Tìm hiểu nghiên cứu quy trình nhân giống cây Nưa konjac bằng phương pháp in vitro. Khảo sát điều kiện sinh trưởng của cây Nưa konjac trong điều kiện phòng thí nghiệm. Cây Nưa konjac sinh sản chủ yếu bằng con đường sinh sản vô tính, thông qua các thân hành nên hiệu quả tái sinh rất thấp và thân hành thường chứa các mầm bệnh, điều này dẫn đến nhiều rủi ro trong trồng trọt. Phương pháp nhân giống này không làm cây sạch bệnh, năng suất không cao đồng thời nó còn tốn nhiều thời gian và công chăm sóc.
Trang 1TRƯỜNG ĐẠI HỌC PHƯƠNG ĐÔNG
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG
Hà Nội – 2017
Trang 2MỤC LỤC
PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Tính cấp thiết của đề tài 2
1.3 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 2
1.4 Ý nghĩa của đề tài 3
1.4.1 Ý nghĩa khoa học 3
1.4.2 Ý nghĩa trong thực tiễn 3
PHẦN 2 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 4
2 Cơ sở khoa học của đề tài 4
2.1 Giới thiệu chung về chi Nưa 4
2.1.1 Nguồn gốc và phân loại 4
2.1.2 Đặc điểm sinh học của cây Nưa konjac 4
2.1.3 Giá trị của cây Nưa konjac 5
2.2 Phương pháp nhân giống cây Nưa konjac 6
2.2.1 Phương pháp nhân giống truyền thống 6
2.2.2 Phương pháp nhân giống bằng công nghệ sinh học 6
2.3 Tình hình nghiên cứu chi Nưa trên thế giới và Việt Nam 7
2.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 7
2.3.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 10
2.4 Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân nhanh giống cây trồng 11
2.4.1 Cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 11
2.4.2 Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 13
2.4.2.1 Môi trường nuôi cấy 13
Trang 3PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20
3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 20
3.2 Hóa chất và thiết bị sử dụng 20
3.2.1 Hóa chất sử dụng 20
3.2.2 Thiết bị sử dụng 20
3.3 Địa điểm và thời gian tiến hành 21
3.4 Nội dung nghiên cứu 21
3.5 Phương pháp nghiên cứu và các chỉ tiêu theo dõi 21
3.5.1 Ảnh hưởng kết hợp của 2,4D + IBA đến quá trình tạo mô sẹo từ củ 21
3.5.2 Ảnh hưởng kết hợp của BA + NAA + 2,4D đến quá trình hình thành mô sẹo từ củ 22
3.5.3 Ảnh hưởng của tuổi củ đến quá trình tạo mô sẹo 22
3.5.4 Ảnh hưởng kết hợp của BA + NAA đến quá trình tái sinh chồi 23
3.5.5 Ảnh hưởng của kinitin đến quá trình tạo rễ cây hoàn chỉnh 23
3.5.6 Ảnh hưởng của IBA đến quá trình tạo rễ cây hoàn chỉnh 24
3.6 Phương pháp xử lý số liệu 24
PHẦN 4 DỰ KIẾN KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC 25
4.1 Kết quả nghiên cứu sự ảnh hưởng kết hợp của 2,4D + IBA đếnquá trình tạo mô sẹo từ củ 25
4.2 Kết quả nghiên cứu sự ảnh hưởng kết hợp của BA + NAA + 2,4D đến quá trình hình thành mô sẹo từ củ 25 4.3 Kết quả nghiên cứu sự ảnh hưởng của tuổi củ
Trang 4đến quá trình tạo mô sẹo 26
4.4 Kết quả nghiên cứu sự ảnh hưởng kết hợp của BA + NAA đến quá trình tái sinh chồi 26
4.5 Kết quả nghiên cứu sự ảnh hưởng của kinitin đến quá trình tạo rễ cây hoàn chỉnh 27
4.6 Kết quả nghiên cứu sự ảnh hưởng của IBA đến quá trình tạo rễ cây hoàn chỉnh 27
PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 29
5.1 Kết luận 29
