ insulin không đủ để duy trì nồng độ glucose máu ở mức bình thường, khi các triệu chứng lâm sàng xuất hiện thì h u hết các tế bào của tiểu đảo L

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ ĐÔNG

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG VÀ CƠ CHẾ

HẠ GLUCOSE MÁU CỦA DỊCH ÉP

THÂN CÂY CHUỐI TIÊU

(MUSA X PARADISIACA L.)

TRÊN THỰC NGHIỆM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI, NĂM 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phùng Thanh Hương

GS.TS Nguyễn Hải Nam

HÀ NỘI, NĂM 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ một công trình nào khác

Tác giả luận án

Nguyễn Thị Đông

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình h c tập và hoàn thành luận án, tôi đ nhận được sự hư ng d n, gi p đ qu báu của các nhà Khoa h c, các th y cô giáo, các anh ch , các em, các b n b đ ng nghiệp và gia đình

V i l ng k nh tr ng và biết n sâu s c nhất tôi xin được bày t l ng

biết n chân thành t i PGS TS Phùng Thanh Hương, GS.TS Nguyễn

Hải Nam, hai người Th y tâm huyết, tận tình luôn sát cánh bên tôi quan

tâm gi p đ cũng như động viên tôi trong suốt quá trình h c tập, nghiên

cứu và hoàn thành luận án này Tôi xin cảm n PGS.TS Nguyễn Hoàng

Anh, tuy không phải là th y hư ng d n của tôi, nhưng th y đ gi p đ tôi

rất nhều trong từng nghiên cứu

Lời cảm n tiếp theo, tôi xin trân tr ng cảm n an Giám hiệu trường Trường Đ i h c Dược Hà Nội, Trường Cao đẳng Dược Trung

ư ng Hải Dư ng, đ t o điều kiện cho tôi được h c tập và nghiên cứu

Tôi xin gửi lời cảm n t i các thày giáo, cô giáo, anh ch em k thuật viên ộ môn H a sinh, ộ môn Dược lực, Ph ng au đ i h c Trường

Đ i H c Dược Hà Nội, ộ môn H a dược Trường Cao đẳng Dược Trung

ư ng Hải Dư ng, đ t o m i điều kiện thuận lợi gi p đ tôi trong quá trình h c tập và hoàn thành luận án

Trong quá trình làm thực nghiệm t i Khoa Sinh h a và Huyết h c, Khoa Giải ph u bệnh- ệnh viện Đa khoa tỉnh Hải Dư ng Viện H a sinh biển- Viện Hàn lâm Khoa h c Việt Nam, Khoa H a sinh và Vi sinh, Đ i

h c H a h c và Công nghệ Praha, Cộng hòa Czech Tôi đ nhận được sự

gi p đ về điều kiện về trang thiết b , h a chất và k thuật gi p tôi hoàn thành luận án Xin được bày t l ng biết n t i các chuyên gia,các ác sĩ, Dược sĩ, các anh ch em k thuật viên t i các c quan trên

Xin gửi lời cảm n t i b n b , các em sinh viên Trường Đ i h c Dược Hà Nội, các anh ch em đ ng nghiệp Trường Cao đẳng Dược Trung

ư ng Hải Dư ng, luôn động viên và gi p đ tôi trong thời gian qua

Lời cảm n cuối cùng tôi muốn giành tặng cho những người thân trong gia đình đ luôn ở bên c nh động viên, gi p đ và giành m i thời gian để tôi h c tập làm việc và hoàn thành luận án này

NCS Nguyễn Thị Đông

NCS Nguyễn Thị Đông

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG 3

1.1.1 Định nghĩa, dịch tễ, phân loại đái tháo đường 3

1.1.2 Cơ chế bệnh sinh 5

1.2 CÁC CƠ CHẾ G ÂY HẠ GLUCOSE MÁU 10

1.2.1 Tăng cường số lượng insulin nội sinh 10

1.2.2 Tăng cường nhạy cảm của mô đích với insulin 13

1.2.3 Tác dụng điều hòa, chuyển hóa tương tự như insulin 17

1.2.4 Ức chế tiêu hóa carbohydrat 19

1.2.5 Các cơ chế khác gây hạ glucose máu 20

1.3 CÁC MÔ HÌNH THỰC NGHIỆM TRONG NGHIÊN CỨU THUỐC ĐIỀU TRỊ ĐÁI THÁO ĐƯỜNG 20

1.3.1 Các mô hình thực nghiệm in vivo 20

1.3.2 Các mô hình thực nghiệm in vitro 24

1.4 CÂY CHUỐI TIÊU 26

1.4.1 Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật 26

1.4.2 Bộ phận dùng 27

1.4.3 Các nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của cây chuối tiêu (Musa x paradisiaca L.) 27

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 32

2.1.1 Dược liệu nghiên cứu 32

2.1.2 Động vật thí nghiệm 32

2.1.3 Các dòng tế bào cho nghiên cứu in vitro 33

2.2 DỤNG CỤ, HÓA CHẤT NGHIÊN CỨU 33

2.2.1 Thiết bị, dụng cụ 33

2.2.2 Thuốc và hóa chất nghiên cứu 34

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

2.3.1 Phương pháp điều chế mẫu nghiên cứu 38

2.3.2 Phương pháp đánh giá tác dụng hạ glucose máu thực nghiệm trên chuột 39 2.3.3 Các kỹ thuật định lượng hóa sinh trong thực nghiệm in vivo 44

2.3.4 Kỹ thuật xét nghiệm mô bệnh học 47

2.3.5 Phương pháp xác định hoạt độ enzym G6Pase gan (EC 3.1.3.9) 48

2.3.6 Phương pháp đánh giá khả năng ức chế các enzym in vitro 49

2.3.7 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng trên sự phosphoryl hóa AMPK và IRS-1 53

2.3.8 Phương pháp đánh giá khả năng ức chế sự biệt hóa của tế bào mô mỡ 3T3-L1 58

2.3.9 Các phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học của cắn toàn phần thân cây chuối tiêu 58

2.3.10 Xử lý số liệu 59

CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 60

3.1 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HẠ GLUCOSE MÁU TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM 60

3.1.1 Kết quả tác dụng hạ glucose máu của cắn toàn phần 60

3.1.2 Kết quả tác dụng của cắn phân đoạn 65

3.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CẮN TOÀN PHẦN THÂN CÂY CHUỐI TIÊU 69

3.2.1 Kết quả định tính các nhóm chất 69

3.2.2 Kết quả phân lập các hợp chất trong phân đoạn ethylacetat 70

3.2.3 Kết quả phân lập các hợp chất trong phân đoạn n-butanol 76

3.3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ HẠ GLUCOSE MÁU CỦA CẮN TOÀN P HẦN THÂN CÂY CHUỐI TIÊU 80

3.3.1 Kết quả trên các mô hình thực nghiệm in vivo 80

3.3.2 Kết quả trên các mô hình thực nghiệm in vitro 89

CHƯƠNG IV BÀN LUẬN 99

4.1.1 Lựa chọn liều thử nghiệm 99

4.1.2 Tác dụng của cắn toàn phần 100

4.1.3 Tác dụng của cắn phân đoạn 105

4.2 VỀ VIỆC PHÂN LẬP CHẤT TRONG PHÂN ĐOẠN CÓ TÁC DỤNG HẠ GLUCOSE MÁU CHIẾM ƯU THẾ 106

4.3 VỀ CƠ CHẾ TÁC DỤNG HẠ GLUCOSE MÁU CỦA THÂN CÂY CHUỐI TIÊU 111

4.3.1 Cơ chế hạ glucose máu ở mức độ cơ thể 112

4.3.2 Cơ chế hạ glucose máu ở mức độ tế bào, phân tử 117

4.4 BÀN LUẬN CHUNG 129

KẾT LUẬN 134

1 Tác dụng hạ glucose máu của cắn toàn phần thân cây chuối tiêu 134

2 Cơ chế hạ glucose máu của thân cây chuối tiêu 134

2.1 Trên chuyển hoá 134

2.2 Trên sự nhạy cảm của mô đích với insulin 135

2.3 Trên chuyển hoá và tăng nhạy cảm của tế bào mô đích với insulin 135

ĐỀ XUẤT 135 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ACC Acetyl-coA carboxylase

Ac-CoA Acetyl-CoA

ADA Hiệp hội đái tháo đường M (American Diabetes

Association) AICAR Aminoimidazol-4-carboxamid Ribosid

Akt The serine/threonine kinase

AMPK Adenosine monophosphate activated protein kinase

ARB Angiotensin receptor blocker

Cho TP Cholesterol toàn ph n

DPP-4 Dipeptidyl peptidase-4

ĐTĐ Đái tháo đường

ECLIA Electro chemiluminessance Immuno Assay

F1,6BPase Fructose-1,6-biphosphatase

FBS Huyết thanh bào thai bê (Fetal bovine serum)

FDA Cục quản l Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (Food and

drug administration) FFA Acid béo tự do (Free fatty acid)

GLUT Hệ vận chuyển glucose (Glucose-transporter)

GOAT Ghrelin o-acyltransferase

GOD Glucose oxidase

GP Glycogen phosphorylase

GPR G protein-coupled receptors

VIẾT TẮT TÊN ĐẦY ĐỦ

GSK-3 Glycogen synthase kinase-3

HbA1C Hemoglobin A1C

HDACs Histone deacetylase

HEPES 4-(2- hydroxyethyl)-1-piperazineethane sulfonic acid HLA Kháng nguyên liên kết tế bào lympho (Human Leukocyte

Antigen) HMGB1 High-mobility-group 1

HOMA Homeostasis model assessment

HS Huyết thanh ngựa (Horse erum)

