đề cương khóa luận Nghiên cứu quy trình nhân nhanh hoa hồng cổ SaPa ( Rosaceae) bằng phương pháp in vitro

Hoa hồng là một trong những loài hoa được ưa chuộng nhất trên thế giới bởi màu sắc và hương thơm của nó. Hoa hồng được sử dụng phổ biến hiện nay dưới dạng hoa cắt cành, hoa trồng chậu (Wang et al., 2002). Trong tự nhiên, hoa hồng cũng như nhiều loài hoa khác đều sinh trưởng và phát triển theo quy luật khi sinh trưởng đến một ngưỡng nhất định cây sẽ chuyển từ giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng sang sinh trưởng sinh thực, sự phân hóa mầm hoa hình thành, hoa xuất hiện.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC PHƯƠNG ĐÔNG KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG - - ĐỀ CƯƠNG KHÓA LUẬN/CHUYÊN ĐỀ TỐT NGHIỆP Tên đề tài : “ Nghiên cứu quy trình nhân nhanh hoa hồng cổ SaPa ( Rosaceae) phương pháp in vitro.” Người thực hiện: HỒNG VĂN NGỌC Lớp: 513301 Khóa: 2013-2017 Giáo viên hướng dẫn: TS Phùng Tôn Quyền Giáo viên hướng dẫn: TS ĐồngThị Kim Cúc Địa điểm thực tập: Trung tâm thực nghiệm Sinh học Nông Nghiệp Công nghệ cao– Viện Di truyền Nông Nghiệp HàNội - Năm 2017 ĐỀ CƯƠNG KHÓA LUẬN/CHUYÊN ĐỀ TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Hoàng Văn Ngọc Tel: 0982964885 Mail: hoangngocth070295@gmail.com Chun ngành: Cơng nghệ Sinh học Lớp: 513301 Khố: 513 Giáo viên hướng dẫn: TS.Đồng Thị Kim Cúc Tel:0987620886 Mail: dongthikimcuc@gmail.com Tên đề tài :“ Nghiên cứu quy trình nhân nhanh hoa hồng cổ SaPa ( Rosaceae) phương pháp invitro.” Học viên thực (Ký ghi rõ họ tên) XÁC NHẬN CỦA CƠ SỞ THỰC TẬP TỐT NGHIỆP PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Hoa hồng loài hoa ưa chuộng giới màu sắc hương thơm Hoa hồng sử dụng phổ biến dạng hoa cắt cành, hoa trồng chậu (Wang et al., 2002) Trong tự nhiên, hoa hồng nhiều loài hoa khác sinh trưởng phát triển theo quy luật sinh trưởng đến ngưỡng định chuyển từ giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng sang sinh trưởng sinh thực, phân hóa mầm hoa hình thành, hoa xuất Q trình hoa phức tạp, chịu ảnh hưởng nhiều yếu tố nội sinh ngoại sinh Sự phát triển hoa thực vật bậc cao thu hút quan tâm nhiều nhà khoa học nước giới, đặc biệt thời điểm chuyển từ giai đoạn sinh dưỡng sang giai đoạn sinh thực Thời điểm đánh giá kiện quan trọng chu kì sống Hệ thống hoa ống nghiệm xem cơng cụ hữu ích nghiên cứu hoa thực vật Bên cạnh đó, xem hướng tiếp cận lai tạo giống hoa Hơn nữa, hoa ống nghiệm sản phẩm thương mại tiềm mở phương thức chơi hoa Một số nghiên cứu cảm ứng hoa invitro hoa hồng công bố (Wang et al., 2002; Vu et al., 2006; Kantamaht et al., 2009…), nhiên nghiên cứu tập trung vào việc sử dụng chất điều tiết sinh trưởng thực vật, quang chu kì thời gian cấy chuyển nhằm cảm ứng hoa mà chưa quan tâm đến vai trò yếu tố vi lượng trình Trên thực tế, ảnh hưởng nguyên tố vi lượng đến trình hoa tiến hành số đối tượng Theo Uthaichay et al (2007) việc phun Ag giảm rụng hoa nụ hoa lan Ag làm giảm 100% tượng rụng hoa Alstroemeria so với hoa không xử lý (Wagstaff et al., 2005) Sharma et al (2008) điều khiển hoa in vitro ớt (Capsicum frutescens) Ứng dụng nuôi cấy mô tế bào nhân nhanh giống hoa: Ứng dụng nuôi cấy mô giai đoạn để nhân nhanh giống cần thiết, giống khó nhân nhanh biện pháp thông thường cần sản xuất hàng loạt theo nhu cầu thị trường Sản xuất giống chất lượng cao từ công nghệ nuôi cấy mô: Việc ứng dụng thành tựu công nghệ sinh học tạo giống trồng, vật nuôi với suất cao, chất lượng tốt, đáp ứng nhu cầu thị trường Phương pháp nuôi cấy mô tế bào tạo nhiều, nhanh, bảo đảm chất lượng loại giống hoa cảnh, lâm nghiệp, bảo quản lưu giữ nguồn gen sinh học quý địa phương 1.2Tính cấp thiết đề tài Hiện nay, có nhiều giống hoa