Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan hài giáp (paphiopedilum malipoense) bằng phương pháp in vitro

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRỊNH THỊ TUYẾT NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LAN HÀI GIÁP (Paphiopedilum malipoens) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO LUÂṆ VĂN THACC̣ SĨSINH HOCC̣ ỨNG DỤNG THÁI NGUYÊN - 2016 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRỊNH THỊ TUYẾT NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LAN HÀI GIÁP ( Paphiopedilum malipoens) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUÂṆ VĂN THACC̣ SĨSINH HOCC̣ ỨNG DỤNG Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Văn Duy THÁI NGUYÊN - 2016 i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu thực hiện dưới sư ̣ hướng dâñ TS Nguyễn Văn Duy Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả luận văn Trịnh Thị Tuyết ii LỜI CẢM ƠN Lời xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Văn Duy ThS Nguyễn Thị Tình, Khoa CNSH - CNTP, Trường Đại học Nơng Lâm Thái Ngun tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ suốt thời gian thực hiện hồn thành luận văn Tơi xin cảm ơn thầy cô giáo anh chi ̣kỹ thuật viên phịng thí nghiệm ni cấy mơ tế bào thực vật , Khoa CNSH - CNTP, Trường đại học Đại học Nông Lâm Thái Nguyên tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình làm luận văn thạc sĩ Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Khoa hoc ̣ - Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Khoa hoc ̣ Sư ̣ sống thầy cô giáo, cán Khoa, đặc biệt sự quan tâm, giúp đỡ anh chi ̣ kỹthṭviên phịng thí nghiệm Khoa Khoa hoc ̣ sư s ̣ ống Tôi xin cảm ơn gia đình bạn bè ln bên cạnh ủng hộ, khuyến khích, động viên tạo động lực để tơi hồn thành luận văn Trong q trình làm luận văn khơng tránh khỏi sai sót, tơi mong nhận sự đóng góp q báu từ phía thầy bạn bè để tơi làm tốt Tác giả luận văn Trịnh Thị Tuyết iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN .ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii MỞ ĐẦU .1 Đặt vấn đề Mục đích nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 4.1 Ý nghĩa khoa học 4.2 Ý nghĩa thực tiễn CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .4 1.1 Tổng quan phân loại đặc điểm lan Hài lan Hài Giáp 1.1.1 Đặc điểm thực vật học lan Hài (Paphiopedilum) 1.1.2 Đặc điểm thực vật học lan Hài Giáp 11 1.2 Khái quát nuôi cấy mô tế bào 15 1.2.1 Các vấn đề thường gặp nhân giống in vitro 15 1.2.2 Ưu nhược điểm phương pháp nuôi cấy mô 16 1.2.3 Quy trình nhân giống in vitro 18 1.2.4 Ứng dụng nuôi cấy mô nghiên cứu ứng dụng nông nghiệp .20 1.3 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô lan Hài giới nước 21 1.3.1 Trên giới 21 1.3.2 Trong nước 24 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 26 2.2 Phạm vi nghiên cứu 27 2.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu 27 iv 2.4 Hóa chất thiết bị nghiên cứu 28 2.4.1 Hóa chất 28 2.4.2 Thiết bị 28 2.4.3 Dụng cụ 28 2.5 Phương pháp nghiên cứu 29 2.5.1 Phương pháp chuẩn bị môi trường điều kiện nuôi cấy .29 2.5.2 Phương pháp nuôi cấy in vitro 30 2.5.3 Phương pháp xử lí số liệu 32 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng thời gian khử trùng dung dịch HgCl2 0,1 % đến lan Hài Giáp .33 3.