IC 50 N ng độ ức chế 50%

IKK Inhibitory κ kinase

IL Interleukin

IRS Insulin receptor substrate

JNK Jun N-terminal kinase

LC-CoA Long chair-CoA

LDL Low densyti lipoprotein

NaCMC Sodium carboxy methyl cellulose

NF-κ Nuclear factor κ

NOD nonobese diabetic

NPPH 2,2-diphenyl -1-picrylhydrazyl

OB/OB Obese

p-AMPK Adenosine monophosphate activated protein kinase trong

đ phân tử threonin172 đ được phosphoryl h a

PĐ Phân đo n

PI3 Phosphatidylinositol 3

PI3K Phosphatidylinositol 3-kinase

PPAR Peroxisome proliferator-activated receptors

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

1 ảng 1.1 Tiêu chuẩn chẩn đoán ĐTĐ và tiền ĐTĐ của WHO

6 Bảng 3.1 N ng độ glucose máu chuột tăng glucose máu thực

nghiệm bằng STZ (150 mg/kg) sau 15 ngày uống m u thử

59

7 Bảng 3.2 N ng độ glucose máu của chuột cống ĐTĐ typ 2

sau 15 ngày uống m u thử

61

8 ảng 3.3 N ng độ glucose máu của các lô chuột ĐTĐ typ 2

thực nghiệm sau khi uống dung d ch glucose

62

9 Bảng 3.4 N ng độ glucose máu của các lô chuột tăng glucose

máu bằng STZ (150mg/kg) sau 15 ngày uống các hỗn d ch c n

phân đo n

65

10 ảng 3.5 N ng độ glucose máu của chuột cống ĐTĐ typ 2

sau 15 ngày uống hỗn d ch c n phân đo n

67

11 ảng 3.6 Dữ liệu phổ 1

H-NMR và 13 C-NMR của hợp chất FE1C và chất tham khảo

70

12 ảng 3.7 Dữ liệu phổ 1

H-NMR và 13 C-NMR của hợp chất FE6B và chất tham khảo

71

13 ảng 3.8 Dữ liệu phổ 1

H-NMR và 13 C-NMR của hợp chất FE10A và chất tham khảo

11 ảng 3.12 N ng độ insulin huyết thanh của các lô chuột tiêm

TZ 150 mg/kg sau 15 ngày uống m u thử

80

18 ảng 3.13 Ảnh hưởng của chế độ ăn giàu chất béo kết hợp TZ 81

TT NỘI DUNG TRANG

(50 mg/kg) trên một số chỉ số sinh h c của chuột cống tr ng

19 ảng 3.14 C hức năng tế bào β và chỉ số kháng insulin của

các lô chuột cống béo phì tiêm TZ liều 50 mg/kg

82

20 ảng 3.15 N ng độ insulin huyết thanh của chuột cống ĐTĐ

typ 2 sau 15 ngày uống m u thử

83

21 ảng 3.16 N ng độ triglycerid và cholesterol toàn ph n huyết

thanh của chuột ĐTĐ typ 2 sau 15 ngày uống m u thử

85

22 ảng 3.17 Ho t độ G6Pase gan của các lô chuột tiêm TZ

150 mg/kg sau 15 ngày uống m u thử

87

23 ảng 3.18 Ho t độ enzym G6Pase gan của chuột ĐTĐ typ 2

sau 15 ngày uống hỗn d ch c n toàn ph n

88

24 ảng 3.19 Kết quả tác dụng ức chế enzym α- amylase in vitro

của c n toàn ph n thân cây chuối tiêu

89

25 ảng 3.20 Khả năng ức chế enzym α-amylase của các chất

phân lập từ thân cây chuối tiêu

90

26 ảng 3.21 IC 50 của các chất c tác dụng ức chế α-amylase 90

27 ảng 3.22 Kết quả tác dụng ức chế enzym α- glucosidase in

vitro của c n toàn ph n thân cây chuối tiêu

91

28 ảng 3.23 Khả năng ức chế enzym α-glucosidase của các

chất phân lập từ thân cây chuối tiêu

31 ảng 3.26 Khả năng ức chế PTP1 của của các chất phân

lập từ thân cây chuối tiêu

93

32 ảng 3.27 IC 50 của các chất c tác dụng ức chế PTP1 93

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

1 Hình 1.1 ự phá hủy của tế bào β trong c chế bệnh sinh của

3 Hình 1.3 Acid béo tự do v i sự kháng insulin 9

4 Hình 1.4 C chế tác dụng của các thuốc nh m sulfunylure 11

5 Hình 1.5 C chế tác dụng của các thuốc ức chế DPP4 13

6 Hình 1.6 C chế tác dụng giảm kháng insulin thông qua ho t hoá

AMPK

14

9 Hình 1.9 Cây chuối tiêu chụp ở x Giang n, huyện Gia Bình,

tỉnh B c Ninh (Musa x paradisiaca L.)*

27

10 Hình 2.1 Thân cây chuối tiêu thu ho ch t i x Giang n, huyện

Gia ình, tỉnh c Ninh*

32

12 Hình 2.3 đ chiết các phân đo n d ch chiết từ thân cây chuối

tiêu

38

13 Hình 2.4 đ quy trình đ nh lượng insulin huyết thanh 46

14 Hình 2.5 đ quy trình thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của

m u thử trên sự phosphoryl hoá của IRS-1 và AMPK

54

15 Hình 3.1 So sánh mức h glucose máu của các lô chuột thí

nghiệm tiêm STZ (150 mg/kg) sau 15 ngày uống m u thử

60

16 Hình 3.2 Mức h glucose máu của các lô chuột ĐTĐ typ 2 sau 15

ngày uống m u thử

61

17 Hình 3.3 ự thay đổi n ng độ glucose máu của chuột ĐTĐ typ 2

thực nghiệm trong test dung n p glucose

63

18 Hình 3.4 ự t n lưu glucose trong máu của chuột cống ĐTĐ typ 2

thực nghiệm trong test dung n p glucose đường uống sau 120

phút

64

19 Hình 3.5 Mức h glucose máu của các lô chuột tiêm TZ 150

mg/kg sau 15 ngày uống hỗn d ch c n các phân đo n

66

20 Hình 3.6 Mức h glucose máu của các lô chuột ĐTĐ typ 2 sau

15 ngày uống hỗn d ch c n phân đo n

68

21 Hình 3.7 Cấu tr c h a h c của hợp chất FE1C 71

TT NỘI DUNG TRANG

22 Hình 3.8 Cấu tr c h a h c của hợp chất FE6 72

23 Hình 3.9 Cấu tr c h a h c của hợp chất FE10A 73

24 Hình 3.10 Cấu tr c h a h c của hợp chất FE12A 75

25 Hình 3.11 Cấu tr c h a h c của hợp chất F 2A 79

26 Hình 3.12 Cấu tr c h a h c của hợp chất F 2 80

27 Hình 3.13 Mô bệnh h c tụy của các lô chuột ĐTĐ typ 2 sau 15

ngày uống m u thử (nhuộm HE x 400 l n)

84

28 Hình 3.14 Ph n trăm h cholesterol và triglyceride của các lô

chuột th nghiệm trư c và sau khi uống m u thử

86

29 Hình 3.15 Ph n trăm ức chế ho t độ enzym G6Pase của các lô

chuột tăng glucose máu bởi TZ liều 150mg /kgsau 15 ngày uống

m u thử

87

30 Hình 3.16 Ph n trăm ức chế ho t độ enzym G6Pase của các lô

chuột ĐTĐ typ 2 sau 15 ngày uống m u thử

89

31 Hình 3.17 Tác dụng của c n toàn ph n ở các n ng độ khác nhau

trên lượng IRS-1 phosphoryl hóa ở Ser307

94

32 Hình 3.18 o sánh lượng p-IRS-1 (Ser307) giữa các lô ủ v i c n

toàn ph n ở các n ng độ khác nhau

94

33 Hình 3.19 Ảnh hưởng của cycloeucalenon (H1) và daucosterol

(H2) ở các n ng độ khác nhau trên lượng IRS-1 phosphoryl hóa ở

Ser307

95

34 Hình 3.20 o sánh lượng p-IRS-1 (Ser307) giữa các lô ủ v i

cycloeucalenon (H1) và daucosterol (H2) ở các n ng độ khác nhau

95

35 Hình 3.21 Tác dụng của c n toàn ph n ở các n ng độ khác nhau

trên lượng AMPKα phosphoryl hóa ở Thr172

96

36 Hình 3.22 o sánh lượng p-AMPKα (Thr172) giữa các lô ủ v i

c n toàn ph n ở các n ng độ khác nhau

96

37 Hình 3.23 Tác dụng của cycloeucalenon (H1) và daucosterol

(H2) trên lượng AMPK phosphoryl hóa ở Thr172

40 Hình 4.1 Các c chế tác dụng h glucose máu đ được phát hiện

của thân cây chuối tiêu

131

ĐẶT VẤN ĐỀ

Đái tháo đường (ĐTĐ) là một bệnh nội tiết đặc trưng bởi tình trạng tăng glucose máu kèm theo nhiều biểu hiện rối loạn chuyển hóa Hậu quả của sự tăng glucose máu là những biến chứng nghiêm trọng, có thể đe dọa đến tính mạng của người bệnh Theo nghiên cứu của Hiệp hội Đái tháo đường quốc tế, năm

2015 số lượng bệnh nhân mắc bệnh là 415 triệu người, chiếm 8,8% dân số thế giới và vẫn tiếp tục gia tăng mạnh, ước tính đến năm 2040 sẽ có khoảng 642 triệu người mắc bệnh ĐTĐ [67] Sự gia tăng đột biến về tỷ lệ người mắc bệnh ĐTĐ hiện nay đang là một gánh nặng cho ngành y tế Chi phí để quản lý, chăm sóc và điều trị bệnh rất tốn kém Theo công bố của tổ chức Y tế thế giới (WHO), chi phí trực tiếp mỗi năm cho bệnh nhân ĐTĐ ước tính khoảng 673 tỷ đô la Mỹ, chiếm khoảng 16,2% ngân sách chăm sóc sức khoẻ của toàn thế giới [181]

Trong những năm qua, số các nghiên cứu về đái tháo đường đ tăng lên nhanh chóng Kết quả là sự ra đời của các thuốc mới và các ứng dụng trong điều trị, cho phép th y thuốc c ng như bệnh nhân có nhiều sự lựa chọn h n Các thuốc điều trị ĐTĐ đang được s dụng cho thấy những hiệu quả nhất định [19], [181] Tuy nhiên, hiệu quả lâu dài trong việc ngăn ng a các biến chứng của ĐTĐ thông qua kiểm soát glucose máu vẫn còn hạn chế, đồng thời những phản ứng bất lợi khi s dụng thuốc vẫn là một vấn đề đáng lưu ý [110] Do đó, một trong những mối quan tâm hàng đ u của các nhà khoa học hiện nay là việc tìm ra những thuốc mới điều trị ĐTĐ dựa trên sự khám phá các đích tác dụng mới,

nh m nâng cao hiệu quả điều trị đái tháo đường, đồng thời giảm được những phản ứng bất lợi Kế th a nền y học cổ truyền của dân tộc để t đó nghiên cứu, sản xuất ra các loại thuốc có nguồn gốc t thảo dược thiên nhiên hiệu quả và an toàn đang là hướng lựa chọn hợp lý để giải quyết vấn đề này T hướng nghiên cứu đó, đ có nhiều loại thảo dược được nghiên cứu và chứng minh tác dụng hạ glucose máu như: Dây đau xư ng, Chè xanh, Thổ phục linh [7], [8],[13]

Cây Chuối tiêu (Musa x paradisiaca L.) được biết đến như một loại thực

phẩm và c ng là một vị thuốc Theo y học cổ truyền, quả chuối tiêu xanh chữa tiêu chảy, kiết lỵ Chuối tiêu chín có tác dụng nhuận tràng, chữa táo bón, vỏ quả

2

chuối tiêu chữa lỵ, nhựa quả chuối tiêu xanh chữa hắc lào, lá chuối tiêu non gi nát c m máu vết thư ng, làm dịu vết bỏng [3] Nhiều bộ phận dùng của cây chuối tiêu như quả, lá rễ đ được nghiên cứu và chứng minh tác dụng hạ glucose máu [89], [150], [151] Theo kinh nghiệm dân gian của đồng bào dân tộc thiểu số phía bắc Việt Nam và một số quốc gia trên thế giới, ph n thân chuối