hồng ngoại du nhập vào Việt Nam Tuy nhiên cịn có nhiều người chơi hoa hồng thích đam mê hoa hồng truyền thống có nước ta Hoa hồng “chiến lợi phẩm” từ thiên nhiên mang nhiều giá trị kinh tế ngày nay, nhiều loại đa dạng màu sắc khác nhau, trang trí thành chậu hoa kiểng, hoa trang trí, hoa cảnh Bên canh đó, hoa hồng cịn sử dụng khâu chưng chất nước hoa, tinh dầu tiết chế nhiều để tạo nhiều loại mỹ phẩm Như ta biết, tinh dầu từ hoa hồng thảo dược thơm mang nhiều công dụng giúp làm giảm chứng bệnh tiêu hóa, liệu chất an thần cho người căng thẳng thần kinh, trị ngủ, mệt mỏi… Xã hội ngày tăng tiến kéo theo xu làm đẹp nhiều chị em phụ nữ, hoa hồng ngày phái đẹp ưa chuộng dùng để điều chế nước hoa hồng việc dưỡng da, tắm nước hoa hồng dưỡng ẩm thể mịn màng Nước hoa hồng có cơng dụng xua tan mệt mỏi liều thuốc giúp xoa nhẹ da trẻ trung mịn da Nếu sử dụng nước hoa hồng tắm thường xuyên mang lại trẻ trung, có da trắng hồng mịn màng giúp giảm lo âu ngày làm việc căng thẳng Sử dụng cánh hoa hồng để ngâm dấm chua tạo dung dịch khử mùi sát trùng Cánh hoa hồng có chứa nhiều dưỡng chất bổ sung vitamin C, carotene, vitamin nhóm B, Canxi, Magie….Những dưỡng chất có lợi cho thể hệ tim, tuần hoàn, hệ miễn dịch, máu…Các nghiên cứu nhiều trường Đại học lớn Mỹ rằng, nước ép hoa hồng cịn có cơng hiệu việc ngăn ngừa ung thư, giảm độ huyết áp thể Với bệnh nhân bị chứng cao huyết áp sử dụng loại nước giải khát tinh chế từ hoa hồng mang lại cho thể khỏe khắn lạc quan yêu đời Các nghiên cứu thực tiễn tự nhiên cánh hoa hồng có khả làm chết vi khuẩn chúng tiếp xuc trực tiếp cánh hoa hồng, điều mang lại thành công cho khoa học điều chế loại dược phẩm có khả bảo vệ da, hạn chế mưng mủ vết thương , vết da bị bỏng….Cánh hoa hồng ngăn ngừa vết ngứa dị ứng da Trong y học cổ truyền phương Đơng, hoa hồng mang sẵn tính ngọt, có tác dụng hoạt huyết, điều kinh, tiêu viêm, tiêu sung Hoa hồng đẹp dùng thuốc chữa huyết mạch lưu thông, thông kinh mạch, phụ nữ kinh nguyệt không đều, bệnh mụn nhọt, thủy đậu da…Đặc biệt, hoa hồng trăng có nhiều tinh dầu nhiều dưỡng chất vitamin cần thiết cho việc điều trị bệnh ho trẻ Bởi lẽ đó, hoa hồng cịn dùng làm trà hoa hồng – vừa thuốc chữa cảm lạnh, viêm họng, viêm phổi chứng đau đầu thần kinh mạch, đồng thời thức uống giàu dưỡng chất vitamin cho thể Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu quy trình nhân nhanh hoa hồng cổ SaPa ( Rosaceae) phương pháp in vitro” 1.3 Mục tiêu nghiên cứu đề tài Tìm hiểu nghiên cứu quy trình nhân giống hoa hồng cổ SaPa phương pháp in vitro Khảo sát điều kiện sinh trưởng hoa hồng cổ SaPa điều kiện phịng thí nghiệm 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn 1.4.1 Ý nghĩa khoa học Kết đề tài góp phần bổ sung quy trình nuôi cấy in vitro nhân giống bảo tồn loài hoa hồng cổ SaPa loài hoa hồng khác Hồn thiện quy trình ni cấy in vitro nhân giống bảo tồn loài hoa hồng cổ SaPa Cung cấp tài liệu học tập, nghiên cứu cho sinh viên 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn Kết đề tài phục vụ cho việc tạo hoàn chỉnh góp phần nhân giống phục vụ trực tiếp cho ngành lâm nghiệp, công nghệ thực phẩm, y dược học phục vụ cho sản xuất Phần TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU Cơ sở khoa học đề tài 2.1 Giới thiệu chung hoa hồng 2.1.1.1 Nguồn gốc phân loại Cây hồng cổ SaPa có nguồn gốc từ nước Châu Âu, thuộc chi Hồng, người Pháp mang tới trồng vùng Sapa Cây cịn có tên gọi khác Hoa hồng cổ Sapa hay Hoa hồng Pháp Thuộc bụi có nhiều gai, có màu xanh tươi, nhiều hoa, hoa có nhiều màu chủ yếu màu tím màu hồng 2.1.1.2 Đặc điểm sinh học hoa hoa hồng - Hoa hồng truyền thống có dạng bụi, bán leo loại leo khỏe - Cây kháng chịu khí hậu khắc nghiệt Việt Nam (mùa đơng lạnh, mùa