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng môi trường tới khả nảy mầm hạt lan Hài Giáp 35 3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng số chất kích thích sinh trưởng hợp chất hữu đến khả nhân nhanh chồi lan Hài Giáp 36 3.3.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng BA tới khả nhân nhanh chồi lan hài Hài Giáp 36 3.3.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng BA kết hợp với NAA tới khả nhân nhanh chồi lan Hài Giáp 39 3.3.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng dịch chiết chuối xanh tới khả nhân nhanh chồi lan Hài Giáp 42 3.4 Kết nghiên cứu tạo in vitro hoàn chỉnh .45 3.4.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng NAA đến khả rễ lan Hài Giáp 45 3.4.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng NAA kết hợp với than hoạt tính tới khả rễ 48 3.5 Kết nghiên cứu ảnh hưởng giá thể tới khả sinh trưởng phát triển lan Hài Giáp 50 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ADN: Deoxyribonucleic acid B5: Gamborg cs, 1976 BA : - benzyl amino purine CT : Công thức CS : Cộng sự ĐC : Đối chứng KC: Knudson C MS : Murashighe Skoog, 1962 NAA : Naphthalene acetic acid PCR: Polymerase Chain Reaction RAPD: Random Amplification of Polymorphic DNA THT : Than hoạt tính SH: Schenk and Hildebrandt, 1972 VW : Vacin and Went WPM : Woody Plant Medium – Lioyd Mc Cown, 1980 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Các nhóm lan Hài ViêṭNam theo thứ hang ̣ bảo tồn Tổchức Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế(IUCN) Bảng 2.1: Hóa chất nghiên cứu 28 Bảng 2.2: Thiết bị nghiên cứu 28 Bảng 3.1: Kết nghiên cứu ảnh hưởng thời gian khử trùng dung dịch HgCl2 0,1% đến lan Hài Giáp 33 Bảng 3.2: Kết nghiên cứu ảnh hưởng môi trường tới khả nảy mầm hạt 35 Bảng 3.3: Kết nghiên cứu ảnh hưởng BA tới khả nhân nhanh lan Hài Giáp 37 Bảng 3.4: Kết nghiên cứu ảnh hưởng BA kết hợp với NAA tới khả nhân nhanh chồi lan Hài Giáp 40 Bảng 3.5: Kết nghiên cứu ảnh hưởng dịch chiết chuối xanh tới khả nhân nhanh chồi lan Hài Giáp 43 Bảng 3.6: Ảnh hưởng NAA tới sự rễ 46 Bảng 3.7: Kết nghiên cứu ảnh hưởng NAA kết hợp với than hoạt tính ảnh hưởng tới khả rễ 48 Bảng 3.8: Sự phát triển lan Hài Giáp số giá thể ngồi mơi trường tự nhiên (sau tuần) 51 vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Hình thái lan Hài Giáp 13 Hình 2.1: Cây lan Hài Giáp 27 Hình 2.2: Sơ đồ thí nghiệm .29 Hình 3.1: Ảnh hưởng mơi trường tới khả nảy mầm hạt sau 12 tuần .36 Hình 3.2: Ảnh hưởng BA tới khả nhân nhanh chồi lan Hài Giáp 39 Hình 3.3: Ảnh hưởng BA kết hợp với NAA tới khả nhân nhanh chồi lan Hài Giáp 42 Hình 3.4: Ảnh hưởng dịch chiết chuối xanh tới khả nhân nhanh lan Hài Giáp 44 Hình 3.5: Ảnh hưởng NAA tới khả rễ lan Hài Giáp .47 Hình 3.6: Ảnh hưởng NAA kết hợp với THT tới khả rễ lan Hài Giáp 50 Hình 3.7: Ảnh hưởng giá thể tới khả sinh trưởng phát triển lan Hài Giáp 52 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Hoa lan người biết đến sớm từ 2.800 năm TCN, coi đỉnh cao tiến hóa lồi hoa Hiện giới với 800 chi 25.000 – 30.000 lồi Họ Lan (Orchidaceae) chiếm vị trí thứ hai sau họ Cúc (Asteraceae) ngành thực vật hạt kín [20] Vì hình thái, cấu tạo hệ thống phân loại họ đa đa dạng phức tạp Việt Nam quốc gia đánh giá có sự đa dạng sinh học phong phú, phong lan