ép lấy nước uống để điều trị ĐTĐ có hiệu quả làm hạ glucose máu [103], [153] Tuy nhiên, cho đến thời điểm này chưa có tài liệu khoa học nào của Việt Nam nghiên cứu về tác dụng sinh học của thân cây chuối tiêu Hiện nay, trên thế giới

có một vài nghiên cứu về tác dụng hạ glucose máu của thân cây chuối tiêu [89],[163] Các nghiên cứu chỉ mới ở mức độ sàng lọc, kết quả chưa thống nhất, chưa có một nghiên cứu có hệ thống nào đánh giá được tác dụng và c chế tác dụng hạ glucose máu của dược liệu này Để có những b ng chứng khoa học về tác dụng và c chế tác dụng của thân cây chuối tiêu hướng tới ứng dụng trong

điều trị ĐTĐ, luận án tiến hành đề tài “Nghiên cứu tác dụng và cơ chế hạ glucose máu của dịch ép thân cây chuối tiêu (Musa x paradisiacal L.) trên thực nghiệm” với 2 mục tiêu:

1 Đánh giá tác dụng h glucose máu của c n toàn ph n từ d ch ép thân cây chuối tiêu trên chuột thực nghiệm

2 Nghiên cứu c chế h glucose máu của c n toàn ph n và một số chất phân lập từ d ch ép thân cây chuối tiêu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG

1.1.1 Định nghĩa, dịch tễ, phân loại đái tháo đường

- Định nghĩa

Theo Hiệp hội Đái tháo đường Hoa K , bệnh đái tháo đường là một tập hợp những rối loạn chuyển hóa mạn tính đặc trưng bởi sự tăng glucose máu do suy giảm sản xuất insulin và hoặc do giảm đáp ứng với insulin tại các mô Sự tăng glucose máu mạn tính trong bệnh đái tháo đường có liên quan mật thiết với những tổn thư ng lâu dài, rối loạn và suy giảm chức năng của nhiều c quan khác nhau, đặc biệt là mắt, thận, th n kinh, tim và mạch máu [19]

- Dịch tễ

Đái tháo đường là bệnh thường gặp nhất trong các bệnh nội tiết, là một trong 3 bệnh có tốc độ phát triển nhanh nhất trên thế giới (ung thư, tim mạch và ĐTĐ) Trong những năm cuối thế kỷ 20, đ u thế kỷ 21, ĐTĐ là bệnh không lây phát triển nhanh nhất [19] Theo thống kê của Hiệp hội Đái tháo đường quốc tế, năm 2015 số người mắc bệnh ĐTĐ ở các khu vực điển hình như sau: Bắc Mỹ 44,3 triệu người, Châu Âu 58,9 triệu người, Đông Bắc Phi 35,4 triệu người, Nam Mỹ 29,6 triệu người, Đông Nam Á 78,3 triệu người và phía Tây Thái Bình

Dư ng 153 triệu người Dự tính đến năm 2040, số người mắc bệnh ĐTĐ tại các vùng này càng gia tăng nhanh chóng với số lượng ước tính: Bắc Mỹ 60,5 triệu người, Châu Âu 71,1 triệu người, Đông Bắc Phi 72,1 triệu người, Nam Mỹ 48,8 triệu người, Đông Nam Á 140,2 triệu người và phía Tây Thái Bình Dư ng 214,8 triệu người [67] Mặc dù có sự gia tăng cả về ĐTĐ typ 1 và typ 2 nhưng tốc độ phát triển của ĐTĐ typ 2 tăng mạnh do sự gia tăng tỷ lệ béo phì và lối sống ít hoạt động thể lực ở các nước phát triển, cứ 10 người mắc ĐTĐ thì có 9 người mắc ĐTĐ typ 2

Việt Nam, năm 2015, số người trong độ tuổi t 20 đến 79 tuổi mắc ĐTĐ vào khoảng 3,5 triệu, chiếm 6,0 % dân số trong độ tuổi này [67] Đặc biệt tỷ lệ mắc ĐTĐ ở nhóm đối tượng có yếu tố nguy c , tuổi t 30 đến 64 chiếm tỷ lệ là cao nhất T n suất các yếu tố nguy c như BMI (Body mass index) cao, v ng eo rộng, ít vận động thể lực, gia đình có người thuộc các thế hệ cận kề mắc ĐTĐ cao r rệt ở khu vực đồng b ng, đô thị so với miền n i và trung du [1]

- Phân loại đái tháo đường

Theo phân loại của Hiệp hội Đái tháo đường Hoa K (ADA) năm 2017, ĐTĐ được chia thành ĐTĐ typ 1, ĐTĐ typ 2, ĐTĐ thứ phát, ĐTĐ thai k [19]

4

+ Đái tháo đường typ 1: Chiếm 5-10% trong số những người mắc ĐTĐ với

đặc điểm tế bào đảo tụy bị phá hủy gây thiếu hụt insulin tuyệt đối Nguyên nhân của sự phá hủy này có thể là do tự miễn dịch

+ Đái tháo đường typ 2: ĐTĐ typ 2 chiếm khoảng 90% số người mắc

ĐTĐ Đó là một tập hợp những rối loạn chuyển hóa do nhiều nguyên nhân khác nhau, nhưng đều có chung đặc điểm: có sự đề kháng insulin ở mô đích và tiếp theo là sự suy giảm tiết insulin ở tuyến tụy

+ Đái tháo đường thứ phát: ĐTĐ có thể là hệ quả của những bệnh lý khác

như: các khuyết tật di truyền của tế bào , giảm hoạt tính của insulin do khiếm khuyết gen, các bệnh lý tụy ngoại tiết (u tụy, chấn thư ng, cắt bỏ tụy ), các bệnh nội tiết khác (u tủy thượng thận, u tiết glucagon, u tiết somatostatin, hội chứng Cushing ), do dùng thuốc hoặc hóa chất, do nhiễm trùng và một số hội chứng về gen khác

+ Đái tháo đường thai k : Đái tháo đường ở phụ nữ mang thai thường khởi

phát t tu n lễ thứ 24 của thai k , đôi khi sớm h n Nguyên nhân là sự tăng nhu

c u insulin khi thai phát triển do nhu c u cung cấp năng lượng của người m Đồng thời trong quá trình mang thai, sự thay đổi nồng độ estrogen và progesteron làm thay đổi chức năng tế bào đảo tụy, gây hiện tượng rối loạn dung nạp glucose tiềm tàng H n nữa, trong giai đoạn này, c thể người m c ng sản xuất ra các nội tiết tố khác như các lactogen ở nhau thai có tác dụng kháng insulin và tăng thoái hóa lipid

- Ti u chuẩn chẩn đoán

Hiệp hội Đái tháo đường Hoa K (ADA) và Tổ chức Y tế thế giới (WHO)

đ đưa ra các tiêu chuẩn chẩn đoán ĐTĐ được áp dụng rộng r i Tiêu chuẩn chẩn đoán ĐTĐ của 2 tổ chức này được tóm tắt trong bảng 1.1 [19],[181]

ảng 1.1 Tiêu chu n ch n đoán ĐTĐ và tiền ĐTĐ của HO và D

Chẩn đoán

HbA1c (%)

FPG (mmol/L)

G2h

(mmol/L)

HbA1c (%)

FPG (mmol/L)

G2h

(mmol/L) Đái tháo

đường ≥ 6,5 ≥ 7,0 ≥ 11,1 ≥ 6,5 ≥ 7,0 ≥ 11,1 Rối loạn dung nạp

FPG: fasting plasma glucose – glucose huyết tư ng l c đ i

G 2h : Glucose huyết tư ng 2h sau khi uống 75g glucose (test dung n p glucose)

Như vậy, theo WHO và ADA đều đưa ra các tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh đái tháo đường là glucose huyết tư ng l c đói ≥ 7,0 mmol L hoặc glucose huyết

tư ng 2h sau khi uống 75g glucose ≥ 11,1mmol L hoặc HbA1c ≥ 6,5%

Tuy nhiên, khi đưa ra tiêu chuẩn để chẩn đoán tiền ĐTĐ thì tiêu chuẩn của ADA (5,6 mmol L) thấp h n tiêu chuẩn của WHO (6,1 mmol L) Điều này có tác động đáng kể đến sự can thiệp vào tiến triển của ĐTĐ, c ng như giúp có các biện pháp ph ng rối loạn glucose vì tỷ lệ những người bị tiền ĐTĐ (rối loạn glucose hoặc suy giảm glucose máu) chuyển thành ĐTĐ trong v ng 5 năm rất cao

1.1.2 Cơ chế bệnh sinh

- Bệnh sinh của đái tháo đường typ 1

Đái tháo đường typ 1 là tình trạng thiếu hụt insulin tuyệt đối do tế bào của đảo tụy bị tổn thư ng, thường khởi phát ở tuổi trẻ Cho tới nay chưa tìm ra nguyên nhân chính, chỉ biết đây là một bệnh tự miễn.Về c chế bệnh sinh có nhiều b ng chứng cho thấy bệnh bệnh sinh của ĐTĐ typ 1 là sự kết hợp giữa ba yếu tố di truyền, miễn dịch và môi trường Hậu quả cuối cùng của quá trình này

là tế bào bị phá hủy, biểu hiện lâm sàng là ĐTĐ phụ thuộc insulin [52]

C chế bệnh sinh của ĐTĐ typ 1 trước hết phải kể đến di truyền có liên quan chặt chẽ với yếu tố kháng nguyên bạch c u người (human leucocyte antigen- HLA) HLA là những phân t n m trên bề mặt các tế bào trình diện kháng nguyên Nguy c mắc bệnh ĐTĐ sẽ tăng lên đối với những cá thể mang kháng nguyên HLA như: HLA- DR3, HLA- DR4, HLA- DW3, HLA- DW4, HLA- B8, HLA- B15 [68] Các nghiên cứu sàng lọc về di truyền học đ chỉ ra ít nhất 15 vị trí gen khác liên quan đến bệnh ĐTĐ typ 1, trong đó, có 2 gen liên quan tới c chế hoạt hóa lympho T Đó là gen m hóa kháng nguyên lympho T gây độc tế bào (CTLA-4), thuộc nhiễm sắc thể số 2 và gen mã hóa lymphoid

tyrosine phosphatase (PTPN22), được biểu thị đặc hiệu ở tế bào lympho T [58]

Yếu tố thứ hai phải kể đến trong c chế bệnh sinh của ĐTĐ typ 1 là sự tác động của môi trường: Virus, chế độ ăn, các chất độc, stress, yếu tố địa lý Các yếu tố này th c đẩy quá trình khởi động quá trình tự miễn Khi tiến hành gây nhiễm với virus Coxsacki ở động vật thí nghiệm cho thấy tế bào bị nhiễm virus

và xuất hiện ĐTĐ typ 1 ở những động vật này [52]

6

Hình 1.1 Sự phá hủy của tế bào β trong cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ typ 1 [52]

Tiếp theo, các tế bào của đảo tụy bị phá hủy theo c chế tự miễn dịch

Về c chế bệnh sinh có nhiều b ng chứng cho thấy bệnh có liên quan đến hai loại là miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào Các yếu tố khởi phát của môi trường sẽ tấn công những cá thể có yếu tố di truyền nhạy cảm đối với ĐTĐ typ 1 Chỉ một tổn thư ng rất nhỏ của tế bào c ng làm giải phóng ra kháng nguyên, kích thích c thể sinh tự kháng thể gây hoạt hóa phản ứng viêm tiểu đảo tự miễn (hình 1.1) Hiện tượng thâm nhiễm đảo tụy ở các cá thể nhạy cảm về di truyền với bệnh bắt đ u xảy ra ở tế bào , t đó sẽ tiếp tục dẫn đến quá trình phá hủy của toàn bộ tiểu đảo tụy Tế bào có thể bị phá hủy bởi 2 c chế