hè nóng) - Lá xanh quanh năm, hương thơm - Ưa đất thịt, đất canh tác lâu năm giàu mùn hữu - Ưa ánh nắng thống gió - Không chịu ngập úng - Trồng chậu hay đất phát triển tốt - Siêng hoa, hoa thơm dịu 2.1.1.3 Giá trị hoa hồng cổ SaPa Cây sống lâu năm có giá trị kinh tế cao Cây sai hoa, bơng to, dáng đẹp hương thơm Cho hoa liên tục năm Hồng cổ SaPa ( Rosaceae) dùng trồng làm cảnh sân vườn, tiểu cảnh, trồng khuôn viên đô thị, công viên trồng chậu trang trí nội thất văn phịng, ban cơng 2.1.2 Phương pháp nhân giống hoa hông cổ SaPa 2.1.2.1 Phương pháp nhân giống truyền thống Gieo hạt Là phương pháp lấy hạt giống cho nảy mầm thành con, hạt giống thu từ chín, điều kiện thích hợp nảy mầm hình thành Ưu điểm: vận chuyển bảo quản hạt giống dễ dàng kích thước hạt giống nhỏ Nhược điểm: phương pháp cho hệ số nhân thấp Cắt chồi từ mẹ Là phương pháp cắt cành (ngó) từ củ mẹ tạo thành Ưu điểm: tốn thời gian Nhược điểm: phương pháp cho hệ số nhân thấp, dễ bị thối hóa, rễ yếu Phương pháp không đảm bảo bệnh bệnh truyền từ mẹ sang 2.1.2.2 Phương pháp nhân giống công nghệ sinh học Nuôi cấy mô (nhân giống in vitro) Nhân giống in vitro hình thức sử dụng chồi đỉnh, lá, hoa, cuống lá, đoạn thân non nuôi dưỡng điều kiện đặc biệt để hình thành thể hoàn chỉnh Ưu điểm: Hệ số nhân giống cao, đồng đều, bệnh, chủ động việc sản xuất phục vụ cho công tác giống Nhược điểm: Cây có kích thước nhỏ, xảy đột biến biến dị làm xuất không mong muốn, cần trang thiết bị đặc biệt (Võ Quốc Việt cs, 2010) [21] Ngoài ra, theo Hoàng Ngọc Thuận (2000) [18] việc nuôi cấy in vitro sử dụng nguồn hydrocacbon nhân tạo mà khả tự tổng hợp chất hữu kém, đồng thời nuôi cấy in vitro ni bình thủy tinh có độ ẩm bão hòa, mà trồng điều kiện tự nhiên thường bị nước, khơng thích nghi dễ bị héo chết 2.2 Tình hình phát triển hoa hồng giới Việt Nam 2.2.1 Tình hình phát triển giới Ngày sản xuất hoa giới phát triển cách mạnh mẽ trở thành ngành thương mại cao Sản xuất hoa mang lại lợi ích to lớn cho kinh tế nước trồng hoa cảnh, có nước châu Á Sản xuất hoa nước châu Á phát triển mạnh cạnh tranh liệt để chiếm lĩnh thị trường hoa giới Diện tích trồng hoa giới ngày mở rộng không ngừng tăng lên Ba nước sản xuất hoa hoa lớn chiếm 50% sản lượng hoa giới Nhật Bản, Hà Lan, Mỹ Theo Roger Alan (1998) năm 1995 giá trịsản lượng hoa giới đạt 20 tỷ USD đến năm 1997 đạt 27 tỷUSD dự kiến đầu kỷ21 đạt 40 tỷ USD, Nhật Bản khoảng 3,731 tỷ USD; Hà Lan khoảng 3,558 tỷ USD; Mỹ khoảng 3,270 tỷ USD Giá trị xuất nhập hoa cảnh giới tăng hàng năm Năm 1996 7,5 tỷ la, từ thị trường hoa Hà Lan chiếm gần 50% Sau đến nước Cơlơmbia, Italia, Đan Mạch, Mỹ, Bỉ, Israen, Úc, Đức, Canada, Pháp, Tây Ban Nha, Kênia, Ecuado… nước 100 triệu đôla, tỷ lệ tăng trưởng hàng năm 10% Đức Mỹ quốc gia chiếm 50% thị trường nhập hoa với loài hoa phổ biến cẩm chướng, cúc, hồng, lay ơn, lan… Hà Lan nước xuất hoa lớn giới, chiếm tới 64,8% thị trường, lồi hoa tiếng xuất từ Hà Lan là: Lily, hồng, lay ơn, đồng tiền, cẩm chướng 2.2.2 Tình hình phát triển Việt Nam Việt Nam có diện tích đất tự nhiên 33 triệu diện tích trồng hoa Việt Nam chiếm 0,02% diện tích đất đai Hoa trồng lâu đời tập trung số vùng trồng hoa truyền thống Ngọc Hà, Quảng An, Tây Tựu (Hà Nội), Đằng Hải, Đằng Lâm (Hải Phịng), Hồnh Bồ, Hạ Long (Quảng Ninh), Triệu Sơn (Thanh hố), Gị Vấp, Hóc Mơn (TP Hồ Chí Minh)…với tổng diện tích trồng khoảng 3500 Phong trào trồng hoa Việt Nam năm gần ý phát triển, diện tích hoa tăng nhanh Điều kiện khí hậu đất đai đa dạng tạo điều kiện để trồng nhiều loại hoa, phát triển hệ thống trồng hoa thâm canh nhà nước quan tâm hỗ trợ Theo Viện Nghiên cứu Rau-Quả lợi nhuận thu từ trồng hoa cao 10- 15 lần so với trồng lúa 7-8 lần so với trồng rau Gần 90% loài