Việt Nam đa dạng số loài, màu sắc chủng loại với 140 loại phong lan chia thành 1000 giống nguyên thủy Chúng thường phân bố vùng rừng núi Cao Bằng, Sa Pa, Lào Cai, Huế, Hải Vân, Quy Nhơn, Kontum, Pleiku, Ban Mê Thuật, Phan Rang, Đà Lạt, Di Linh, v.v [13] Trong số lồi lan Việt Nam có nhiều quý điển hình giống Lan Hài (Paphiopedilum) gồm 66 loài phân bố từ Ấn Độ, New Ghine vùng Đơng Nam Á, người Pháp gọi lồi thuộc giống Hài Vệ Nữ Sabot de Venus người Anh dùng với ý nghĩa tương tự Lady's slippers [1] Hiện Việt Nam tìm thấy 22 lồi thuộc chi Paphiopedilum có lồi đặc hữu có giá trị xuất hiện Việt Nam lan Hài Đỏ, lan Hài Vàng, lan Hài Tía, lan Hài Trắng, lan Hài Vân, lan Hài Vân Duyên, lan Hài Đốm, lan Hài Lông hay lan Hài Râu,…[1] Lan Hài Giáp loài lan xuất hiện số tỉnh miền núi phía bắc Bắc Kạn, Hà Giang, Hịa Bình, Lạng Sơn, Sơn La,…Lồi sinh sống khu rừng nguyên sinh rậm, thường xanh rộng hỗn giao kim núi đá vơi kết tinh bị bào mịn mạnh độ cao từ 600 đến 1200m [16] Đây lồi lan Hài đặc biệt có hoa đẹp tao nhã với đài cánh hoa xanh cây, mơi xám, xanh nhạt nhị lép trắng với chóp màu nâu tía, hoa có mùi thơm táo nhẹ Chúng có rộng kẻ chữ nhật đốm khảm xanh tươi xanh thẫm, đốm tím tía mặt dưới cụm hoa thường dài mang hoa to đơn Phụ lục 3: Thành phần môi trường B5 (Gamborg cs, 1976) C Phụ lục 4: Kết xử lý số liệu 4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến QUẢ Lan Hài Giáp Anova: Single Factor SUMMARY Groups ct ct ct ct ct ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Kết luận: Qua kết phân tích cho thấy F >F crit nên thời gian xử lý HgCl2 0,1% ảnh hưởng đến kết khử trùng lan Hài Giáp 4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường tới khả nảy mầm hạt lan Hài Giáp Anova: Single Factor SUMMARY Groups ct1 ct2 ct3 ct4 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Kết luận: Qua kết nghiên cứu cho thấy F > Fcrit mơi trường khác có ảnh hưởng tới khả nảy mầm hạt 4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng BA đến khả nhân nhanh chồi lan Hài Giáp 4.3.1 Chỉ tiêu hệ số nhân chồi Anova: Single Factor SUMMARY Groups ct1 ct2 ct3 ct4 ct5 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Kết luận: Qua kết phân tích cho thấy F >F crit nên số hệ số nhân chồi khác sự khác hàm lượng BA khác 4.3.2 Chỉ tiêu chiều cao chồi Anova: Single Factor SUMMARY Groups ct ct2 ct3 ct4 ct5 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Kết luận: Qua kết phân tích cho thấy F >F crit nên chiều cao chồi khác sự khác hàm lượng BA khác 4.4 Nghiên cứu ảnh hưởng BA kết hợp với NAA tới khả nhân nhanh chồi lan Hài Giáp 4.4.1 Chỉ tiêu hệ số nhân chồi Anova: Two-Factor Without Replication SUMMARY BA mg/l BA mg/l BA mg/l BA mg/l BA mg/l NAA mg/l NAA 0,1 mg/l NAA 0,3 mg/l NAA 0,5 mg/l NAA mg/l ANOVA Source of Variation Rows Columns Error Total Qua kết phân tích cho thấy: F rows (BA) < F crit (BA) nên hàm lượng BAkhông ảnh hưởng tới số chồi/ mẫu F colum (NAA) > F crit (NAA) nên hàm lượng NAA ảnh hưởng tới số chồi/ mẫu 4.4.2 Chỉ tiêu chiều cao chồi Anova: Two-Factor Without Replication SUMMARY BA mg/l BA mg/l BA mg/l BA mg/l BA mg/l NAA mg/l NAA 0,1 mg/l NAA 0,3 mg/l NAA 0,5 mg/l NAA mg/l ANOVA Source of Variation Rows Columns Error Total Qua kết phân tích cho thấy: F rows (BA) < F crit (BA) nên