- Các lympho T hiệu ứng giải phóng các hạt chứa perforin vào tế bào đích C chế này c n có sự liên kết giữa receptor của lympho T đặc hiệu với tự kháng nguyên và phức hợp h a hợp tổ chức của tế bào đích

- C chế làm chết tế bào theo chư ng trình (apoptosis) thông qua Fas (CD95) và FasL (CD95L) C chế này không c n sự liên kết giữa receptor của tế bào T với phức hợp h a hợp tổ chức [68]

Sau khi “khởi động”, một loạt phản ứng miễn dịch sẽ diễn ra: các tiểu đảo tụy bị thâm nhiễm bởi các tế bào đ n nhân, các đại thực bào và tế bào lympho T độc (quá trình thâm nhiễm này được gọi là viêm tiểu đảo tụy) giai đoạn này, trong huyết thanh người bệnh xuất hiện nhiều kháng thể kháng tiểu đảo tụy, đây gọi là giai đoạn tiền ĐTĐ typ 1 Tế bào bị tổn thư ng làm cho quá trình sản

Virus

Độc tế bào

MHC +T CR

Hoạt hóa

Sự gia tăng kháng nguyên CD4+ Tế bào

xuất insulin giảm d n, cho đến khi nồng độ insulin không đủ để duy trì nồng độ glucose máu ở mức bình thường, khi các triệu chứng lâm sàng xuất hiện thì h u hết các tế bào của tiểu đảo Langerhan đ bị phá hủy, khả năng bài tiết insulin của tế bào c n lại ít và cạn kiệt d n, bệnh ĐTĐ thật sự sẽ xuất hiện [176]

- Bệnh sinh của đái tháo đường typ 2

Đái tháo đường typ 2 là bệnh rối loạn chuyển hóa với đặc điểm là tăng glucose máu mạn tính và sự đề kháng insulin ở mô đích [1], [47]

C chế bệnh sinh của ĐTĐ typ 2 khá phức tạp, là hậu quả của sự tư ng tác giữa những rối loạn liên quan đến di truyền và yếu tố môi trường dẫn đến sự xuất hiện các c chế gây bệnh C chế diễn biến của bệnh đái tháo đường typ 2 bao gồm: kháng insulin tại mô đích, tiếp theo là hiện tượng bù và sự suy kiệt của

tế bào [1], [47]

+ Hiện tượng kháng insulin

Kháng insulin là tình trạng giảm hoặc mất tính nhạy cảm của mô đích với insulin Kháng insulin xuất hiện t giai đoạn tiền ĐTĐ typ 2, là c chế bệnh sinh chủ yếu và quan trọng nhất trong bệnh sinh của ĐTĐ typ 2 [139]

Có nhiều c chế gây kháng insulin Kháng insulin có thể do bất thường tại các vị trí trước, sau và ngay tại receptor insulin ở mô đích Giảm số lượng receptor insulin là yếu tố bất thường tại receptor hoặc có kháng thể kháng receptor insulin là yếu tố ức chế trước receptor [139]

mức độ phân t , kháng insulin chủ yếu do bất thường trong con đường truyền tín hiệu của insulin (hình 1.2)

Hình 1.2 Con đường truyền tín hiệu của insulin trong chuyển hóa glucose

[139]

8

Insulin thực hiện quá trình truyền tín hiệu nhờ gắn với receptor n m ở màng tế bào Những receptor này có ở h u hết các tế bào trong c thể người và động vật có v bao gồm cả những tế bào đích đặc trưng của insulin như tế bào gan, c , tế bào mô m và những loại tế bào khác như tế bào máu, tế bào th n kinh

Receptor của insulin (IR) là một glycoprotein xuyên màng có phân t lượng lớn, cấu tạo gồm 2 tiểu đ n vị và 2 tiểu đ n vị , nối với nhau bởi các

c u disulfid, có dạng - - - Trong đó các tiểu phân n m ở mặt ngoài tế bào, chứa ph n gắn với insulin, các tiểu phân n m xuyên màng Sự gắn insulin vào receptor ở màng tế bào làm hoạt hóa một chuỗi tín hiệu dưới dạng d ng thác với

2 con đường truyền tin Trong đó, con đường qua trung gian Insulin receptor substrate (IRS) cụ thể là qua IRS-1 IRS-1, IP3 và Akt có vai tr quan trọng trong điều h a nhiều chuyển hóa của tế bào (hình 1.2) Đ u tiên là sự khởi động hoạt tính tyrosinkinase của 2 tiểu đ n vị của IR, dẫn tới một chuỗi phosphoryl hóa liên tiếp ở các tiểu đ n vị và các c chất đặc hiệu là IRS-1, IP3, Akt Tại những tế bào đích của insulin như tế bào c , xư ng và tế bào mô m , con đường qua IP3 tới Akt dẫn tới sự chuyển vị glucose transporter 4 (GLUT4) t nội bào

ra màng bào tư ng, tạo điều kiện cho sự vận chuyển glucose vào trong tế bào, t

đó dẫn tới các chuỗi phản ứng chuyển hóa theo hướng làm giảm glucose máu [61] Trên con đường truyền tín hiệu của insulin trong tế bào có nhiều yếu tố tham gia hoặc ảnh hưởng đến quá trình này như IRS-1, IP3, Akt, chính vì vậy

sự bất thường trong con đường truyền tín hiệu này sẽ gây kháng insulin [139]

C chế kháng insulin do bất thường trong con đường truyền tín hiệu của insulin được giải thích như sau: do giảm hoạt tính tyrosin kinase của vùng sau receptor insulin làm cho insulin khi gắn vào receptor không phát huy được tác dụng sinh học Vì vậy không kích thích được sự vận chuyển glucose vào tế bào [92] Bất hoạt IR có thể do tăng hoạt tính của các enzym kh phosphoryl tại tyrosin của các protein trong con đường truyền tín hiệu nội bào của insulin Một

số enzym đ được nghiên cứu như các protein tyrosinphosphatase (PTP) trong

đó chủ yếu là PTP1B [169] Sự gia tăng phosphoryl hóa các phân t serin hoặc threonin không những làm giảm khả năng hoạt hóa IP3 mà c n làm giảm quá trình phosphoryl hóa tyrosin tại của insulin receptor, tăng thoái hóa IRS-1 do đó làm giảm nhạy cảm với insulin [139] Bất hoạt IP3 thông qua ức chế tiểu đ n vị điều h a ngược p85 n m trên IP3K Sự biểu hiện quá mức dạng hoạt động p100

trên PI3K hoặc kích thích quá mức Akt đều ức chế p85 làm giảm tác dụng sinh

học của insulin [177]

Nguyên nhân chính làm gia tăng sự biểu hiện của các yếu tố gây kháng insulin là th a cân, béo phì Theo Venables, khoảng 80% bệnh nhân ĐTĐ typ 2 liên quan đến béo phì và lối sống ít vận động [171] Theo báo cáo của trung tâm kiểm soát và ph ng bệnh Hoa K , khoảng 55% bệnh nhân ĐTĐ đồng thời mắc béo phì, 85% bệnh nhân ĐTĐ bị th a cân [19] Một trong các nguyên nhân gây béo phì là do chế độ ăn nhiều chất béo và ít vận động những bệnh nhân béo phì, nồng độ acid béo tự do (FFA) tăng cao cạnh tranh với glucose trong chuyển hóa tại c vân, gia tăng FFA gây rối loạn s dụng glucose ở ngoại vi [145]

bệnh nhân béo phì, s dụng năng lượng t acid béo tự do (FFA) tăng do

đó tạo thành acyl-CoA chuỗi dài (LCFA-CoA) trong bào tư ng (hình 1.3) [145]

Hình 1.3 cid béo tự do với sự kháng insulin [145]

Khi được vận chuyển vào trong ty thể, LCFA-CoA được -oxy hóa một

ph n tạo thành gốc tự do oxy hóa (ROS - reactive oxygen species), hoạt hoá JKK gây kháng insulin [145]

Nồng độ LCFA-CoA tăng trong bào tư ng làm tăng diacylglycerol (DAG) Cả DAG và LCFA-CoA hoạt hoá PKC, JKK Cả PKC và JKK làm tăng phosphoryl hóa serin của IRS-1 gây kháng insulin [145]

Mặt khác, nồng độ LCFA-CoA tăng làm tăng nồng độ ceramid do đó ức chế sự phosphoryl hóa Akt PKB, gây ức chế sự di chuyển GLUT4 ra màng tế bào, giảm thu nạp và s dụng glucose trong tế bào và làm tăng nồng độ glucose máu [145]

+ Hiện tượng bù và sự suy kiệt tiếp theo của tế bào β

10

giai đoạn đ u của ĐTĐ typ 2, có sự tăng tiết insulin nh m bù lại sự giảm nhạy cảm của insulin đối với các mô đích, duy trì tình trạng ổn định của glucose máu Sự làm việc quá mức của tế bào sau một thời gian sẽ gây suy kiệt Bên cạnh đó, các yếu tố nguy c c n có tác động trực tiếp đến tế bào

Nồng độ FFA và glucose trong máu tăng làm tăng chuyển hóa tại ty thể, tăng các gốc tự do gây gia tăng tình trạng viêm (hình 1.3) Mặt khác, tăng tổng hợp insulin ở tế bào gây ra hiện tượng stress lưới nội chất Cả hai nguyên nhân này đều dẫn đến sự chết theo chư ng trình của tế bào giai đoạn này, sự sản xuất và bài tiết insulin ở tụy giảm đi kèm theo hiện tượng kháng insulin sẵn có gây ra tình trạng mất kiểm soát nồng độ glucose máu kéo theo nhiều biến chứng [145]

1.2 CÁC CƠ CHẾ GÂY HẠ GLUCOSE MÁU

Giá trị nồng độ glucose ở thời điểm 2 giờ sau ăn <7,8 mmol/L là bình thường, t 7,7- 11,0 mmol/L là rối loạn dung nạp glucose và >11,0 mmol/L là đái tháo đường Sự tăng nhanh glucose trong máu sau ăn tạo ra các đáp ứng của mô và góp ph n vào việc hình thành biến chứng của đái tháo đường [181] Tăng glucose máu mạn tính là đặc trưng c bản của bệnh ĐTĐ, gây ra các biến chứng nguy hiểm [67] Vì vậy h u hết các thuốc điều trị bệnh ĐTĐ đều

nh m mục đích làm hạ glucose máu với các c chế khác nhau Nhìn chung, c chế hạ glucose máu rất phong ph , mỗi thuốc có thể tác động theo một hoặc nhiều c chế khác nhau Dưới đây là một số c chế làm hạ glucose máu đ được