hoa trồng nhằm đáp ứng nhu cầu tiêu thụ nước, nhiên thị trường xuất tăng nhanh với số loại hoa đặc thù Việt Nam (hoa sen, hoa nhà số loài hoa mà nước ơn đới trồng khó khăn mùa Đông (hồng, cúc…) Theo số liệu Tổng cục thống kê, năm 2003 nước có 9430ha hoa cảnh loại với giá trị sản lượng 482,6 tỷ đồng Ở Việt Nam hình thành vùng hoa lớn sau: Vùng hoa đồng sơng Hồng: với khí hậu mùa nhiều vùng khí hậu đặc thù nên thích hợp cho trồng nhiều loại hoa Hoa trồng hầu hết tỉnh vùng tập nhiều thành phố lớn: Hà Nội, Hải Phòng, Nam Định, Hải Dương, Bắc Ninh, Vĩnh Phúc… Hoa vùng chủ yếu phục vụ tiêu thụ nước,và số chủng loại nhỏ xuất sang Trung Quốc (hồng, cúc ) Hồng loài hoa phổ hóa quan chồi rễ.Nhu cầu chất kích thích sinh trưởng lồi giai đoạn ni cấy khác nhau.Vì vậy, để tiến hành ni cấy in vitro thành công cần phải tiến hành nghiên cứu cụ thể để tìm nồng độ tỷ lệ chất kích thích sinh trưởng phù hợp.Trong ni cấy mơ, tế bào thực vật thường sử dụng nhóm chất kích thích sinh trưởnglà auxin, cytokinin gibberelin + Auxin Auxin (Aux) hormone thực vật phát đầu tiên.Qua nhiều nghiên cứu nhà khoa học, người ta nhận Aux hormone thực vật quan trọng toàn giới thực vật Aux dạng tự nhiên gồm có β- Indolacetic Acid (IAA), Phenylacetic Acid, β- Indolyacetonitril Acid Ngồi có dạng Aux tổng hợp đường nhân tạo,đáp ứng nhu cầu người lĩnh vực trồng trọt vàn ghiên cứu như:β-IndolbutiricAcid (IBA), α-Naphtylacetic Acid (α-NAA), 2,4 Diclorophenoxiacetic Acid(2,4D)… Aux nhóm chất kích thích sinh trưởng sử dụng thường xuyên nuôi cấy mô tế bào thực vật Aux kết hợp chặt chẽ với thành phần khác mơi trường dinh dưỡng để kích thích tăng trưởng mô sẹo, huyền phù tế bào điều hịa phát sinh hình thái, đặc biệt sử dụng kết hợp với cytokinin Sự áp dụng loại nồng độ Aux môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào: kiểu tăng trưởng phát triển cầnnghiên cứu, hàm lượng Aux nội sinh mẫu nuôi cấy, tác động qua lại Aux ngoại sinh Aux nội sinh Aux kích thích giãn nở tế bào, làm tế bào phình to dẫn đến tăng kích thước quan tăng diện tích lá, phình to quả, củ, tăng đường kính chiều dài cành, thân, rễ, tạo không hạt, kìm hãm rụng lá, hoa Aux điều khiển tính hướng hướng sáng, hướng đất Do phân bố không Aux hai phía quan, dẫn đến sinh trưởng không tế bào quan, gây tính hướng Ở cấp độ tế bào, Aux cịn ảnh hưởng lớn đến trình trao đổi chất, trình sinh lý trồng như: quang hợp, hơ hấp, trao đổi nước hay khống, tăng khả thẩm thấu tế bào, tăng trình trao đổi acid nucleic,protein… Quan trọng Aux kích thích hình thành rễ, đặc biệt rễ bất định cành chiết, cành giâm mơ ni cấy.Vì vậy, kỹ thuật nhân giống vơ tính, việc sử dụng Aux để kích thích rễ quan trọng bắt buộc + Cytokinin Cytokinin chất kích thích sinh trưởng có tác dụng làm tăng phân chia tế bào Các cytokinin thường gặp kinetin, BAP Kinetin dẫn xuất bazo nito adenine Skoog phát ngẫu nhiên chiết xuất nucleic acid BAP cytokinin tổng hợp nhân tạo có hoạt tính mạnh kinetin.Kinetin BAP có tác dụng kích thích phân chia tế bào kéo dài thời gian hoạt động tế bào phôi sinh làm hạn chế già hóa tế bào Ngồi ra, chất có tác dụng lên qua trình trao đổi chất, trình tổng hợp DNA, tổng hợp protein tăng cường hoạt tính nhiều loại enzyme Cơ chế tác động cytokinin mức độ phân tử tế bào thể tác dụng tương hỗ cytokinin với nucleoprotein làm yếu mối liên kết histon với DNA, tạo điều kiện cho tổng hợp DNA Tác động phối hợp auxin cytokinin có tác động định đến phát triển phát sinh hình thái tế bào mơ Những nghiên cứu Skoog (1963) chothấy tỷ lệ auxin/cytokinin cao phù hợp cho hình thành rễ thấp thích hợp cho phát sinh chồi Nếu tỷ lệ mức cân thuận lợi cho phát triển mô sẹo Miller Skoog (1957) khẳng định vai trị cytokinin q trình phân