Nghiên cứu chế tạo bộ kit LAMP chẩn đoán nhiễm giun lươn đường ruột (strongyloides stercoralis) ở người 2017 2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG -* TRẦN THỊ KIM CHI NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ KIT LAMP CHẨN ĐOÁN NHIỄM GIUN LƯƠN ĐƯỜNG RUỘT (Strongyloides stercoralis) Ở NGƯỜI 2017-2020 LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC Hà Nội – Năm 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG TRẦN THỊ KIM CHI NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ KIT LAMP CHẨN ĐOÁN NHIỄM GIUN LƯƠN ĐƯỜNG RUỘT (Strongyloides stercoralis) Ở NGƯỜI 2017-2020 Chuyên ngành: Ký sinh trùng y học Mã số: 62 72 01 16 LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC Cán hướng dẫn khoa học: PGS.TS TRẦN XUÂN MAI PGS.TS NGUYỄN THỊ HƯƠNG BÌNH Hà Nội – Năm 2021 i LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận án này, tơi PGS.TS Trần Xuân Mai PGS.TS Nguyễn Thị Hương Bình nhiệt tình hướng dẫn, chỉnh sửa giúp đỡ suốt thời gian qua Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến hai quý thầy cô hướng dẫn Tơi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Trần Thanh Dương Viện trưởng Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương động viên, tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành trình học Thầy chủ nhiệm đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu chế tạo kít lamp chẩn đoán ký sinh trùng sốt rét, sán gan lớn, sán gan nhỏ, giun lươn đường ruột thực địa”, mã số KC.10.16/16-20 Một lần xin cám ơn thầy thành viên đề tài tạo điều kiện, giúp đỡ suốt thời gian thực đề tài nghiên cứu Tôi xin trân trọng cám ơn giúp đỡ, nhắc nhở động viên PGS TS Cao Bá Lợi tồn thể cán bợ Phịng Khoa học – Đào tạo Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương để tơi bước hồn thành luận án thời gian cho phép Ngồi tơi xin gửi lời cám ơn đến thầy tham gia hội đồng đánh giá kết nghiên cứu luận án cấp tơi Các thầy có nhiều đóng góp q báu, dẫn giúp tơi hồn thiện luận án tốt thầy PGS TS Lê Xuân Hùng, PGS TS Nguyễn Mạnh Hùng, PGS TS Nguyễn Quang Thiều, PGS TS Đoàn Huy Hậu, PGS TS Nguyễn Khắc Lực, GS TS Nguyễn Văn Ba, TS Nguyễn Thị Hồng Ngọc, TS Đỗ Trung Dũng, TS Đỗ Ngọc Ánh, TS Đỗ Như Bình TS Trương Văn Hạnh ii Tơi xin cám ơn Khoa Sinh học phân tử, Khoa Ký sinh trùng Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương; Bộ môn Vi sinh – Ký sinh – khoa Y – Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh, Bợ mơn Ký sinh trùng, trường Đại học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch Trung tâm y tế huyện xã huyện Đức Hòa, tỉnh Long An giúp tơi suốt q trình thu thập mẫu thực đề tài nghiên cứu Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn vơ hạn đến bố, mẹ, chồng, con, anh chị em gia đình bạn bè, đồng nghiệp khơng ngừng đợng viên, khích lệ, tạo điều kiện giúp tơi vượt qua khó khăn để hồn thành luận án Luận án bước khởi đầu nghiệp khoa học mình, lời cảm ơn chưa đủ để nói hết tình cảm thật đáng quý tất người bên giúp đỡ tơi Tơi mang theo tình cảm suốt hành trang c̣c đời Trần Thị Kim Chi iii Luận án một nhánh đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu chế tạo kít lamp chẩn đốn ký sinh trùng sốt rét, sán gan lớn, sán gan nhỏ, giun lươn đường ruột thực địa”, mã số KC.10.16/16-20 mà một thành viên tham gia Tôi xin cam đoan kết quả, số liệu thu luận án trung thực chưa công bố luận án khác Các bước tiến hành thực đề tài đề cương nghiên cứu, chấp hành đầy đủ quy định tiến hành nghiên cứu Nếu có sai sót, tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Tác giả Trần Thị Kim Chi iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Danh mục từ viết tắt tiếng Việt: Từ viết tắt ADN AIDS AT ATGL bp BYT CDC cox1 CS ĐHYK ELISA GL HIV HTLV-1 IgG IgM K v KHV KST KT LAMP LIPA LIPS MG Multiplex PCR nested PCR NPV PCR PPV RNA Se SHPT Sp Tp.HCM WHO – vi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lịch sử phát hiện, nghiên cứu giun lươn Strongyloides stercoralis 1.2 Đặc điểm sinh học, bệnh học giun lươn S stercoralis 1.2.1 Hình thái học 1.2.2 Chu kỳ phát triển 1.2.3 Triệu chứng bệnh giun lươn 1.3 Chẩn đoán điều trị bệnh giun lươn 1.3.1 Định nghĩa ca bệnh giun lươn Strongyloides stercoralis 1.3.2 Các phương pháp xét nghiệm chẩn đoán nhiễm giun lươn 1.3.3 Điều trị bệnh giun lươn 1.4 Tình hình nhiễm giun lươn 1.4.1 Tình hình nhiễm giun lươn giới 1.4.2 Tình hình nhiễm giun lươn Việt Nam 1.5 Kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt mạch vòng LAMP 1.5.1 Lịch sử phát triển LAMP 1.5.2 Nguyên lý kỹ thuật LAMP 1.5.3 Ưu, nhược điểm kỹ thuật LAMP 1.5.4 Một số ứng dụng kỹ thuật LAMP chẩn đoán bệnh n 1.6 Nghiên cứu xây dựng chuẩn hóa bợ kit LAMP chẩn đốn tác nhân gây bệnh 1.6.1 Thiết kế mồi cho phản ứng LAMP 1.6.2 Chuẩn hóa điều kiện phản ứng LAMP vii 1.6.3 Xác định ngưỡng phát hiện, xây dựng chuẩn dương kỹ thuật 29 1.6.4 Đánh giá độ nhạy, đợ đặc hiệu, tính ổn định bợ kit LAMP 30 1.6.5 Xây dựng tiêu chuẩn sở bộ kit 33 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1 Mục tiêu 1: Xây dựng quy trình chế tạo bợ kit LAMP để chẩn đốn nhiễm giun lươn đường ruột Strongyloides stercoralis người 34 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 34 2.1.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 34 2.1.3 Thiết kế nghiên cứu 34 2.1.4 Nội dung nghiên cứu 35 2.1.5 Các kỹ thuật sử dụng nghiên cứu 40 2.1.6 Các số đánh giá 41 2.2 Mục tiêu 2: Đánh giá đợ nhạy, đợ đặc hiệu, tính ổn định bợ kit phịng thí nghiệm thực địa .41 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 41 2.2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 42 2.2.3 Thiết kế nghiên cứu 42 2.2.4 Nội dung nghiên cứu 45 2.2.5 Các kỹ thuật sử dụng nghiên cứu 48 2.2.6 Các số đánh giá 49 2.2.7 Xử lý số liệu .49 2.3 Kiểm soát sai số 51 2.4 Đạo đức nghiên cứu 51 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 53 3.1 Xây dựng quy trình chế tạo bợ kit LAMP để chẩn đốn nhiễm giun lươn đường ṛt Strongyloides stercoralis người .53 3.1.1 Kết thiết kế mồi 53 3.1.2 Kết xác định điều kiện phản ứng LAMP với bộ mồi tự thiết kế 59 3.1.3 Ngưỡng phát bộ kit LAMP 64 viii 3.1.4 Kết xây dựng chứng dương .68 3.1.5 Kết chế tạo bộ kit LAMP chẩn đoán nhiễm S stercoralis 70 3.2 Đánh giá đợ nhạy, đợ đặc hiệu, tính ổn định bợ kit phịng thí nghiệm thực địa .73 3.2.1 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu bộ kit LAMP phịng thí nghiệm 73 3.2.2 Điều kiện bảo quản độ ổn định bộ kit LAMP chẩn đốn giun lươn đường ṛt 75 3.2.3 Đánh giá bộ kit thực địa, so sánh bộ kit với bộ mồi Pedro với hai phương pháp chẩn đoán giun lươn thường dùng 80 3.2.4 Kiểm định tiêu chuẩn sở bộ kit 86 Chương BÀN LUẬN 87 4.1 Xây dựng quy trình chế tạo bợ kit LAMP để chẩn đốn nhiễm giun lươn đường ruột Strongyloides stercoralis người .87 4.1.1 Kết thiết kế mồi 87 4.1.2 Kết xác định điều kiện phản ứng LAMP với bộ mồi tự thiết kế 90 4.1.3 Ngưỡng phát bộ kit 95 4.1.4 Kết xây dựng chứng dương .96 4.1.5 Kết chế tạo bộ kit LAMP chẩn đoán nhiễm S stercoralis 97 4.2 Đánh giá đợ nhạy, đợ đặc hiệu, tính ổn định bợ kit phịng thí nghiệm thực địa .97 4.2.1 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu bộ kit LAMP phịng thí nghiệm 97 4.2.2 Điều kiện bảo quản độ ổn định bộ kit 98 4.2.3 Đánh giá bộ kit thực địa, so sánh bộ kit với bộ mồi Pedro với hai phương pháp chẩn đoán giun lươn thường dùng .100 4.2.4 Đăng ký kiểm định tiêu chuẩn sở bộ kit .109 KẾT LUẬN 110 5.1 Xây dựng quy trình chế tạo bợ kit LAMP để chẩn đốn nhiễm giun lươn đường ruột Strongyloides stercoralis người 110 Phụ lục Kết chẩn đoán nhiễm giun lươn Khoa KST, Viện Sốt rét-Ký sinh trùngCôn trùng Trung ương phương pháp 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 Phụ lục 6: Giấy chứng nhận Viện Kiểm định Quốc gia vắc xin sinh phẩm y tế Phụ lục 7: Một số hình ảnh nghiên cứu Hình ảnh nghiên cứu phịng thí nghiệm Hình ảnh triển khai thu mẫu thực địa ... pháp chẩn đốn khác áp dụng rợng rãi thực địa Vì vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài ? ?Nghiên cứu chế tạo kit LAMP chẩn đoán nhiễm giun lươn đường ruột (Strongyloides stercoralis) người 2017- 2020? ??...BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG TRẦN THỊ KIM CHI NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ KIT LAMP CHẨN ĐOÁN NHIỄM GIUN LƯƠN ĐƯỜNG RUỘT (Strongyloides stercoralis). .. hợp bộ kit LAMP nghiên cứu soi phân trực tiếp 84 Bảng 3.22 Kết đánh giá độ phù hợp bộ kit LAMP nghiên cứu phương pháp ELISA 85 Bảng 3.23 Tiêu chuẩn sở bợ kit LAMP chẩn đốn giun lươn đường ṛt