áp dụng trong điều trị hoặc trong các nghiên cứu thực nghiệm

1.2.1 Tăng cường số lượng insulin nội sinh

Insulin là một hormon quan trọng được tiết ra t tế bào tuyến tụy với vai tr sinh học là hạ glucose máu, qua đó gi p c thể kiểm soát và s dụng glucose một cách hiệu quả Bên cạnh s dụng insulin ngoại sinh, vốn chỉ được chỉ định trong ĐTĐ typ 1 và ĐTĐ typ 2 khi bệnh nhân không đáp ứng hoặc đáp ứng kém với các loại thuốc điều trị ĐTĐ b ng đường uống khác [19], có nhiều giải pháp khác nh m tăng cường số lượng insulin nội sinh Tác động của thuốc trên tụy chủ yếu bao gồm tác dụng kích thích tiểu đảo tụy sản xuất insulin hoặc bảo vệ và phục hồi tế bào đ bị tổn thư ng do sự tấn công của các cytokin hoặc các tác nhân bệnh sinh khác [77], [129]

- Tăng cường số lượng insulin thông qua ức chế k nh K ATP, tăng nồng độ calci nội bào

Đây là c chế tăng tiết insulin của các thuốc điều trị ĐTĐ phổ biến hiện nay

Sulfonylurea gắn vào thụ thể bề mặt của màng tế bào (ở tụy) và ức chế kênh K+ nhạy cảm với ATP ngăn không cho K+ thoát ra, làm màng tế bào bị kh cực Sự kh cực màng tế bào gây mở kênh calci phụ thuộc điện thế, calci ngoài tế bào vào trong tế bào, lượng calci được tăng lên trong bào tư ng sẽ kích thích giải phóng insulin t các hạt tiết của tế bào (hình 1.4) [77]

Hình 1.4 Cơ chế tác dụng của các thuốc nhóm sulfunylure [77]

Thuốc được s dụng để điều trị đái tháo đường tác dụng theo c chế này điển hình là các sulfunylure Ngoài ra, có 3 hoạt chất thuộc nhóm meglitinid

c ng đ được đưa vào s dụng là repaglinid, glimepirid và nateglinid [19] Bên cạnh đó, một số dược liệu c ng được chứng minh tác dụng tăng sản xuất insulin theo c chế này Nghiên cứu chứng minh tác dụng kích thích tế bào sản xuất insulin trên dược liệu được các nhà khoa học nghiên cứu chủ yếu thông qua định lượng insulin huyết thanh sau khi dùng thuốc chế phẩm th hoặc qua thực

nghiệm in vitro trên đảo tụy cô lập và tế bào đ n d ng Các d ng tế bào hay

được s dụng nhất là -TC-6, BRIN-BD11, RIN-5F, HIT-T15 của chuột [24],

[129], [167] Ví dụ như trong thí nghiệm in vitro với dịch chiết methanol của cây

cáp gai đen (Capparis zeylanica ) trên d ng tế bào MIN6- , kết quả cho thấy nồng độ insulin tăng do tăng nồng độ Ca2+ nội bào [24] Ranjbari (2016) khi

nghiên cứu cây t m ma (Urtica dioicand) cho thấy dịch chiết nước t dược liệu

này tăng tiết insulin trên tế bào RIN-5 F của chuột [129] Trong nghiên cứu của

Thomas về dịch chiết nước của cây dây cóc (Tinospora crispain) thể hiện tác

dụng tăng tiết insulin trên tế bào HIT-T15 và BRIN-BD11 [167]

Ngoài c chế tăng cường sản xuất insulin thông qua ức chế kênh KAT P,tăng nồng độ calci nội bào, một tác động quan trọng khác đối với sự tăng sản xuất insulin là tác động bảo vệ tế bào trước các tác nhân gây hoại t tế bào

12

hoặc các yếu tố gây chết theo chư ng trình (apoptosis) của tế bào c ng đang được các nhà khoa học nghiên cứu [49],[156] Chemokine CXC là các thụ thể của protein G, có trên màng tế bào, cùng với các cytokine tạo ra các phản ứng viêm Có bảy ligan chemokine CXC đ được phát hiện ở động vật có v Trong

đó mức độ lưu hành CXCL10 (phối t của CXCR3) cao ở những bệnh nhân ĐTĐ typ 1 Ức chế CXCL10 CXCR3 là một chiến lược tiềm năng để điều trị ĐTĐ typ 1 Một thuốc mới có tên là pCAGGS-CXCL10 đang được th nghiệm với c chế trung h a CXCL 10, tăng sinh tế bào , cải thiện tình trạng bị phá hủy của tế bào trên chuột ĐTĐ typ 1 [49]

- Tăng cường số lượng insulin thông qua các incretin

Những kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch đ chứng tỏ tác động của glucose tại tụy không phải là yếu tố duy nhất gây tăng tiết insulin Nghiên cứu của Nauck cho thấy đáp ứng tăng tiết insulin với glucose đường uống vượt xa so với glucose đưa vào b ng đường tiêm tĩnh mạch, hiện tượng này gọi là hiệu ứng incretin Một số hormon nguồn gốc t ruột đ được chứng minh là có thể gây ra hiệu ứng incretin, gọi chung là các hormon incretin Trong số đó, quan trọng nhất là glucagon-like peptid -1(GLP-1) Đây là hormon có tác dụng tăng sản xuất insulin Tác dụng của hormon này trên sự chuyển hóa glucose đ được chứng minh qua nhiều th nghiệm [108]

GLP-1 gây tăng tiết insulin qua c chế hoạt hóa GLP-1R ở tế bào đảo tụy dẫn tới sự tăng AMP v ng và hoạt hóa PKA làm đóng kênh K+, tăng tiết insulin [122] Các thuốc là những chất chủ vận của GLP-1 đ được phê duyệt trong điều trị hiện nay là: exenatid, liraglutid, albiglutide, dulaglutid [19] Ngoài ra taspoglutid có cấu tr c tư ng tự GLP-1 đang được nghiên cứu và th nghiệm [48] Bên cạnh các chất trực tiếp tác động lên receptor GLP-1R, hướng tiếp cận thứ hai là tăng cường số lượng GLP-1 nội sinh Một chất có tên là PTU-cellulose

là chất chủ vận của receptor TAS2R38 được th nghiệm trên chuột, kết quả cho thấy tăng tiết insulin thông qua tăng nồng độ GLP-1 [122] Hiệu ứng tăng tiết GLP-1 còn phụ thuộc một receptor khác là GPR119 thuộc nhóm A trong các receptor liên kết với protein G Kích hoạt GPR119 làm tăng GLP-1 ở ruột, tăng tiết insulin ở tụy và hạ glucose máu [34] 76 dẫn chất khác nhau là chất chủ vận trên GPR119 đ được công bố và đang tiến hành th nghiệm lâm sàng pha I và

II [134]

- Tăng cường số lượng insulin thông qua ức chế DPP -4

Trong c thể, GLP-1 dễ dàng bị bất hoạt bởi sự phân cắt của DPP-4 (hình 1.5) Do đó tăng tác dụng của GLP-1 b ng cách ức chế DPP-4 theo c chế ức

chế cạnh tranh là c chế tác dụng của 1 số thuốc đ được phê duyệt điều trị ĐTĐ hiện nay là sitagliptin, saxagliptin, linagliptin, alogliptin [19]

Hình 1.5 Cơ chế tác dụng của các thuốc ức chế DPP4 [175]

Ngoài các c chế làm tăng cường số lượng insulin đ nêu ở trên, các nhà khoa học c n nghiên cứu sự tăng tiết insulin thông qua các c chế khác như:

- Ức chế ghrelin (peptid điều h a sự tiết hormon) [162] Một số dẫn chất quinazolinon đang được th nghiệm với khả năng đối vận với receptor của ghrelin, t đó tăng nồng độ insulin nội sinh, làm giảm glucose máu [137]

- Tăng tiết insulin do kích thích của glucose (GSIS) thông qua receptor của acid béo Fasiglifam (chất chủ vận của GPR40) đang được nghiên cứu th nghiệm lâm sàng pha III với c chế này TAK-875 là một chất chủ vận mới của GPR40

c ng đ được các nghiên cứu về khả năng tăng tiết insulin phụ thuộc nồng độ glucose [160] Một nghiên cứu khác c ng chỉ ra r ng hoạt hóa receptor ephinA

c ng tăng cường số lượng của insulin phụ thuộc nồng độ glucose CYN154806 là chất chủ vận của ephrin A với tác dụng giảm nồng độ glucose máu, tăng dung nạp glucose, tăng tiết insulin ở chuột ĐTĐ typ 2 [66]

1.2.2 Tăng cường nhạy cảm của mô đích với insulin

Khi tế bào của mô đích không đáp ứng với insulin trong chuyển hóa glucose Do đó, tế bào không s dụng được glucose làm cho nồng độ glucose trong máu tăng lên Các nghiên cứu đ ghi nhận nhiều thuốc có tác dụng làm

14

tăng nhạy cảm của tế bào mô đích với insulin thể hiện qua sự giảm glucose máu, giảm nồng độ insulin huyết thanh l c đói và giảm các chỉ số lipid máu [100], [157]

- Tăng cường nhạy cảm của mô đích với insulin thông qua hoạt hóa AMPK

AMP-Activated protein kinase (AMPK) là một enzym serin threonin protein kinase có mặt rất phổ biến trong c thể AMPK được gọi là “máy đo nhiên liệu”, nó có khả năng cảm biến trạng thái năng lượng ở cả tế bào biệt lập

và toàn bộ c thể Khi được hoạt hóa, AMPK sẽ khởi động quá trình dị hóa tạo

ra ATP đồng thời ức chế quá trình đồng hóa s dụng ATP Có 3 enzym là LKB1, CaMKK và TAK1 có khả năng hoạt hóa AMPK nhờ khả năng x c tác kinase ngược d ng, gây phosphoryl hóa AMPK Ngoài tác dụng trên chuyển hoá như tăng hấp thu glucose, tăng tổng hợp glycogen và giảm tổng hợp lipid, AMPK c n hoạt hoá IRS-1 trong chuỗi truyền tín hiệu của insulin, làm giảm kháng insulin (hình 1.6) [100] AMPK tham gia vào nhiều quá trình chuyển hóa trong c thể (hình 1.6) Sự hoạt hóa AMPK có thể gây tăng gia nhập glucose vào

c , giảm tân tạo glucose ở gan, tăng oxy hóa acid béo ở gan và c , giảm tổng hợp acid béo ở gan và mô m , tăng hoạt động của ty thể, hoạt hóa AMPK ở gan gây hạ glucose máu [43], [100]

Hình 1.6 Cơ chế tác dụng giảm kháng insulin thông qua hoạt hóa MP [100]

Nhóm biguanid, mà đại diện là metformin đ được s dụng điều trị đái tháo đường theo c chế gây hoạt hóa AMPK [100] Bên cạnh thuốc kinh điển là metformin, các hợp chất phân lập t dược liệu c ng đ được chứng minh c chế giảm kháng insulin thông qua hoạt hóa AMPK ví dụ như quecertin và berberin [43]