chia tế bào cụ thể cytokinin điều khiển trình chuyển pha phân bào giữ cho trình diễn cách bìnhthường.Cytokininđượchìnhthànhbởirễvàhạtđangpháttriển + Gibberellin Gibberellin nhóm hormone thực vật thứ hai phát sau auxin nhà nghiên cứu người Nhật Kurosawa (1920) từ việc nghiên cứu bệnhcủa mạ nấm Gibberella Fujikuroi gây ra, chứng bệnh phổ biến trongnghềtrồnglúaởcácnướcphươngĐôngthờibấygiờ,khinghiêncứucơ chế gây bệnh ông tách hàng loạt chất sản phẩm tự nhiên nấm G Fujikuroi từ thực vật bậc cao gọi gibberellin A Hiện nay, người ta phát 50 loại gibberellin ký hiệu A1, A2, …,A52 GA1, GA2, …, GA5,… GA3 (gibberellic acid) có hoạt tính mạnh Gibberellin (GA) tổng hợp phơi quan sinh trưởng khác non, rễ non, non… GA vận chuyển không phân cực, hướng hướng gốc tùy vào vị trí quan sử dụng.Trong tế bào, nơi tổng hợp GA mạnh lục lạp Hiệu sinh lý rõ rệt GA kích thích mạnh mẽ sinh trưởng kéo dài thân, vươn dài lóng họ lúa Hiệu có ảnh hưởng kích thích đặc trưng GA lên pha giãn tế bào theo chiều dọc Vì vậy, xử lý GA làm tăng nhanh sinh trưởng dinh dưỡng nên làm tăng sinh khối chúng GA ảnh hưởng rõ rệt lên sinh trưởng đột biến lùn Các nghiên cứu trao đổi chất di truyền GA khẳng định đột biến lùn số thực vật ngô, đậu Hà lan (chiều cao 20% chiều cao bình thường) đột biến gen đơn giản, dẫn đến thiếu gen chịu trác nhiệm tổng hợp enzyme số phản ứng đường tổng hợp GA mà hình thành GA dù lượng nhỏ Với đột biến việc bổ sung GA ngoại sinh làm cho sinh trưởng bình thường - Các chất phụ gia hữu Các chất phụ gia hữu đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm kích thích sinh trưởng mơ sẹo quan như: nước dừa, dịch chiết khoai tây, chuối, dịch chiết nấm men Trong thành phần nước dừa chứa acid amin, acid hữu cơ, đường, Myo-inositol chất có hoạt tính auxin, gluoxit cytokinin Ngoài ra, khoai tây chuối hay sử dụng thành phần chúng có chứa số loại vitamin chất kích thích tố có tác dụng tích cực đến sinh trưởng phát triển mẫu nuôi cấy - Chất giá thể (thạch -Agar) Agar thành phần định trạng thái vật lí mơi trường nicấy, hàm lượng agar dùng nuôi cấy dao động từ 0,6 - 1,0% theo khối lượng Khi nồng độ agar cao, môi trường trở nên cứng, khuếch tán chất dinh dưỡng hấp thụ mô gặp khó khăn.Đa số ni cấy phơi thực mơi trường có agar phụ thuộc vào loại mà sử dụng cho phù hợp Trong nghiên cứu dinh dưỡng, việc sử dụng agar tránh agar thương phẩm khơng có chứa số ion Ca, Mg, K, Na số nguyên tố khác dạng vết Tuy nhiên, chất nói loại bỏ cách rửa agar với nước cất hai lần 24 giờ, tráng o cồn làm khô 60 C 24 - Giá trị pH môi trường Độ pH môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp tới trình thu nhận chất dinh dưỡng từ mơi trường vào tế bào Vì vậy, môi trường định trường hợp cụ thể loài phải chỉnh độpH môi trường mức ổn định ban đầu Nuôi cấy mơ sẹo (callus) nhiều lồi cây, pH ban đầu thường 5,5 - 6,0 sau tuần nuôi cấy pH đạt giá trị từ 6,0 - 6,5 Đặc biệt sử dụng loại phụ gia có tính kiềm tính acid cao amino acid, vitamin định phải dùng NaOH HCl loãng để chỉnh pH môi trường từ 5,5 - 6,5 Giá trị pH mơi trường thích hợp cho sinh trưởng phát triển nhiều loài thực vật biến đổi từ 5,0 - 6,0 Độ pH cao làm cho môi trường rắn pH thấp lại giảm khả đơng đặc agar đồng thời hoạt hóa enzyme hydrolase, dẫn tới kìm hãm sinh trưởng, kích thích già hóa tế bào mơ nuôi cấy 2.3.2.2 Điều kiện nuôi cấy Nhiệt độ: nhân tố quan trọng ảnh hưởng rõ rệt tới phân chia tế bào trình trao đổi chất mơ ni cấy, đồng thời ảnh hưởng đến hoạt động auxin ảnh hưởng trực tiếp đến khả rễ nuôi cấy mô Nhiệt độ nuôi cấy cần giữ ổn định khoảng 25 – 27°C Ánh sáng:có ảnh hưởng mạnh đến q trình phát sinh hình thái mơ ni cấy, bao gồm cường độ, chu kì thành phần quang phổ ánh sáng Cường độ ánh sáng