hàm lượng BA không ảnh hưởng tới chiều cao chồi F colum (NAA) > F crit (NAA) nên hàm lượng NAA ảnh hưởng tới chiều cao chồi 4.5 Nghiên cứu ảnh hưởng dịch chiết chuối tới khả nhân nhanh chồi lan Hài Giáp 4.5.1 Chỉ tiêu hệ số nhân chồi Anova: Single Factor SUMMARY Groups ct1 ct2 ct3 ct4 ct5 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Kết luận: Vì F> Fcrit hàm lượng dịch chuối có ảnh hưởng tới tiêu hệ số nhân 4.5.2 Chỉ tiêu chiều cao chồi Anova: Single Factor SUMMARY Groups ct1 ct2 ct3 ct4 ct5 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Kết luận: Vì F> Fcrit hàm lượng dịch chuối có ảnh hưởng tới tiêu chiều cao chồi 4.6 Nghiên cứu ảnh hưởng NAA tới khả rễ lan Hài Giáp 4.6.1 Chỉ tiêu tỷ lệ chồi rễ Anova: Single Factor SUMMARY Groups ct ct2 ct3 ct4 ct5 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Kết luận: F > Fcrit nồng độ NAA có ảnh hưởng tới tiêu tỷ lệ chồi rễ 4.6.2 Chỉ tiêu số rễ/chồi SUMMARY Groups ct1 ct2 ct3 ct4 ct5 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Kết luận: Kết nghiên cứu cho thấy F > F crit nên nồng độ NAA ảnh hưởng tới tiêu số rễ/chồi 4.6.3 Chỉ tiêu chiều dài rễ Anova: Single Factor SUMMARY Groups ct1 ct2 ct3 ct4 ct5 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Kết luận: Kết nghiên cứu cho thấy F > F crit nên nồng độ NAA ảnh hưởng tới tiêu chiều dài rễ 4.7 Nghiên cứu ảnh hưởng NAA kết hợp với than hoạt tính 4.7.1 Chỉ tiêu tỷ lệ chồi rễ Anova: Two-Factor Without Replication SUMMARY NAA 0,4 mg/l NAA 0,4 mg/l NAA 0,4 mg/l NAA 0,4 mg/l NAA 0,4 mg/l THT 0mg/l THT 0,5 mg/l THT mg/l THT 1,5 mg/l THT 2mg/l ANOVA Source of Variation Rows Columns Error Total 4.7.2 Chỉ tiêu số rễ/chồi Anova: Two-Factor Without Replication SUMMARY NAA 0,4 mg/l NAA 0,4 mg/l NAA 0,4 mg/l NAA 0,4 mg/l NAA 0,4 mg/l THT 0mg/l THT 0,5 mg/l THT mg/l THT 1,5 mg/l THT 2mg/l ANOVA Source of Variation Rows Columns Error Total 4.7.3 Chỉ tiêu chiều dài rễ Anova: Two-Factor Without Replication SUMMARY NAA 0,4 mg/l NAA 0,4 mg/l NAA 0,4 mg/l NAA 0,4 mg/l NAA 0,4 mg/l THT 0mg/l THT 0,5 mg/l THT mg/l THT 1,5 mg/l THT 2mg/l ANOVA Source of Variation Rows Columns Error Total 4.8 Nghiên cứu ảnh hưởng giá thể tới khả sinh trưởng phát triển lan Hài Giáp 4.8.1 Chỉ tiêu tỷ lệ sống Anova: Single Factor SUMMARY Groups ct1 ct2 ct3 ct4 ct5 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Kết luận: Kết nghiên cứu cho thấy F > F crit nên giá thể có ảnh hưởng tới tiêu tỷ lệ sống 4.8.2 Chỉ tiêu chiều cao Anova: Singl Factor SUMMARY Groups CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Kết luận: Kết nghiên cứu cho thấy F < F crit nên giá thể không ảnh hưởng tới tiêu chiều cao ... xuất hiện Việt Nam lan Hài Đỏ, lan Hài Vàng, lan Hài Tía, lan Hài Trắng, lan Hài Vân, lan Hài Vân Duyên, lan Hài Đốm, lan Hài Lông hay lan Hài Râu,…[1] Lan Hài Giáp loài lan xuất hiện số tỉnh... với NAA tới khả nhân nhanh chồi lan Hài Giáp 39 3.3.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng dịch chiết chuối xanh tới khả nhân nhanh chồi lan Hài Giáp 42 3.4 Kết nghiên cứu tạo in vitro hoàn... kích thích sinh trưởng hợp chất hữu đến khả nhân nhanh chồi lan Hài Giáp 36 3.3.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng BA tới khả nhân nhanh chồi lan hài Hài Giáp 36 3.3.2 Kết nghiên cứu ảnh