- Tăng cường nhạy cảm của mô đích với insulin thông qua receptor PPAR

Một trong những c chế bệnh sinh của ĐTĐ typ 2 là sự đột biến hoặc thay đổi biểu hiện gen của receptor PPAR (peroxisome proliferator-activated receptor) PPAR là những receptor ở màng nhân tế bào, khi gắn với các ligand đặc hiệu, PPAR tạo thành dimer với receptor X retinoid (RXR), phức hợp này sẽ gắn với ADN làm điều h a quá trình phiên m và dịch m của một số protein quan trọng trong quá trình biệt hóa tế bào c ng như chuyển hóa glucose và lipid PPAR có hai loại PPAR và PPAR (hình 1.7) [123]

Hình 1.7 Cơ chế truyền tín hiệu của PP [123]

Nghiên cứu liên quan đến thuốc điều trị ĐTĐ tác dụng theo c chế hoạt hoá PPAR tập trung với PPAR bởi vì một trong những đáp ứng sinh học quan trọng nhất liên quan đến receptor PPAR là kích thích biệt hóa tế bào m , kích thích các enzym và protein vận chuyển của tế bào m như lipoprotein lipase, protein vận chuyển acid béo để thu nạp acid béo PPAR- phân bố nhiều nhất ở

mô m và ruột già Ligand nội sinh đặc hiệu với PPAR- là một số loại chất béo như prostaglandin, leukotrien [123] Khi PPAR gắn vào ligan có tác dụng làm giảm nồng độ acid béo tự do trong huyết tư ng, tức là gián tiếp cải thiện nguyên nhân gây kháng insulin ở mô đích Bên cạnh đó, c n làm tăng nhạy cảm với insulin thông qua sự thay đổi các hormon đặc hiệu do tế bào m sản xuất (adipokin) Hoạt hóa PPAR- gây kích thích sự tạo thành adiponectin, một hormon có tác dụng làm tăng oxi hóa acid béo, tăng đáp ứng với insulin và giảm

sự tạo thành mảng vữa x , đồng thời làm giảm các cytokin cản trở hoạt động của

Aid béo tự do

Màng tế bào Chất béo

Nhân

tế bào

17 chất chủ vận trên receptor PPAR có tác dụng giảm kháng insulin [25]

- Tăng cường nhạy cảm của mô đích với insulin thông qua quá trình truyền tín hiệu của insulin

Tăng cường nhạy cảm của mô đích với insulin thông qua quá trình truyền tín hiệu của insulin ở tế bào đích với đặc trưng là sự phosphoryl hóa Tyr hậu receptor Thực tế, hiện tượng kháng insulin trong bệnh ĐTĐ typ 2 c ng có nguyên nhân quan trọng là sự giảm phosphoryl hóa Tyr, tăng phosphoryl hóa Ser hoặc Thr của insulin receptor Nhiều thuốc đ được chứng minh tác dụng ức chế phosphoryl hóa Ser của insulin receptor, do đó trực tiếp tác động vào nguyên nhân gây kháng insulin như exendin-4, rosiglitazon, pioglitazon Các thuốc khác như neprhilin, anephril đang trong giai đoạn nghiên cứu th nghiệm [92] Nghiên cứu về dược liệu tác dụng theo c chế này của Sridha (2007) cho thấy

dịch chiết quả Mướp đắng (Momordica charantia L.) có tác dụng khôi phục khả

năng phosphoryl hóa Tyr của insulin receptor trên chuột cống béo phì ĐTĐ typ 2 [157]

Tăng cường nhạy cảm của mô đích với insulin thông qua con đường truyền tín hiệu nội bào của insulin c n bị ảnh hưởng bởi số lượng và ái lực gắn hormon của receptor ở tế bào đích Các nghiên cứu chủ yếu được thực hiện trên

đối tượng là dược liệu Lá cây dâu (Folium Mori) được nghiên cứu với sự giảm

glucose máu, tăng dung nạp glucose, giảm kháng insulin, giảm cholesterol, triglycerid toàn ph n đi kèm với sự tăng biểu hiện mRNA và protein của IRS-1, PI3K P85 [30]

Quá trình truyền tín hiệu của insulin ở tế bào đích gây ra chuỗi phosphoryl hóa IR, IRS-1,2, hoạt hóa IP3 kinase và protein PDK1, Akt, dẫn tới phosphoryl hóa và gây bất hoạt GSK-3 Hiện nay, người ta đ tìm ra nhiều vai tr quan trọng của GSK-3 trong điều h a hoạt động tế bào, đặc biệt là trong quá trình truyền tín hiệu của insulin GSK-3 gây ra sự phosphoryl hóa gốc Ser307

và Ser332của IRS-1, làm ức chế sự phosphoryl hóa tyrosin và làm giảm đi sự truyền tín hiệu

của insulin Do đó, bất hoạt GSK-3 làm tăng nhạy cảm của mô đích với insulin [59] 7-hydroxy-benzimidazol là một hoạt chất có tác dụng theo c chế này [147]

Tư ng tự như vậy muối lithium c ng là một trong những chất có tác dụng ức chế GSK-3 [31] Theo một nghiên cứu tổng quan của Pandey (2016) cho thấy nhiều chất ức chế GSK-3 hiện nay đang được nghiên cứu th nghiệm [119]

Quá trình phosphoryl hóa Tyr là thuận nghịch, chiều nghịch được x c tác bởi protein tyrosin phosphatase (PTP) Các nghiên cứu đ chỉ ra r ng nồng độ cao PTP-1B nội bào làm giảm sự phosphoryl hóa IR và IRS-1 Do đó, ức chế PTP-1B tăng nhạy cảm của mô đích với insulin [169] Theo một nghiên cứu tổng quan, đ có 44 chất có tác dụng ức chế PTP1B [96] Rễ cây Chóc máu nam được nghiên cứu tại Việt Nam c ng được chứng minh có tác dụng ức chế PTP1B [11] Nghiên cứu của Nguyen P.H (2015) về chất selariscinin được phân lập t cây

trường sinh thảo (Selaginella tamariscina) c ng cho thấy tác dụng ức chế

PTP1B [109]

Một yếu tố gây kháng insulin c ng được đề cập tới là histone deacetylase (HDAC) (các enzym xúc tác cho quá trình kh eacetyl nhóm -N-acetyl lysine amino acid ở ph n đuôi của histon) [143] HDAC không chỉ ức chế IRS-1 trong chuỗi truyền tín hiệu của insulin mà c n gắn vào promoter của gen m hóa tổng hợp GLUT4, làm giảm quá trình tổng hợp GLUT4, giảm thu nạp glucose Vorinostat, trichostatin A và acid valproic là các chất có tác dụng giảm chế ức chế HDAC trên chuột ĐTĐ typ 2 [60], [83],

1.2.3 Tác dụng điều hòa, chuyển hóa tương tự như insulin

Insulin là hormon có vai tr đặc biệt quan trọng trong điều h a glucose máu Khi glucose máu tăng cao, insulin tăng cường sự thu nhận glucose t máu vào tế bào c và mô m thông qua kích thích GLUT4 Ngoài ra, insulin còn tham gia vào quá trình điều h a các enzym chủ chốt trong quá trình tổng hợp và thoái hóa glucose [64] Nghiên cứu cho thấy một số thuốc, hoạt chất và dược liệu c ng có c chế tác động tư ng tự như insulin [64],[70]

- Tác dụng tương tự insulin thông qua các enzym

Trước hết phải kể đến c chế ức chế các enzym trong quá trình tạo glucose nội sinh như glucose-6-phosphatase (G6Pase), fructo1,6 biphosphatase (F1,6BPase) và glycogen phosphorylase (GP)

Glucose-6-phosphatase (G6Pase) là một phức hệ enzym x c tác phản ứng phân cắt glucose-6-phosphat (G6P) thành glucose và gốc phosphat vô c , đây là

18

khâu cuối cùng trong cả hai quá trình thoái hóa glycogen và tân tạo glucose Ức chế G6Pase c ng là một trong các đích của thuốc điều trị ĐTĐ đang được quan tâm [155],[185] Metformin là thuốc điều trị ĐTĐ typ 2 kinh điển được s dụng rộng r i nhất hiện nay Ngoài c chế làm tăng nhạy cảm của mô đích với insulin thông qua AMPK, metformin c n ức chế G6Pase làm giảm tổng hợp glucose tại gan Tác dụng này của metformin là do ức chế biểu hiện gen của G6Pase và

h an toàn độc lập với con đường truyền tín hiệu của insulin Một hợp chất khác

là eugenol khi s dụng cho chuột ĐTĐ typ 2 c ng có giảm glucose máu và giảm hoạt độ enzym G6pase gan [159]

Một enzym chủ chốt khác trong con đường tân tạo glucose là fructo1,6 biphosphatase (F1,6BPase) F1,6BPase x c tác chuyển F1,6BP thành F6P trong con đường tân tạo glucose do đó ức chế F1,6Bpase gây hạ glucose máu [124] CS-917 là một hoạt chất được phát triển bởi Metabasis với tác dụng ức chế F1,6BPase đang được đưa vào th nghiệm lâm sàng [186] Trong nghiên cứu của Srinivasan, uegenol không chỉ có tác dụng ức chế G6Pase mà c n có cả tác dụng ức chế F1,6BPase trên chuột ĐTĐ typ 2 [159]

Ngoài c chế hạ glucose máu thông qua ức chế hai enzym tân tạo glucose

là G6Pase và F1,6Bpase, sự ức chế glycogen phosphorylase (GP), (một enzym chủ chốt trong quá trình thoái hóa glycogen c ng glucose máu Đây c ng là một đích triển vọng trong điều trị ĐTĐ thực nghiệm được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm [44], [63]

C chế gây hạ glucose máu bởi hoạt hóa các enzym trong quá trình thoái hóa glucose như glucokinase/hexokinase (GK), phosphofructokinase-1 (PFK-1)

c ng được nghiên cứu [6], [21] Bên cạnh sự hoạt hóa các enzym trong quá trình thoái hóa glucose gây hạ glucose máu Với tác dụng hoạt hóa enzym glycogen

synthase, dịch chiết ethanol lá cây cà ri (Murraya koenigii) khi s dụng cho

chuột ĐTĐ thực nghiệm gây bởi STZ, cho thấy sự khôi phục lượng glycogen gan, tăng hoạt độ glycogen synthase và giảm hoạt độ GP [21] Kết quả nghiên

cứu trên cây hư ng nhu tía (Ocimum sanctum L) ở mô hình ĐTĐ thực nghiệm

bởi alloxan cho thấy có sự giảm glucose máu, kèm theo tăng nồng độ glycogen trong gan [82]

- Tác dụng tương tự insulin thông qua hoạt hóa GLUT4

GLUT4 bình thường được dự trữ trong các hạt Khi insulin gắn với receptor, các hạt chuyển ra bề mặt tế bào, h a lẫn vào màng, làm tăng số lượng GLUT4 ở màng tế bào để vận chuyển glucose vào trong tế bào Khi lượng insulin giảm, GLUT4 được tách khỏi màng tế bào nhờ c chế thực bào, hình thành các

hạt nhỏ, sau đó h a vào nhau thành các hạt endosome lớn h n Các hạt endosome này chứa nhiều GLUT4 tiếp tục được phân chia thành các hạt nhỏ, sẵn sàng vận chuyển ra màng tế bào khi nồng độ insulin tăng lên (hình 1.8) [182]

Hình 1.8 Liên quan giữa insulin và GLUT4 [182]