5.2 Kiến nghị 29
TÀI LIỆU THAM KHẢO 30
I Tài liệu Tiếng Việt 30
II Tài liệu Tiếng Anh 31
III Nguồn khác 31
Trang 5PHẦN 1: MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Trong xã hội công nghiệp hóa hiện nay, mọi mặt cuộc sống của con ngườingày càng được cải thiện, đời sống được nâng cao hơn nhưng công nghiệp hóacũng làm nảy sinh nhiều bệnh tật mang tính xã hội như: mỡ máu, tiểu đường, béophì, Chính vì vậy, các nhà dược học, thực vật học luôn mong muốn tìm ra cácloài thực vật có thể dùng làm thuốc hay làm thức ăn có thể phòng và chữa trị đượcnhững bệnh này Nưa là một trong số các loại cây có thể đáp ứng những tiêu chíđó
Ở nước ta, Nưa mọc rải rác ở khắp ngoài tự nhiên, trên các vùng rừng núi,được người dân nhiều địa phương trồng trong vườn, bên cạnh đó nưa còn là nguồnthực phẩm giàu chất dinh dưỡng làm thức ăn cho người và gia súc, nưa phân bố rảirác ở khắp các tỉnh như: Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hoà Bình, Nghệ An, Hà Tĩnh,Quảng Trị, Thừa Thiên Huế
Củ Nưa có chứa nhiều tinh bột ăn ngon hơn sắn nên trước đây dân ta trồngnhiều để lấy củ làm lương thực Cây Nưa không chỉ có giá trị về mặt thực phẩm
mà còn có ý nghĩa trong việc chống xói mòn đất
Thực trạng hiện nay, diện tích rừng nước ta đang ngày càng bị thu hẹp, việckhai thác tài nguyên rừng bừa bãi, sự đa dạng sinh học bị phá vỡ, nhiều nguồn genthực vật có nguy cơ tuyệt chủng Cùng với thực tế là ngày nay đời sống con ngườingày càng nâng cao, nhiều người không còn nghĩ đến một loài cây có nhiều giá trị
to lớn như vậy
Hơn nữa hiện nay chưa có nhiều những nghiên cứu về cây Nưa, chính vì vậyviệc quan tâm đến cây Nưa là một việc làm cần thiết để có thể nhân giống và bảotồn giống cây Nưa
Trang 61.2 Tính cấp thiết của đề tài
Ở Việt Nam, chi Nưa có khoảng 25 loài, trong đó có 2 trong 3 loài được trồngphổ biến ở Trung Quốc để sản xuất nguyên liệu glucomannan Hiện nay, nghiêncứu trong lĩnh vực nhân giống và trồng trọt các loài Nưa ở Việt Nam vẫn chưađược quan tâm nhiều Trong khi đó, hàng năm Việt Nam vẫn phải nhập hàng trămngàn tấn bột Nưa để phục vụ cho công nghệ thực phẩm, nhiều sản phẩm thực phẩmchức năng như viên giảm béo
Cây Nưa konjac sinh sản chủ yếu bằng con đường sinh sản vô tính, thông quacác thân hành nên hiệu quả tái sinh rất thấp và thân hành thường chứa các mầmbệnh, điều này dẫn đến nhiều rủi ro trong trồng trọt Phương pháp nhân giống nàykhông làm cây sạch bệnh, năng suất không cao đồng thời nó còn tốn nhiều thờigian và công chăm sóc
Trước tình hình đó, việc tìm ra biện pháp nhân giống cây Nưa konjac sạchbệnh, có chất lượng tốt là cần thiết Và thế là một phương pháp nhân giống mớiđược áp dụng, đó là phương pháp nuôi cấy mô Phương pháp này làm cho cây Nưatăng thêm cả về số lượng lẫn chất lượng, tạo ra một số lượng trong thời gian ngắn
và cây sạch bệnh
Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn trên tôi tiến hành thực hiện đề tài:
“ Nghiên cứu quy trình nhân nhanh giống Nưa konjac (Amorphophallus konjac)
bằng phương pháp in vitro”.
1.3 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
Tìm hiểu nghiên cứu quy trình nhân giống cây Nưa konjac bằng phương
pháp in vitro.