từ 1000 - 2500lux dùng phổ biến nuôi cấy nhiều loại mơ Với cường độ ánh sáng lớn sinh trưởng chồi chậm lại thúc đẩy trình tạo rễ PHẦN ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: Đối tượng sử dụng nghiên cứu hồng cổ Sapa ( Rosaceae) cung cấp Trung tâm Thực nghiệm Sinh học Nông Nghiệp Công nghệ cao – Viện Di truyền Nông Nghiệp - Phạm vi nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu phạm vi phòng thí nghiệm 3.2 Hóa chất thiết bị sử dụng 3.2.1 Hóa chất sử dụng - Hóa chất sử dụng muối khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin thành phần mơi trường MS - Các chất kích thích sinh trưởng: 2,4-D (Bio science), kinetin (Wako), BA (Duchefa), NAA (Trung quốc), IBA (Duchefa); chất bổ xung như: inositol (Bio science) 3.2.2 Thiết bị sử dụng - Các thiết bị dùng cho nghiên cứu: Cân điện tử (Olhous- Vietlabcu) (Mỹ), nồi hấp khử trùng ALP (Nhật bản), tủ sấy (Memmenrt) (Đức), tủ cấy vô trùng cấp II (Airtech) (Hàn Quốc), máy chuẩn pH (Hanna HI2210) (Đức), Lò vi sóng Sanyo (Nhật bản)… Ngồi cịn có trang thiết bị khác phịng thí nghiệm Trung tâm Thực nghiệm Sinh học Nông Nghiệp Công nghệ cao – Viện Di truyền Nông Nghiệp 3.3 Địa điểm thời gian tiến hành - Địa điểm: thí nghiệm tiến hành phịng thí nghiệm ni cấy mơ tế bào thực vật, Trung tâm Thực nghiệm Sinh học Nông Nghiệp Công nghệ cao – Viện Di truyền Nông Nghiệp Thời gian tiến hành: thí nghiệm tiến hành từ tháng 12/2016 đến tháng 5/2017 3.4 Nội dung nghiên cứu 3.4.1 Nội dung 1: Ảnh hưởng chất khử trùng đến trình vơ trùng tạo vật liệu khởi đầu 3.4.2 Nội dung 2: Ảnh hưởng chất KTST BA đến trình nhân chồi Hoa hồng 3.4.3 Nội dung 3: Ảnh hưởng kết hợp chất KTST BA + NAA đến trình nhân chồi 3.4.4 Nội dung 4: Ảnh hưởng kết hợp chất KTST NAA than hoạt tính đến q trình tạo rễ tạo hồn chỉnh 3.5 Phương pháp nghiên cứu tiêu theo dõi 3.5.1 Ảnh hưởng hóa chất đến trình khử trùng tạo vật liệu khởi đầu Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng H2O2 đến trình khử trùng tạo vật liệu khởi đầu CTTN Công thức Công thức Công thức Nồng độ(%) 7 Thời gian(phút) 10 15 Thí nghiệm 2: ảnh hưởng HgCl2 + ethanol 700 đến trình khử trùng tạo vật liệu khởi đầu CTTN Công thức Công thức Công thức Nồng độ(%) 0,1 0,1 0,1 Thời gian(phút) 10 Thí nghiệm 3: ảnh hưởng HgCl2 đến trình khử trùng tạo vật liệu khởi đầu CTTN Công thức Công thức Công thức Nồng độ(%) 0,1 0,1 0,1 Thời gian(phút) 10 3.5.2 Ảnh hưởng chất KTST BA đến q trình nhân chồi Hoa hồng Thí nghiệm: Ảnh hưởng chất KTST BA đến trình nhân chồi Hoa hồng Công thức 1: Môi trường MS Công thức 2: Môi trường MS + 0,1mg/l BA Công thức 3: Môi trường MS + 1,5 mg/l BA Công thức 4: Mơi trường MS + 2,0 mg/l BA Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hồn tồn, có cơng thức, cơng thức nhắc lại lần, cấy 20 mẫu cho công thức Chỉ tiêu theo dõi: - Tỉ lệ mẫu sống, mầm ngủ xanh - Số , chiều cao chồi Thời gian lấy tiêu: 1-2 tuần sau cấy Số chồi tạo thành (%) = Tổng số chồi tạo thành Tổng số mẫu vào × 100% 3.5.3 Ảnh hưởng kết hợp chất KTST BA + NAA đến q trình nhân chồi Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng kết hợp chất KTST BA + NAA đến trình nhân chồi Cơng thức 1: Mơi trường MS Cơng thức 2: Môi trường MS + BA 0,5mg/l Công thức 3: Môi trường MS + BA 3,0mg/l Công thức 4: Môi trường MS + BA 1,5 mg/l + NAA 0,2 mg/l Công thức 5: Môi trường MS + BA 3,0 mg/l + NAA 0,2 mg/l Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hồn tồn, có cơng thức, cơng thức nhắc lại lần, cấy 30 mẫu cho công thức Chỉ tiêu theo dõi: số lá, chiều cao chồi, số chồi Tổng số chồi tạo thành Số chồi tạo thành (%) = Tổng số mẫu vào × 100% 3.5.4 Ảnh hưởng kết hợp chất KTST NAA than hoạt tính đến q trình tạo rễ tạo hồn chỉnh Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng kết hợp chất KTST NAA than hoạt tính đến q trình tạo rễ tạo hồn chỉnh Cơng thức 1: Mơi trường MS Cơng thức 2: Môi trường MS + 0,5mg/L NAA Công thức 3: Môi trường MS + 1mg/L NAA Công thức 4: Môi trường MS + 2mg/L NAA Công thức 5: Môi trường MS + 0,5mg/L NAA + 2g/L than hoạt tính Cơng thức 6: Môi trường MS + 1mg/L NAA + 2g/L than hoạt tính Cơng thức 7: Mơi trường MS + 2mg/L NAA + 2g/L tha hoạt tính Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hồn tồn, có cơng thức, cơng thức nhắc lại lần, cấy 20 mẫu cho công thức Chỉ tiêu theo dõi: số rễ, chiều dài rễ, chiều cao cây, số Số chồi rễ (%) = x100 3.6 Phương pháp xử lí số liệu Các số liệu thu thập thống kê xử lý theo phương pháp thống kê toán học phần mềm Excel phần mềm IRRISTART 4.0 Phần4 DỰ KIẾN KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC 4.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng hóa chất đến q trình khử trùng tạo vật liệu khởi đầu Hóa chất H2O2 Cơng thức Công thức Công thức Công thức CV% LSD05 Nồng độ (%) 7 Thời gian 10 15 Tỉ lệ sống (%) Hóa chất HgCl2+ ethanol 70% Công thức Công thức Công thức Công thức CV% LSD05 Nồng độ (%) 0,1 0,1 0,1 Thời gian 10 Tỉ lệ sống (%) Hóa chất HgCl2 Công thức Công thức Công thức Công thức CV% LSD05 Nồng độ (%) 0,1 0,1 0,1 Thời gian 10 Tỉ lệ sống (%) 4.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng chất KTST BA đến trình nhân chồi Hoa hồng Bảng 4.4 Kết nghiên cứu ảnh hưởng chất KTST BA đến trình nhân chồi Hoa hồng Nồng độ BA Tỉ lệ sống Số (mg/l) Chiều cao Chất lượng chồi chồi Tỉ lệ chồi 0,1 1,5 2,0 CV% LSD05 4.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp chất KTST BA + NAA đến trình nhân chồi Bảng 4.2: Kết nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp chất KTST BA + NAA đến q trình nhân chồi Hóa chất (mg/l) BA NAA 0 0,5 3,0 1,5 0,2 0,2 CV% LSD05 Số Tỷ lệ tạo chồi Chiều cao (%) chồi Số chồi 4.4 Kết nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp chất KTST NAA than hoạt tính đến q trình tạo rễ tạo hoàn chỉnh Bảng 4.6 Kết nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp chất KTST NAA than hoạt tính đến q trình tạo rễ tạo hồn chỉnh Nồng độ NAA Than hoạt (mg/l) tính(g/L) 0,5NAA 0,5 1NAA 0,5 2,0 NAA 0,5NAA 2,0 1NAA 2,0 2NAA+ 2,0 Tỷ lệ tạo rễ Số rễ thu (%) CV% LSD05 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận 5.2 Kiến nghị Chiều dài rễ TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu Tiếng Việt Tài liệu - Trồng, chiết, ghép, giâm cành hoa hồng - Việt Chương - Lâm Thị Mỹ Hương (Thứ Ba, 25 tháng 3, 2014) Nhân giống in vitro hoa hồng mơn (Anthurium andraeanum) Hồng Thị Như Phương,Trần Tuấn Đạt,Trần Văn Minh năm 2014 II Tài liệu Tiếng Anh Alta-Alla H., McAlister B., van Staden J., 1998 In vitro culture and establishment of Anthurium parvispathum South African J Bot 64:296-298 Eapen S., Rao P S., 1985 Regeneration of plant from Anthurium patulum Curr Sci (54): 284-286 Joseph D., Martin K P., Madassery J., Philip V J., 2003 In vitro propagation of three commercial cut flower cultivars of Anthurium andraeanum Hort Indian J Exp Biol (41): 154-159 Kuehnle A R, Sugii N., 1991 Callus induction and plandet regeneration of Hawaiian anthuriums HortScience (26): 919-921 Liu C M., Xu Z H.f 1992 An efficient procedure for micropropagation of Anthurium scherzerianum Schott (flamingo flower) Chinese J Bot (4): 4955 Martin K P., Joseph D., Madassery J., Philip V J., 2003 Direct shoot regeneration from lamina explants of two commercial cut flower cultivars of Anthrunium andreanum Hort In Vitro Cell Dev Biol Plant (39): 500-504 Matsumoto T K., Kuehnle A R, 1997 Pierik R L M., Steegmans H H M., van der Micropropagation of Anthurium In: Bajaj YPS, ed Meys J A J., 1976 Plantlet formation in callus Biotechnology in agriculture and forestry 40: high- tissues of Anthurium andraeanum Lind Sd Hort tech and micropropagation VI New York: Springer- (2): 193-198 Verlag; pp5-29 Teng W L, 1997 Regeneration of Anthurium 10.Murashige T., Skoog F., 1962 A revised adventitious shoots using liquid or raft culture Plant medium for rapid growth and bioassays for tobacco Cell Tiss Organ Cult (49): 153-156 tissue cultures Physiol Plant (15): 473-497 11.Bais, H.P., George, J and Ravishankar, G.A (1999) Influence of polyamines on growth of hairy root cultures of witl of chiocory (Chichorium intybus L cv Lucknow local) and formation of coumarins Journal of Plant Growth Regulation, 18(1): 33-37 12.Beyer, E.M (1976) A potent inhibitor of ethylene action in plants Plant Physiology, 58(3): 268-271 13.Douglas, G.C., Rutledge, C.B., Casey, A.D and Richardson, D.H.S (1989) Micropropagation of Floribunda, ground cover and miniature roses Plant Cell Tissue Organ Culture, 19: 55-64 14.Driver, J.A and Suttle, G.R (1987) Nursery handling of propagles Cell and Tissue Culture in Forestry, p 320-335 15.Jala, A (2014) Role of 2,4-D on callus induction and shoot formation to increase number of shoot in miniature rose in vitro American Transaction on Engineering and Applied Sciences, 3(3): 207-213 16.Kantamaht, K., Nonlapan, P., Kamnoon, K (2009) In vitro flowering from cultured nodal explants of rose (Rosa hybrida L.) Not Bot Hort Agrobot Cluj, 37(2): 261 - 263 17.Murashige T and Skoog F (1962) 18.Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures Physiol Plant, 1(3): 473-497 19.Lau, O and Yang, S (1976) Inhibition of ethylene production by cobaltous ion Plant Physiology, 58: 114-117 20.Naphaporn, N.U., Kantamaht, K and Kamnoon, K (2009) Micropropagation from cultured nodal explants of rose (Rosa hybrida L cv ‘Perfume Delight’) Songklanakarin Journal of Science and Technology, 31(6): 583-586 21.Sharma A., Kumar V., Parvatam, G and Ravishankar, G (2008) Induction of in vitro flowering in Capsicum frutescens under the influence of silver nitrate and cobalt chloride and pollen transformation Electronic Journal of Biotechnology, 11(2): 1-6 22.Vu, N.H., Anh, P.H and Nhut, D.T (2006) The role of sucrose and different cytokinins in the in vitro floral morphogenesis of rose (hybrid tea) cv ‘First Prize’ Plant Cell Tissue and Organ Culture, 87: 315-320 23.Wang, G.Y., Yuan, M.F and Hong, Y (2002) In vitro flower induction in Rose In vitro Cellular & Developmental Biology - Plant, 38(5): 513-518 24.Zhao, X.C., Qu, X., Mathewa, D.E and Schaller, G.E (2002) Effect of ethylene-pathway mutations upon expression of the ethylene receptor ETR1 from Arabidopsis Plant Physiology, 130(4): 1983-1991 III Nguồn khác http://tai-lieu.com/tai-lieu/de-tai-nghien-cuu-ve-cay-hoa-hong-7059/ http://tailieudientu.lrc.tnu.edu.vn/chi-tiet/nhan-giong-in-vitro-hoa-hong-monanthurium-andraeanum-47800.html http://www.vnua.edu.vn/tapchi/Upload/2472015-TC%20so4.201516ktcn.pdf ... vitamin cho thể Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn tiến hành thực đề tài: ? ?Nghiên cứu quy trình nhân nhanh hoa hồng cổ SaPa ( Rosaceae) phương pháp in vitro? ?? 1.3 Mục tiêu nghiên cứu đề tài Tìm hiểu nghiên. .. Kết đề tài góp phần bổ sung quy trình nuôi cấy in vitro nhân giống bảo tồn loài hoa hồng cổ SaPa loài hoa hồng khác Hồn thiện quy trình ni cấy in vitro nhân giống bảo tồn loài hoa hồng cổ SaPa. .. nghiên cứu quy trình nhân giống hoa hồng cổ SaPa phương pháp in vitro Khảo sát điều kiện sinh trưởng hoa hồng cổ SaPa điều kiện phịng thí nghiệm 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn 1.4.1 Ý nghĩa khoa