Hạ glucose máu thông qua c chế kích thích GLUT4 đ được chứng minh

trong một số nghiên cứu [42], [70] Nghiên cứu về tác dụng của lá cây sung ngọt

(Ficus carica L) trên chuột béo phì ĐTĐ typ 2 thực nghiệm, cho thấy có sự giảm

nồng độ glucose máu kèm theo tăng biểu hiện gen GLUT4 [70] Nghiên cứu mới đây của Dehghan (2016) về một chế phẩm có tên là Saffron được sản xuất t

nhụy hoa cây nghệ tây (Autumn Crocus) cho thấy tác dụng hoạt hoá và tăng biểu hiện gen của GLUT4 trên cả in vivo và in vitro [42]

1.2.4 Ức chế tiêu hóa carbohydrat

Sự tăng nhanh glucose máu sau bữa ăn góp ph n vào sự hình thành các biến chứng của ĐTĐ Các nghiên cứu với mục đích hạn chế tăng glucose máu sau ăn thường tập trung vào các enzym tham gia vào quá trình tiêu hóa glucid [80]

Enzym đ được biết đến t lâu là -glucosidase x c tác phản ứng thủy phân maltose thành D-glucose, làm tăng nồng độ glucose máu sau ăn Nhóm thuốc tác dụng theo c chế ức chế -glucosidase, hạn chế tăng glucose máu sau

ăn như acarbose, miglitol và voglibose đ được s dụng rộng r i trong điều trị ĐTĐ [19],[80]

Tăng nồng độ glucose máu sau ăn do thủy phân liên kết của các polysaccharid, tinh bột và glycogen c n phụ thuộc vào vai tr quan trọng của

20

enzym -amylase Nghiên cứu ức chế enzym -amylase, hạn chế tăng glucose

máu sau ăn như dịch chiết lá chè xanh (Camellia sinensis L.), chàm mèo (Strobilanthes cusia N.) ức chế -amylase giúp làm giảm glucose máu sau ăn

[38],[76]

1.2.5 Các cơ chế khác gây hạ glucose máu

Ngoài các c chế gây hạ glucose máu nói trên, một số nghiên cứu đ chứng minh nồng độ glucose máu c n bị ảnh hưởng bởi các yếu tố khác

90% glucose được tái hấp thu bởi hệ vận chuyển protein SGLT2 ở ống lượn g n Do vậy, ức chế SGLT2 sẽ làm giảm glucose máu [125] Các thuốc dapagliflozin, canagliflozin, empagliflozin tác dụng theo c chế này đ được phê duyệt s dụng trong điều trị [19] Một số chất đang trong giai đoạn nghiên cứu lâm sàng như sergliflozin, remogliflozin, ASP-1941, BI-10.773 và BI-44.847 [125], [178]

Sự tái hấp thu glucose tại ống thận c n được điều hoà bởi receptor của yếu

tố tăng trưởng (Transforming growth factor- TGF- receptor), một yếu tố gây

x hóa thận t đó dẫn đến giảm sức lọc của c u thận gây tăng glucose máu Do

đó ức chế TGF- sẽ làm tăng sức lọc của c u thận giảm glucose máu sau ăn [50], [85] Nghiên cứu của Kim và cộng sự với hyperosid và quercitin có trong dịch

chiết ethanol cây Osteomeles schwerinae, cho thấy 2 chất này có tác dụng hạ

glucose máu đi kèm với ức chế sự biểu hiện gen của TGF- [85]

Hạn chế sự tăng glucose máu sau bữa ăn có c n liên quan đến amylin, một hormon peptid được bài tiết t tế bào đảo tụy đồng thời với insulin sau khi ăn,

có tác dụng làm giảm tiết glucagon Các nghiên cứu đ chứng minh có sự lắng đọng và kết tụ amylin trong bệnh ĐTĐ typ 2 [93] Pramlintid là một chất tổng hợp hóa học với ưu điểm không bị kết tụ như amylin và có những đặc tính dược động học và dược lực học tư ng tự như amylin nội sinh đ được phê duyệt để điều trị đái tháo đường typ 1 và đái tháo đường typ 2 [19]

Các nghiên cứu đ chứng minh béo phì có liên quan chặt chẽ với bệnh sinh của ĐTĐ typ 2 Béo phì liên quan đến leptin, một hormon do các tế bào mô m

bài tiết ra, nhiệm vụ truyền tín hiệu của gen ob cho n o nhận biết cảm giác no,

dẫn tới ng ng đưa thức ăn vào c thể Trên tụy, leptin làm tăng nhạy cảm của insulin và giảm triglycerid, cholesterol toàn ph n S dụng leptin điều trị cho chuột ĐTĐ typ 2 béo phì làm giảm nồng độ glucose máu [35], [165]

1.3 CÁC MÔ HÌNH THỰC NGHIỆM TRONG NGHIÊN CỨU THUỐC ĐIỀU TRỊ ĐÁI THÁO ĐƯỜNG

1.3.1 Các mô hình thực nghiệm in vivo

- Mô hình gây bệnh ĐTĐ typ 1

ĐTĐ typ 1 là do tổn thư ng thường do tự miễn tế bào đảo tụy Do vậy, các mô hình ĐTĐ typ 1 c ng được phát triển dựa trên nguyên tắc gây suy giảm

về cấu trúc và hoặc chức năng của đảo tụy Có nhiều phư ng pháp khác nhau để gây ĐTĐ typ 1 thực nghiệm trên động vật, t đ n giản đến phức tạp Dưới đây

là một số phư ng pháp được s dụng phổ biến trong các nghiên cứu dược lý thực nghiệm

+ Đái tháo đường typ 1 do di truyền

Gây bệnh ĐTĐ typ 1 theo phư ng pháp lai tạo và chọn giống b ng cách chuyển gen hoặc gây đột biến gen Trên mô hình này, các nhà khoa học đ tìm ra

nhiều loại gen liên quan đến sự phá hủy tế bào như: Idd1, Idd5, Idd 9 trên chuột NOD; Ins2 trên chuột Akita hay Iddm1 trên chuột BB [97] Mô hình này

c n có những hạn chế nhất định như quy trình gây bệnh phức tạp và khả năng thành công giữa các cá thể là không ổn định phụ thuộc vào đáp ứng miễn dịch của t ng cá thể Mặt khác, thời gian gây bệnh kéo dài 18-20 tu n, chi phí tốn kém Hiện nay, chưa thấy có các giống chuột ĐTĐ typ 1 do di truyền tại Việt Nam

+ Đái tháo đường typ 1 do cắt bỏ tuyến tụy

Mô hình gây ĐTĐ typ 1 b ng cách cắt bỏ tuyến tụy là một phư ng pháp kinh điển gây ĐTĐ typ 1 ở một số loài động vật với các triệu chứng tư ng tự như ĐTĐ typ 1 ở người Mức độ tr m trọng của bệnh phụ thuộc vào mức độ phá hủy tụy (một ph n hay h an toàn) Điểm hạn chế của mô hình này là sự tái sinh của tuyến tụy c n lại Do đó mô hình này chỉ thích hợp cho các nghiên cứu về c chế thích nghi của tế bào tuyến tụy Cắt bỏ một ph n tuyến tụy là yêu c u kỹ thuật cao, phải s dụng thuốc mê và kháng sinh ph ng nhiễm khuẩn, có thể gây ảnh hưởng đến kết quả nghiên cứu Sau khi cắt bỏ ph n lớn tụy, động vật ít đáp ứng với các tác động nh m hạ glucose máu H n nữa, trong quá trình làm thí nghiệm c n phải thường xuyên bổ xung các enzym tụy ngoại tiết khác cho động vật thực nghiệm [75]

+ Đái tháo đường typ 1 do hóa chất

Hiện nay, mô hình gây bệnh ĐTĐ týp 1 thường được tạo ra b ng một số tác nhân phá hủy tế bào tuyến tụy trong đó có streptozptocin (STZ) hoặc alloxan đ thực hiện trên các loài động vật như chó, mèo, thỏ và các động vật thuộc bộ gặm nhấm [32], [75]

Sử dụng alloxan liều cao (120-150 mg/kg)

22

Alloxan, một hợp chất pyrimidin triceton có cấu tr c tư ng tự glucose, tích l y gây độc trực tiếp và chọn lọc trên tế bào của tuyến tụy Alloxan phá hủy tế bào gây ra tình trạng ĐTĐ phụ thuộc insulin Alloxan c ng có tác dụng

ức chế glucokinase do đó ức chế bài tiết insulin Động vật được gây ĐTĐ b ng alloxan có những biểu hiện lâm sàng giống biểu hiện ĐTĐ ĐTĐ typ 1 trên người [28] Liều dùng để gây ĐTĐ trên động vật thực nghiệm tùy thuộc vào t ng nghiên cứu [26], [28] Ưu điểm của mô hình này là dễ thực hiện, gây được mức glucose máu tăng cao ổn định trong một thời gian ngắn sau khi tiêm alloxan nhưng nhược điểm là tế bào gan, thận và các c quan khác c ng bị ảnh hưởng bởi sự oxy hóa của alloxan [26]

Streptozocin (STZ) liều cao (150-200 mg/kg)

Giữa thập niên 60 của thế kỷ trước, các nhà khoa học đ phát hiện ra độc tính chọn lọc của STZ trên các tế bào đảo tụy, gợi ý cho s dụng STZ để gây ĐTĐ typ 1 STZ có khả năng gây tăng glucose máu ổn định h n alloxan, đồng thời ít gây ra nhiễm toan ceton và ít gây chết động vật nghiên cứu h n alloxan Hiện nay, STZ được dùng thay thế d n alloxan trong các nghiên cứu ĐTĐ thực nghiệm trên động vật Liều STZ gây ĐTĐ typ 1 trên động vật thực nghiệm thay đổi tùy t ng nghiên cứu và tùy t ng loài [32], [75]

+ Đái tháo đường typ 1 do nhiễm virus

Trên c sở sự liên quan của một số loại virus với bệnh sinh ĐTĐ typ 1, có thể gây ĐTĐ typ 1 thực nghiệm với virus coxsacki hoặc một số virus khác như: quai bị, rubella, rota, parvo, herpes, entero viêm gan B, C Sau đó xác định nồng

độ interleukin 10 (IL-10) và theo d i quá trình tự phá hủy của tế bào tại các mạch bạch huyết [114] Mô hình này chưa được áp dụng tại Việt Nam

- Mô hình gây bệnh ĐTĐ typ 2

ĐTĐ typ 2 là sự rối loạn phức tạp liên quan đến các yếu tố di truyền, dịch

tễ học, chuyển hóa và môi trường Mô hình gây bệnh ĐTĐ typ 2 thường được các nghiên cứu áp dụng dựa trên yếu tố di truyền, chế độ dinh dư ng và hóa chất với mục đích làm tăng glucose máu và kháng insulin ở mô ngoại vi [32], [75]

ĐTĐ typ 2 do đột biến gen

Gen leptin trên chuột béo phì (ob/ob) và chuột ĐTĐ (db/db) đóng vai tr

điều chỉnh lượng thức ăn, tiêu hao năng lượng và duy trì chuyển hóa năng lượng Những chuột thiếu hụt gen leptin và receptor của nó, có thể dẫn đến béo phì và kháng insulin [165] Mô hình gây bệnh ĐTĐ typ 2 b ng đột biến gen leptin được thực hiện trên các chủng chuột: C57BL 6, Zucker, Sprague Dawley [86], [165]