Khảo sát điều kiện sinh trưởng của cây Nưa konjac trong điều kiện phòngthí nghiệm
Trang 71.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
1.4.1 Ý nghĩa khoa học
Kết quả đề tài góp phần bổ sung quy trình nuôi cấy in vitro đối với nhân
giống và bảo tồn loài Nưa konjac
Hoàn thiện quy trình nuôi cấy in vitro đối với nhân giống và bảo tồn loài
Trang 8PHẦN 2 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
2 Cơ sở khoa học của đề tài
2.1 Giới thiệu chung về chi Nưa
2.1.1 Nguồn gốc và phân loại
Cây Nưa konjac có tên khoa học Amorphophallus konjac, là một loài thực
vật có hoa thuộc họ Ráy Araceae, được K Koch mô tả lần đầu năm 1858 Nó làloài bản địa mọc tự nhiên vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới ẩm miền đông châu Á, từNhật Bản và Trung Quốc về phía nam tới Indonesia Konjac được biết đến ở NhậtBản từ thế kỷ thứ 6 như một loại dược phẩm
Phân loại khoa học:
Giới (Kingdom): Plantae
Bộ (Order): Alismatales
Họ (Family): Araceae
Chi (Genus): Amorphophallus
Loài (Species): A konjac
2.1.2 Đặc điểm sinh học của cây Nưa konjac
Nưa konjac có một số đặc điểm thực vật học sau:
Nưa konjac là cây thân thảo, có củ lớn hình cầu lõm, đường kính có thể lêntới 25cm Từ củ lớn còn hình thành nên những củ nhỏ hơn, được gọi là củ nhánh
Từ trục thân chia thành 3 nhánh (còn gọi là dọc hay chột) mang lá
Phiến lá xẻ thùy sâu hình lông chim, các thùy cuối hình quả quả trám thuôn,nhọn đầu; cuống lá thon dài, dài 40 – 80cm, nhẵn, màu lục nâu
Trang 9Cụm hoa có mo lớn, phần bao mo màu lục nhạt điểm các vết lục thẫm, ởphía mép màu hung tím, mặt trong màu tím nâu thẫm Trục hoa dài gấp đôi mo
Quả mọng có đường kính khoảng 3-5cm và chứa nhiều hạt
2.1.3 Giá trị của cây Nưa konjac
Cây Nưa có giá trị thực phẩm rất to lớn Cuống lá Nưa có thể dùng để nấucanh hoặc muối dưa ăn Củ, dọc và lá, bã bột Nưa là nguồn thức ăn rất tốt để chănnuôi gia súc Củ Nưa là phần có giá trị to lớn nhất Tuy nhiên, Nưa chủ yếu đượctrồng để lấy bột
Thành phần hóa học chính:
Mỗi 100 gram bột konjac chứa 1.64g protein, 0.004g chất béo, 57mgphotpho, 4.06mg sắt, 123mg kẽm, 0.2mg mangan, 0.25chromium, 0.08mg đồng và79.37mg Glucomannan
Trong củ Nưa có chứa glucomannan – một polysaccharide hòa tan trongnước Glucomannan là một chất phụ gia thực phẩm được sử dụng như một chấtchuyển đổi sữa hay chất làm đặc Trong lịch sử, glucomannan đã được sử dụngtrong thực phẩm truyền thống châu Á như mì, đậu phụ, và các sản phẩm khác.Ngoài ý nghĩ trong thực phẩm, glucomannan còn đóng vai trò quan trọng trongmột số loại dược phẩm Glucomannan là một chất xơ hòa tan, chính vì vậy nó được
sử dụng để điều trị táo bón Glucomannan cũng có tác dụng làm giảm colesterol,lipoprotein và chất béo trung tính, do đó được bổ sung vào thành phần của các loạithuốc chữa béo phì Chất này cũng được chứng minh là có tác dụng chống lão hóa,
hạ đường huyết Vì vậy, việc nghiên cứu nhân giống cây Nưa để thu glucomannan
có ý nghĩa rất to lớn
Trang 102.2 Phương pháp nhân giống cây Nưa konjac
2.2.1 Phương pháp nhân giống truyền thống
Ưu điểm: ít tốn thời gian
Nhược điểm: phương pháp này cho hệ số nhân thấp, cây dễ bị thoái hóa, rễcây yếu Phương pháp này không đảm bảo cây sạch bệnh vì bệnh có thể đượctruyền từ cây mẹ sang
2.2.2 Phương pháp nhân giống bằng công nghệ sinh học
Nuôi cấy mô (nhân giống in vitro)
Nhân giống in vitro là hình thức sử dụng chồi đỉnh, lá, hoa, cuống lá, đoạn
thân non nuôi dưỡng trong các điều kiện đặc biệt để hình thành một cơ thể mớihoàn chỉnh
Ưu điểm: Hệ số nhân giống cao, đồng đều, sạch bệnh, chủ động trong việcsản xuất cây con phục vụ cho công tác giống
Trang 11Nhược điểm: Cây con có kích thước nhỏ, xảy ra đột biến biến dị làm xuấthiện những cây không mong muốn, cần trang thiết bị đặc biệt (Võ Quốc Việt và cs,2010).
Ngoài ra, theo Hoàng Ngọc Thuận (2000) việc nuôi cấy in vitro sử dụng
nguồn hydrocacbon nhân tạo do đó mà khả năng tự tổng hợp chất hữu cơ kém,
đồng thời cây nuôi cấy in vitro được nuôi trong bình thủy tinh có độ ẩm bão hòa,
do vậy mà khi trồng cây ra ngoài điều kiện tự nhiên cây thường bị mất nước,không thích nghi được cây dễ bị héo và chết
2.3 Tình hình nghiên cứu chi Nưa trên thế giới và Việt Nam
2.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Hiện nay nhiều loài được nghiên cứu và triển khai trồng với diện tích lớn ởnhiều nước như Trung Quốc, Nhật Bản, New Zealand, Ấn Độ, Thái Lan,Indonesia,
Ở Trung Quốc, chỉ riêng tỉnh Vân Nam, hàng nghìn ha đất đồi núi được sửdụng để trồng Nưa, ngoài ra Nưa còn được trồng ở Nam Ninh, Quảng Đông,Quảng Tây, Trùng Khánh Ở Nhật Bản, chỉ 2 vùng Jinnejo và Uedama, ngay từnhững năm 70 của thế kỷ trước, hàng năm khoảng hơn 15 nghìn ha Nưa đượctrồng với sản lượng đạt tới hàng nghìn tấn Do tầm quan trọng của nguồn lợi từ củNưa, nên cây này đã được nhập trồng từ Nhật Bản vào New zealand từ hàng chụcnăm trước
Nưa là cây trồng có thể mang lại nguồn lợi kinh tế lớn, nên trong những nămqua đã có nhiều công trình nghiên cứu về đặc điểm sinh học cũng như kỹ thuậtcanh tác cây Nưa
Hiroshi Kurihama (1979) đã đưa ra các định hướng và kinh nghiệm trongtrồng trọt Nưa Konjac trên đất bằng và đất dốc tại 2 tỉnh Jinnejo và Uedama ở NhậtBản, cũng như các yếu tố về nhiệt độ, đất, sâu bệnh và thời vụ
Trang 12Dhua và cộng sự (1988) đã có nghiên cứu về ảnh hưởng của các chất hóahọc đến quá trình nảy mầm, phát triển và sản lượng của củ Nưa chuông
(Amorphophallus paeoniifolius).
Liu và cs (1998) khi nghiên cứu về sinh trưởng và phát triển của một số loàiNưa ở Trung Quốc đã chỉ ra các điều kiện sinh thái của Nưa Theo nhóm nghiêncứu, Nưa không phải là cây đòi hỏi nhiều nước, có khả năng chịu hạn tốt nhưngkhông chịu được ngập úng Về nhiệt độ, Nưa là cây ưa ấm, có khả năng chịu biếnthiên nhiệt độ từ 5 - 43°C, nhiệt độ tối thích là 20 – 25°C, sau khi nhiệt độ xuốngdưới 0°C và lên trên 48°C cây sẽ chết sau 5 ngày Nghiên cứu này cũng đưa ramột số mức nhiệt tối thích cho sự phát triển của củ và rễ, khả năng lai của một sốloài Nưa và thu được nhiều kết quả khả quan Cũng theo nghiên cứu cho biết NhậtBản và Trung Quốc là hai nước có lịch sử trồng và sử dụng bột Nưa như loại thựcphẩm truyền thống từ hàng nghìn năm trở về trước Dựa trên những nghiên cứurộng rãi về an toàn thực phẩm, Bộ Y tế Trung Quốc cho phép đưa bột Nưa vàotrong những thực phẩm quản lý thông thường từ năm 1998 Ở Mỹ người ta chấpnhận bột Nưa như thực phẩm bổ sung (1997), và cũng cho phép sử dụng bột Nưanhư nhân tố làm đặc, tạo màng, chất chuyển thể sữa và chất ổn định trong các thựcphẩm Ngày nay Nhật Bản, Trung Quốc và một số nước đã sử dụng bột Nưa làmnguyên liệu trong công nghiệp dược phẩm, sản xuất thực phẩm chức năng, hỗ trợnhiều bệnh như đái tháo đường, hạ cholesterol máu, điều trị táo bón, hỗ trợ giảmcân
Long Chi Lin (1998) đã có công trình nghiên cứu thực vật dân tộc học củacác loài Nưa, nghiên cứu này đã chỉ ra rằng người dân Trung Quốc đã sử dụng nưalàm thức ăn từ 3000 – 4000 năm trước, nhiều kiến thức về kỹ thuật trồng cây Nưatheo lối cổ truyền cũng được đề cập Theo nghiên cứu này, hạt của một số loài Nưakhó nảy mầm ở ngoài tự nhiên, tuy nhiên nó lại nảy mầm dễ dàng sau khi quađường tiêu hóa của một số loài chim Theo cách nảy mầm nhân tạo, quả Nưa chín
Trang 13sau khi rửa sạch vỏ và cơm quả, trộn lẫn với cát ẩm ở tỷ lệ 1:4 rồi cất vào chỗ tốihoặc phủ bằng lớp đất dày thì dễ dàng nảy mầm.
Theo Santosa và cs (2002) Nưa là cây lương thực quan trọng ở Java nhữngnăm 1940 – 1950, sau một thời gian ít được sử dụng, hiện nay Nưa đã trở thànhloài có triển vọng kinh tế lớn, sự có mặt của loài cây này tại các vườn nhà ở Javangày càng nhiều
Liu (2004) đã đề cập khá kỹ về nguồn gốc, phân bố của chi Nưa, phân loạihọc, hình thái học, chu trình sinh trưởng và phát triển, sinh thái, sự chuyển hóa củaglucomannan, trồng trọt, nhân giống và chế biến cũng như bảo quản sau thuhoạch của các loài Nưa Theo Liu trên thế giới đã biết khoảng 173 loài Nưa,trong đó có trên 20 loài được phát triển thương mại ở Trung Quốc, Nhật Bản,Malaysia, Ấn Độ và Indonesia, hàng năm thế giới sản xuất khoảng 30 nghìn tấnbột Nưa Sản lượng củ Nưa tuoi có thể đạt tới 30 – 35 tấn/ha nhưng chỉ khoảng 2,5tấn glucomannan được chiết xuất từ số lượng củ này
Douglas và cs (2005) đã có công trình nghiên cứu về kỹ thuật trồng Nưakonjac ở New Zealand và đã thu được nhiều kết quả về trọng lượng, chất lượng củNưa khi trồng dưới tán rừng và trồng trực tiếp dưới ánh sáng mặt trời
Theo Zhang và Liu (2006) Nưa phát triển theo mùa, chúng thường rụng lávào mùa đông hay mùa khô, thời gian ngủ sinh lý của Nưa kéo dài từ 60 – 80 ngày
và không thể có bất kỳ tác nhân nào có thể phá vỡ trạng thái ngủ để hình thànhchồi trong giai đoạn này Sau khi ngủ, cây bắt đầu nảy mầm, lá phát triển mạnh đểhình thành củ mới, lúc này củ mẹ hết chất dinh dưỡng và chết đi Trong tự nhiên,Nưa cần ít nhất 3 năm để phát triển đủ lớn và có thể ra hoa Do đó, Nưa được đánhgiá là cây sinh trưởng chậm cho năng suất thấp
Kết quả nghiên cứu của Nedunchezhiyan và cs (2006) đã giới thiệu khá cụthể về các bước nhân giống từ củ, làm đất, tỷ lệ phân bón, mật độ trồng, tưới nước,thu hoạch, cũng như bảo quản củ Nưa ở Ấn Độ
Trang 14Theo Melinda Chua và cs (2010), ở Trung Quốc, Nưa được trồng xen canhvới ngô cũng đạt năng suất khá cao.
Zhang và cs (2010) đã công bố kết quả nghiên cứu nhân giống so le giữa 2
loài Nưa là: A bulbifer và A muelleri nhằm tìm ra loài Nưa thích hợp cho vùng Nam Á Sau khi nghiên cứu và so sánh với Nưa konjac (A konjac), nhóm nghiên cứu đã kết luận loài A muelleri có khả năng thích ứng tốt với khí hậu Nam Á, cho
hàm lượng glucomannan cao (>70%) có thể phát triển trồng ở bắc Mianma và Lào.Nghiên cứu đã giải thích tại sao ở Nam Á người ta sử dụng củ mà không sử dụnghạt Nưa làm vật liệu nhân giống Kết quả nghiên cứu cho thấy điều kiện khí hậucủa khu vực rất thuận lợi cho sự phát triển của các loài cỏ dại, cây từ hạt thườngkhông đủ sức cạnh tranh Hơn nữa, cây có nguồn gốc từ hạt không thể cho củ lớntrong thời gian 1 năm trong điều kiện tự nhiên
Mặc dù đã có nhiều tác giả nghiên cứu về Nưa nhưng các tài liệu được công
bố chủ yếu là các tài liệu về phân loại học và hình thái học còn các tài liệu về sinhtrưởng, phát triển cũng như trồng trọt, nhân giống chủ yếu được nghiên cứu ở một
số loài như: A konjac, A bulbifer, A muelleri và A paeoniifolius Các loài Nưa
khác còn ít được biết đến
2.3.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam
Ở Việt Nam, chi Nưa có khoảng 25 loài phân bố từ Bắc vào Nam nhưng hầuhết tập trung ở các tỉnh miền núi, một số tỉnh duyên hải và hải đảo Một số loài đãđược các dân tộc miền núi sử dụng từ lâu đời không chỉ làm thực phẩm mà còn lànguồn dược liệu tự nhiên quý giá Người dân thường trồng Nưa lấy củ làm lươngthực, thân và cành lá dùng làm chăn nuôi, cuống lá Nưa dùng nấu canh hay muốidưa ăn Củ được dùng làm thuốc trong nhiều bài thuốc dân gian để chữa trị đờmtích trong phổi, trúng phong bất tỉnh, cấm khẩu, chứng đau đầu, đầy bụng, tứcngực, ăn uống không tiêu, sốt rét,
Trang 15Tài liệu về Nưa ở Việt Nam chủ yếu là các công trình về phân loại chi Nưa.Các loài Nưa đầu tiên ở Việt Nam được Gagnepain tổng hợp và mô tả trong bộsách Thực vật chí Đại cương Đông Dương (1942) với 5 loài Đó là Nưa chuông
(A paeoniifolius), Nưa rex (A rex), Nưa đứt đoạn (A interruptus), Nưa rivieri (A.
rivieri) và Nưa Bắc Bộ (A tonkinensis)
Phạm Hoàng Hộ (1993) đã thống kê và mô tả 7 loài, từ năm 1994 – 2000,nhiều loài Nưa mới đã được một số nhà thực vật mô tả từ các mẫu thu được ở ViệtNam Dựa trên các mô tả đó Phạm Hoàng Hộ (2000) đã thống kê được 18 loài Nưa
ở Việt Nam
Cùng với các nhà thực vật nước ngoài, Nguyễn Văn Dư (2001 & 2004),cũng mô tả nhiều loài Nưa mới cho khoa học và một số loài Nưa bổ sung cho hệthực vật Việt Nam, làm cho số loài của chi này lên tới 25 loài
2.4 Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân nhanh giống cây trồng
2.4.1 Cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật
- Tính toàn năng của tế bào
Năm 1902, Haberlandt đã đưa ra giả thuyết về tính toàn năng của tế bào thực
vật Ông cho rằng tất cả các tế bào đều có tính toàn năng (totipotency), nghĩa là
mỗi tế bào đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cơ thể và có khả năngphát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi
Đến năm 1922, Kotte và Robbins đã nuôi được đỉnh sinh trưởng từ đầu rễcủa một cây hòa thảo trong 12 ngày Như vậy, lần đầu tiên tính toàn năng của tếbào được chứng minh bằng thực nghiệm Từ đó đến nay, rất nhiều công trìnhnghiên cứu đã tạo được cây hoàn chỉnh từ một tế bào riêng lẻ, một khối mô haymột phần của cơ quan Điều đó khẳng định tính toàn năng của tế bào thực vật là cơ
sở khoa học của nuôi cấy mô, tế bào thực vật
Trang 16- Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào
Biệt hóa (phân hóa) là sự biến đổi của tế bào từ trạng thái tế bào phôi chođến khi thể hiện một chức năng nào đó
Các tế bào dùng trong môi trường nuôi cấy đều đã biệt hóa về cấu trúc vàchức năng Trong những điều kiện thích hợp, có thể làm cho những tế bào này trởlại trạng thái của tế bào đầu tiên đã sinh ra chúng – tế bào phôi và quá trình đó gọi
Sự phân hoá và phản phân hoá tế bào là một quá trình hoạt hoá, ức chế hoạtđộng của gene Trong một giai đoạn phát triển nhất định của cây, một gene nào đóđang ở trạng thái ức chế không hoạt động được hoạt hoá để cho một tính trạngmới Ngược lại một số gene lại bị ức chế đình chỉ hoạt động Quá trình hoạt hoá,
ức chế diễn ra theo một chương trình đã được lập sẵn trong cấu trúc hệ gene của
tế bào, giúp cho sự sinh trưởng, phát triển của cơ thể thực vật được hài hoà Khi
Trang 17tách riêng từng tế bào hoặc làm giảm kích thước khối mô sẽ tạo điều kiện choviệc hoạt hoá các gene của tế bào.
Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật là kỹ thuật điều khiển sự phát sinhhình thái của tế bào thực vật một cách có định hướng dựa vào sự phân hoá vàphản phân hoá của tế bào thực vật để điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào,người ta bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất kích thích sinh trưởngthực vật chính là auxin và cytokinin Tỷ lệ hàm lượng của hai nhóm chất kíchthích sinh trưởng này của mô nuôi cấy khác nhau tuỳ từng mục đích nghiên cứu(phát sinh chồi, rễ hoặc mô sẹo)
2.4.2 Điều kiện và môi trường nuôi cấy tế bào thực vật
2.4.2.1 Môi trường nuôi cấy
Nghiên cứu về môi trường nuôi cấy giữ một vị trí quan trọng trong lịch sửphát triển nuôi cấy mô, tế bào thực vật Vào thời kì Haberlandt tiến hành các thínghiệm nuôi cấy tế bào biệt lập, hiểu biết về nhu cầu dinh dưỡng khoáng còn hạnchế, đặc biệt là vai trò của các chất kích thích sinh trưởnghầu như chưa đượckhám phá Chính vì vậy mà Haberlandt đã không thành công
Đến nay đã có hàng trăm loại môi trường dinh dưỡng đã được xây dựng vàthử nghiệm có kết quả Hầu hết các loại môi trường đều bao gồm các thành phầnchính sau:
- Các loại muối khoáng
Các nguyên tố khoáng dùng trong môi trường dinh dưỡng nuôi cấy mô tếbào thực vật chia thành hai nhóm theo hàm lượng sử dụng là: nhóm đa lượng vànhóm vi lượng
+ Các nguyên tố khoáng đa lượng
Là các nguyên tố khoáng được sử dụng ở nồng độ trên 30ppm, bao gồmcác nguyên tố sau: N, P, K, S, Mg và Ca Các nguyên tố này có chức năng tham