Mặt khác, các nhà khoa học, c ng đ tìm ra được 1 số loại gen nhạy cảm với

ĐTĐ typ 2 như Tbc1d, Pctp, Abcg1, Nmur2, Nob3, Zfp69 Sự đột biến các gen

nhạy cảm trên dẫn đến khởi phát ĐTĐ typ 2 [86], [165] Ngoài ra, đột biến gen

gây ức chế biểu hiện gen GLUT2 và GLUT4 c ng dẫn đến xuất hiện sự kháng

insulin và tăng glucose máu [86]

Mô hình ĐTĐ typ 2 di truyền có béo phì hoặc không béo phì có bệnh sinh

g n giống với bệnh sinh ĐTĐ typ 2 ở người Trong mô hình này các chủng chuột di truyền đ được chọn lựa và phát triển bệnh ĐTĐ typ 2 một cách tự nhiên Tuy nhiên, mô hình này đ i hỏi điều kiện kỹ thuật lai tạo phức tạp, kinh phí tốn kém nên c ng chưa được thực hiện tại Việt Nam

+ Gây ĐTĐ typ 2 bằng cách sử dụng hóa chất

.S dụng STZ liều thấp

Thông qua lựa chọn liều STZ, có thể gây được những biểu hiện tư ng tự ĐTĐ typ 2 Các liều STZ thường được s dụng là liều thấp (35-65mg/kg tiêm màng bụng) [37], Ưu điểm của mô hình s dụng STZ liều thấp để gây ĐTĐ typ

2 là sự tăng glucose máu ổn định Hạn chế lớn nhất là thiếu những b ng chứng

r ràng về tình trạng kháng insulin Hiện nay, các nhà khoa học hạn chế s dụng

đ n độc liều STZ để gây mô hình ĐTĐ typ 2 cho động vật mà thường kết hợp STZ với nicotinamid hoặc với chế độ ăn giàu chất béo [33],[168]

Kết hợp STZ và nicotinamid: Nicotinamid là một chất chống oxi hóa bảo vệ tế bào b ng cách trung h a các gốc tự do được sinh ra bởi STZ và hạn chế tổn thư ng tế bào đảo tụy Do đó, sự kết hợp s dụng STZ với nicotinamid

c ng được s dụng để gây bệnh ĐTĐ typ 2 Liều thường s dụng trong mô hình này t 60 - 240 mg kg nicotinamid tùy t ng nghiên cứu Sự kết hợp này cùng với chế độ ăn giàu chất béo c ng được s dụng để gây bệnh ĐTĐ typ 2 trên chủng chuột C57BL/6J [168] Ưu điểm của mô hình này là sự tăng glucose máu

ổn định, và, mô hình gây bệnh đ n giản, có thể thực hiện được tại Việt Nam

Kết hợp STZ liều thấp và chế độ ăn giàu chất béo là phư ng pháp được

s dụng phổ biến trong các nghiên cứu để gây ĐTĐ thể béo phì ở loài gặm nhấm

như chuột cống chủng Wistar, C57BL/6J, KK-ay và Sprague Dawley [54],

[173] Nguyên tắc tiến hành bao gồm cho chuột ăn thức ăn giàu chất béo (thành

ph n chất béo trong thức ăn chiếm khoảng 40-60% tổng lượng calo) trong thời gian dài (1-2 tháng) để gây kháng insulin và gây tổn thư ng tế bào đảo tụy [173] Chuột gây béo phì b ng phư ng pháp này có nhiều đặc điểm giống với

24

béo phì trên người như tăng nồng độ leptin, tăng kháng insulin, giảm biểu hiện của adiponectin và resistin [35] Để r t ngắn thời gian gây mô hình, có thể kết hợp chế độ ăn giàu chất béo với một hóa chất gây phá hủy tế bào đảo tụy với liều thấp, trong đó STZ liều thấp thường được s dụng phổ biến [54], [173] Tại Việt Nam, một số tác giả đ áp dụng mô hình gây ĐTĐ typ 2 cho chuột thực nghiệm b ng chế độ ăn giàu chất béo kết hợp với tiêm STZ liều thấp [6],[11]

1.3.2 Các mô hình thực nghiệm in vitro

Các mô hình in vitro đánh giá ảnh hưởng cụ thể của thuốc ở mức độ tế

bào, phân t gi p tìm hiểu sâu h n về c chế tác dụng của thuốc Các mô hình

nghiên cứu in vitro c ng rất hữu ích trong nghiên cứu sàng lọc ban đ u khi c n

sàng lọc một số lượng lớn các mẫu

- Đánh giá tác động l n hoạt tính của các enzym ti u hóa và chuyển hóa glucid

+Enzym tiêu hóa glucid

Các enzym tham gia tiêu hóa glucid liên quan đến nồng độ glucose máu

sau ăn thường được nghiên cứu in vitro là: glucosidase (EC 3.2.1.20),

-amylase (EC 3.2.1.1) và -galactosidase (EC 3.2.1.23) [80] Phư ng pháp nghiên cứu ức chế enzym tiêu hóa glucid nghiên cứu thuốc điều trị ĐTĐ typ 2 là phư ng pháp đ n giản, dễ thực hiện

+ Enzym chuyển hóa hóa glucid

Mô hình thực nghiệm in vitro liên quan đến tổng hợp glucose thường

được các nghiên cứu thực hiện với các enzym: glucose phosphatase (EC 3.1.3.9) và Fructose-1,6-biphosphatase (EC 3.1.3.11) Enzym liên quan đến quá trình thoái hóa glucose là enzym hexokinase (EC 2.7.1.1 và

6-EC 2.7.1.2) [40], [57]

Các mô hình đánh giá tác dụng in vitro của thuốc chế phẩm th trên các

enzym chuyển hóa glucid có ưu điểm là tốn ít thời gian, không đ i hỏi kỹ thuật phức tạp, có thể áp dụng sàng lọc một lượng mẫu lớn trong thời gian ngắn, chi phí thấp

- Đánh giá khả năng bài tiết insulin của tế bào β đảo tụy

Nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc trên khả năng tiết insulin của tuyến tụy

có thể tiến hành trên đảo tụy cô lập hoặc tế bào đảo tụy Mô hình này hiện đ được bổ sung và hoàn chỉnh để có thể thu được đảo tụy một cách đ y đủ nhất về mặt hình thái c ng như chức năng Để thu được đảo tụy tinh khiết, một số tác giả

đ s dụng phá v tụy ngoại tiết b ng collagenase kết hợp với phư ng pháp tách đảo tụy ra khỏi các tạp khác nhờ vào sự khác nhau về tỉ trọng của Kelly [81]

Đánh giá ảnh hưởng của thuốc chế phẩm th trên khả năng chết theo chư ng trình hoặc sự sinh sản, thay đổi kích thước tế bào của chuột c ng đ được các nhà khoa học áp dụng trong một số nghiên cứu [120],[167] Chức năng của tế bào được thông qua đánh giá nồng độ insulin và mức độ biểu hiện gen của một số protein đặc hiệu [120]

- Đánh giá mức độ nhạy cảm của mô đích với insulin

Các d ng tế bào nguyên phát được nuôi cấy, biệt hóa thành tế bào trưởng thành trong môi trường thích hợp Sau đó các tế bào được ủ với mẫu th ở nồng

độ khác nhau trong các điều kiện về môi trường, nhiệt độ, chất x c tác, chất ức chế cho phù hợp với t ng mô hình thực nghiệm cụ thể Đánh giá sự nhạy cảm của mô đích với insulin thông qua mức độ mức độ biểu hiện gen tổng hợp các protein có vai tr quan trọng trong hoạt động của insulin như IRS-1, Akt, GSK3, AMPK, PPAR, GLUT4 thông qua số lượng các protein được tạo thành sau thí nghiệm [70], [183], so sánh với lô chứng không ủ mẫu th t đó có kết luận về tác dụng của mẫu th

Tế bào c xư ng đóng vai tr quan trọng trong chuyển hoá glucose, tạo năng lượng cho h u hết các hoạt động của c thể hoặc dự trữ dưới dạng

glycogen [183] Mô hình thực nghiệm in vitro trên tế bào c xư ng được nhiều

nghiên cứu s dụng để đánh giá mức độ nhạy cảm của tế bào đích với insulin [140] D ng tế bào C2C12 và L6 là những d ng tế bào c xư ng chuột có khả năng tồn tại tốt h n các tế bào khác trong các điều kiện khác nhau Các tế bào dễ sinh trưởng trong điều kiện nồng độ huyết thanh cao và có biểu hiện lặn trong điều kiện nồng độ huyết thanh thấp Hai d ng tế bào này là một công cụ rất hữu ích để nghiên cứu về sự trao đổi chất trong c thể, đặc biệt là glucose [140]

Bên cạnh tế bào c xư ng, các tế bào mô m thường được s dụng trong

nghiên cứu in vitro để đánh giá tác dụng giảm kháng insulin của mô đích ví dụ

như là tế bào 3T3-L1 và tế bào Schwann 3T3-L1 là một d ng tế bào có nguồn gốc t chuột Khi biệt hoá tế bào này, có khả năng tổng hợp và dự trữ triglycerid Những tế bào này c ng rất nhạy cảm với kích thích tố, thuốc, hormon và insulin [55],[72]

D ng tế bào Schwann là các tế bào mô m (IM S32 và IFRS1) đệm bao quanh tế bào th n kinh Các tế bào này có thể tồn tại trong ống nghiệm trong

bào, phân t Nhưng nhược điểm là quy trình kỹ thuật phức tạp mà không phải

ph ng thí nghiệm nào c ng có thể thực hiện được

Bên cạnh các nghiên cứu trên d ng tế bào, một số nghiên cứu có thể đánh

giá c chế tác dụng của thuốc trong ĐTĐ typ 2 thông qua tác động in vitro lên

các enzym có vai tr quan trọng trong hoạt động của insulin như PTP1B (EC 3.1.3.48) [109], GSK-3 (EC 2.7.11.26) [147] Tác động ức chế các enzym này

sẽ góp ph n làm tăng hoạt động của insulin ở mô đích Các nghiên cứu in vitro

được thực hiện đ gi p tìm ra được nhiều chất có nguồn gốc t dược liệu có tác dụng ức chế PTP1B [51], [109], [146]

1.4 CÂY CHUỐI TIÊU

1.4.1 Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật

- Vị trí phân loại

Theo các tài liệu Thực vật hiện có tại trường Đại học Dược Hà Nội bao

gồm: Cây c Việt Nam- Ph m Hoành Hộ, Từ điển thực vật thông dụng- Võ Văn

Chi , Flora of China Vol 4, Flora Reipubliace Popularis Sinicae – Tomus 16(2)

và phân lo i Thực vật; Từ điển cây thuốc Việt Nam, cây chuối tiêu thuộc chi Musa, một chi n m trong họ Chuối (Musaceae) Vị trí của cây chuối tiêu trong

hệ thống phân loại thực vật được được tóm tắt như sau: