HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO HOA ĐỒNG TIỀN LÙN (Gerbera Jamesonii Bolus.)

Hoa đồng tiền có tên khoa học là “ Genbera Jamesonii Bolus ” có nguồn gốc từ Nam phi. Hoa đồng tiền là một loài hoa đẹp với hàng trăm giống hoa khác nhau đa dạng về màu sắc: đỏ, trắng, hồng, vàng, cam… Đến nay nó đã được trồng nhiều nơi trên thế giới điển hình là: Hà Lan, Mỹ, Đức, Nhật Bản, Trung Quốc.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC PHƯƠNG ĐÔNG

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG



-KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI: “HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO

HOA ĐỒNG TIỀN LÙN

(Gerbera Jamesonii Bolus.)”

Hà Nội – 2017

TRƯỜNG ĐẠI HỌC PHƯƠNG ĐÔNG

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG



-KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI: “HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO

HOA ĐỒNG TIỀN LÙN

(Gerbera Jamesonii Bolus.)”

Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Minh Huyền

Giáo viên hướng dẫn : TS Lê Đức Thảo

Hà Nội – 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả, hình ảnh đưa ra hoàn toàn trung thực, chưa từng được sử dụng và công bố trong các công trình nghiên cứu khoa học nào trước đây

Tôi xin cam đoan các thông tin, tài liệu tham khảo trong luận văn này đã được ghi rõ nguồn gốc

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan của mình trước hội đồng và nhà trường

Hà Nội, ngày 28 tháng 05 năm 2017

Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Minh Huyền

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS Lê Đức Thảo, ThS Nguyễn Viết Dũng bộ môn Đột biến và ưu thế lai Viện di truyền nông nghiệp đã tận tình hướng dẫn, dạy dỗ tôi trong suốt quá trình học tập cũng như nghiên cứu.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể các phòng, ban của Khoa Công nghệ sinh học cũng như của Viện di truyền nông nghiệp đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập, rèn luyện cũng như thực tập tốt nghiệp

Và cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình cùng những người thân, bạn bè đã luôn ở bên động viên và tạo động lực cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 28 tháng 05 năm 2017

Sinh viên

Nguyễn Thị Minh Huyền

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

TÓM TẮT KHÓA LUẬN xi

PHẦN I 1

1.2 Mục đích và yêu cầu 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu của đề tài 2

PHẦN II 3

2.1 Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm thực vật học của hoa đồng tiền 3

2.1.1 Nguồn gốc, vị trí, phân loại 3

Hình 2.1: Đồng tiền lùn (Gerbera Jamesonii Bolus) 3

2.1.2 Đặc điểm thực vật học của hoa đồng tiền 4

2.4 Kĩ thuật trồng và chăm sóc hoa đồng tiền 10

2.4.1 Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh 10

2.4.2 Kĩ thuật trồng, chăm sóc 11

2.5.1 Tình hình sản xuất hoa đồng tiền trên thế giới 13

2.5.2 Tình hình sản xuất ở Việt Nam 14

2.6 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng nuôi cấy mô nhân giống hoa đồng tiền 15

2.6.1 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng nuôi cấy mô nhân giống hoa đồng tiền trên thế giới 15

2.6.2 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng nuôi cấy mô nhân giống hoa đồng tiền trong nước 18

Từ những nghiên cứu trên chúng tôi thấy rằng, cây hoa đồng tiền nhân nhanh tốt nhất trong môi trường MS có bổ sung BA, α – NAA cho hiệu quả ra rễ tốt nhất, môi trường ra rễ thích hợp là MS 21

Tóm lại, việc nhân nhanh cây hoa đồng tiền không cần các kĩ thuật đặc biệt so với kĩ thuật nhân nhanh các cây trồng khác, sử dụng các chất điều tiết sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin và auxin phổ biến hiện nay như BA, Kinetin, NAA để điều khiển sự phát sinh chồi, tạo rễ cây hoàn chỉnh 21

PHẦN III 22

VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

3.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 22

3.2 Nội dung nghiên cứu và phương pháp nghiên cứu 22

3.2.1 Nội dung 1: Giai đoạn nuôi cấy khởi động 22

3.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 27

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

4.1 Kết quả giai đoạn nuôi cấy khởi động 28

Đây là giai đoạn đưa mẫu từ môi trường bên ngoài vào nuôi cấy trong môi trường vô trùng, là giai đoạn quan trọng quyết định sự thành công của nuôi cây mô Mục đích của giai đoạn này nhằm tạo ra lượng lớn mẫu vô trùng và có khả năng sinh trưởng, phát triển tốt 28

Vật liệu được sử dụng để vào mẫu là hạt giống hoa đồng tiền lùn được đóng gói bảo quản Thời gian khử trùng thích hợp là 4 phút Hạt nảy mầm sau 1 tuần nuôi cấy Tỉ lệ hạt nảy mầm là 98%, tỉ lệ nhiễm 0% Chồi đồng tiền lùn sinh trưởng và phát triển khỏe mạnh Nuôi chồi trên môi trường MS trong 4 tuần Kết quả cho thấy hạt giống đồng tiền lùn là vật liệu phù hợp để tạo vật liệu khởi đầu 28

28

Hình 4.1 Chồi đồng tiền nảy mầm từ hạt sau 4 tuần cấy trên môi trường MS 28

4.2 Kết quả giai đoạn nhân nhanh 29

4.2.1 Kết quả sự ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro 29

4.2.2 Kết quả sự ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro 32

4.2.3 Kết quả sự ảnh hưởng phối hợp của BA và nước dừa tới sự nhân nhanh của chồi hoa đồng tiền 36

4.2.4 Kết quả sự ảnh hưởng phối hợp của BA và Kinetin tới sự nhân nhanh của chồi hoa đồng tiền 38

4.2.5 Kết quả ảnh hưởng phối hợp của Kinetin và α – NAA tới sự nhân nhanh của chồi hoa đồng tiền 41

4.3 Kết quả giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh 44

4.3.3 Kết quả ảnh hưởng của than hoạt tính đến sự tạo rễ của chồi in vitro 49

4.4 Giai đoạn vườn ươm 53

Bảng 4.9 Ảnh hưởng của loại giá thể đến khả năng sinh trưởng của cây con sau nuôi cấy mô 53

Theo bảng 4.9 cho thấy: Gía thể trấu hun (công thức 2) có khả năng thoát nước tốt , giữ nước kém và có thành phần Kali kiềm tính cao không thích hợp với hoa đồng tiền con Tỷ lệ sống sau 30 ngày đạt thấp nhất (23,33%) 53

Giá thể cát mặc dù trong những ngày đầu tiên cây phát triển tương đối tốt do cát có khả năng thoát nước tốt xong cũng giữ nước kém và dễ bị rửa trôi các chất dinh dưỡng nên cây con chết nhiều sau 30 ngày, đồng thời cây mảnh và yếu 53

Giá thể một đất một cát cho tỷ lệ sống đạt 46,67% Cây trong 20 ngày đầu sinh trưởng yếu, sau đó thì có hiện tượng sinh trưởng trở lại tuy không mạnh 53 Giá thể ở công thức 4 đất +cát +trấu hun (1:1:1 ) có tỷ lệ sống cao nhất đạt mức 86,67% Cây xuất hiện làm mới và tăng trưởng về chiều cao tốt Giá thể có khả năng giữ và thoát nước tốt, sau 30 ngày cây trồng

trên giá thể phát triển khỏe mạnh, cứng cáp, bản lá mở rộng, màu xanh thẫm Như vậy giá thể thích hợp

nhất cho cây đồng tiền trong giai đoạn ngoài vườn ươm là giá thể gồm đất + cát + trấu hun (1:1:1) 53

Nguyễn Văn Hồng (2009) đã khảo sát sự ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây con sau nuôi cấy mô Kết quả nghiên cứu cho thấy giá thể đất + cát + trấu hun + vi sinh Sông Gianh (1:1:1:1/4) cho tỉ lệ sống cao nhất đạt 98,33% Kết quả nghiên cứu của chúng tôi sử dụng giá thể đất +cát + trấu hun (1:1:1) cho tỉ lệ sống cao nhất đạt 86,67 % Kết quả này thấp hơn nghiên cứu của Nguyễn Văn Hồng Tuy nhiên so sánh kết quả này với kết quả của công thức đất + cát+ trấu hun (1:1:1) trong nghiên cứu của Nguyễn Văn Hồng có tỉ lệ cây con sống sau 4 tuần nuôi cấy chỉ đạt 76,11% thì kết quả của chúng tôi có tỉ lệ sống cao hơn 54

.55

Giá thể: Cát Giá thể: Trấu hun 55

.55

Giá thể: Đất + Cát (1:1) Giá thể:Đất +Cát+Trấu hun (1:1:1) 55

Hình 4.11 Hoa đồng tiền nuôi cấy mô sinh trưởng trong giá thể ngoài vườn ươm 55

PHẦN V 56

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56

5.1 Kết luận 56

5.2 Kiến nghị 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

DANH MỤC BẢNG

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro (sau 4

tuần nuôi cấy) Error: Reference source not found

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro (sau

4 tuần nuôi cấy) Error: Reference source not foundBảng 4.3 Ảnh hưởng phối hợp của BA và nước dừa tới sự nhân nhanh của

chồi hoa đồng tiền (sau 4 tuần nuôi cấy) Error: Reference source notfound

Bảng 4.4 Ảnh hưởng phối hợp của BA và Kinetin tới sự nhân nhanh của chồi

hoa đồng tiền (sau 4 tuần nuôi cấy) Error: Reference source notfound

Bảng 4.5 Ảnh hưởng phối hợp của Kinetin α – NAA tới sự nhân nhanh của

chồi hoa đồng tiền (sau 4 tuần nuôi cấy) Error: Reference source notfound

Bảng 4.6 Ảnh hưởng của α – NAA đến sự tạo rễ của chồi in vitro sau 4 tuần nuôi

cấy Error: Reference source not found

Bảng 4.7 Ảnh hưởng của IBA đến sự tạo rễ của chồi in vitro sau 4 tuần nuôi

cấy Error: Reference source not found

Bảng 4.8 Ảnh hưởng của than hoạt tính sự tạo rễ của chồi in vitro sau 4 tuần nuôi

cấy Error: Reference source not foundBảng 4.9 Ảnh hưởng của loại giá thể đến khả năng sinh trưởng của cây con

sau nuôi cấy mô Error: Reference source not found

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Đồng tiền lùn (Gerbera Jamesonii Bolus) Error: Reference source

not foundHình 3.1: Bao bì đồng tiền lùn nhiều màu .Error: Reference source not foundHình 4.1 Chồi đồng tiền nảy mầm từ hạt sau 4 tuần cấy trên môi trường MS

Error: Reference source not foundHình 4.2: Chồi hoa đồng tiền in vitro trên môi trường có bổ sung BA sau 4

tuần nuôi cấy 27Hình 4.3: Chồi hoa đồng tiền nhân nhanh trong môi trường có bổ sung

Kinetin sau 4 tuần nuôi cấy Error: Reference source not foundHình 4.4: Chồi đồng tiền trong môi trường có bổ sung BA và nước dừa sau 4

tuần nuôi cấy Error: Reference source not foundHình 4.5: Chồi nhân nhanh trong môi trường bổ sung BA và Kinetin Error:

Reference source not foundHình 4.6: Hình ảnh chồi nhân nhanh trong môi trường bổ sung Kinetin + α-

NAA Error: Reference source not foundHình 4.7: Rễ của chồi in vitro trong môi trường có bổ sung α – NAA sau 4

tuần nuôi cấy Error: Reference source not foundHình 4.8: Rễ của chồi in vitro trong môi trường có bổ sung IBA sau 4 tuần nuôi

cấy Error: Reference source not foundHình 4.9: Rễ của chồi in vitro trong môi trường có bổ sung than hoạt tính sau

4 tuần nuôi cấy Error: Reference source not foundHình 4.10: Rễ của chồi đồng tiền sau 4 tuần nuôi cấy trên môi có bổ sung các

chất khác nhau Error: Reference source not foundHình 4.11: Hoa đồng tiền nuôi cấy mô sinh trưởng trong giá thể ngoài vườn ươm

Error: Reference source not found

Hình 5.1: Sơ đồ quy trình nhân nhanh hoa đồng tiền lùn Error: Reference

source not found

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Viết tắt Diễn giải

BA : Benzyl adenine

α – NAA : Axit α – naphtyl acetic

IAA : Indolaxetic acid

MS : Môi trường Murashige and SkoogCTTN : Công thức thí nghiệm

TÓM TẮT KHÓA LUẬN

Nghiên cứu tiến hành nhằm xác định được môi trường thích hợp cho nhân giống

in vitro cây hoa đồng tiền lùn (Gerbera Jamesonii Bolus.) Kết quả cho thấy,

môi trường tạo vật liệu khởi đầu thích hợp nhất là MS + 30 g/l saccarose + 6,8 g/l agar, pH = 5,8 Môi trường nhân nhanh tối ưu là MS + 30 g/l saccarose + 6,8 g/l agar + 0,5 mg/l BA, pH = 5,8 Bổ sung vào môi trường nhân nhanh 0,5 mg/l Kinetin sẽ cho hệ số nhân chồi cao, cải thiện chất lượng chồi Môi trường ra rễ tốt nhất là MS + 30 g/l saccarose + 6,8 g/l agar + 0,1 mg/l α - NAA, pH = 5,8 Gía thể thích hợp để trồng cây con ngoài vườn ươm là 1 đất + 1 cát + 1 trấu hun

PHẦN I

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Hoa đồng tiền có tên khoa học là “ Genbera Jamesonii Bolus ” có nguồn

gốc từ Nam phi Hoa đồng tiền là một loài hoa đẹp với hàng trăm giống hoa khác nhau đa dạng về màu sắc: đỏ, trắng, hồng, vàng, cam… Đến nay nó đã được trồng nhiều nơi trên thế giới điển hình là: Hà Lan, Mỹ, Đức, Nhật Bản, Trung Quốc

Hoa đồng tiền mang ý nghĩa về vẻ đẹp và sự diệu kì Nó vừa mang ý nghĩa về sự phát đạt, tiền tài vừa mang đến sự tươi sáng và vui vẻ nên được người tiêu dùng ưa chuộng Đặc biệt là hoa đồng tiền lùn nổi bật với kiểu dáng nhỏ bé và nhiều màu sắc khác nhau nên được sử dụng để chơi trong chậu trong thời gian dài, để trang trí nhiều khu vực khác nhau, bày trong nhà, văn phòng, cửa hàng …Với nhu cầu tăng cao khi được nhiều người quan tâm, cây đồng tiền lùn đang rất được quan tâm mua bán Tuy nhiên giá thành của một hạt khá đắt (khoảng 8000 đồng/1 hạt) và phải nhập nội do không sản xuất được hạt giống

Hiện nay, trên thế giới cũng như Việt Nam phương pháp nuôi cấy mô xuất hiện và phát triển một cách mạnh mẽ Kĩ thuật này giúp chúng ta thúc đẩy khả năng sản xuất, tạo ra nhiều giống cây thương mại Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã trở thành một phương pháp nhân giống được áp dụng rộng rãi cho cây trồng với khả năng nhân giống và hệ số nhân cao, cung cấp số lượng cây giống lớn và giá thành hợp lý Gía thành của thành của một cây con sau nuôi cấy mô khoảng 2500 đồng/cây Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào chính là một trong những biện pháp tốt để giảm giá thành và phát triển rộng rãi hoa đồng tiền lùn

Đứng trước yêu cầu của thực tế sản xuất, các nhà khoa học và các viện nghiên cứu đã thực hiện nhiều đề tài để xây dựng quy trình nhân nhanh hoa đồng tiền lùn Tuy nhiên các quy trình nghiên cứu trước đây chưa thực sự tối ưu

cho dòng đồng tiền lùn Để góp phần vào hoàn thiện quy trình kĩ thuật thâm canh nâng cao năng suất chất lượng và hiệu quả sản xuất hoa đồng tiền lùn

chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro hoa đồng tiền lùn.”

1.2 Mục đích và yêu cầu

1.2.1 Mục đích

Xây dựng được quy trình tối ưu nhân giống hoa đồng tiền lùn bằng phương pháp nuôi cấy mô

1.2.2 Yêu cầu của đề tài

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh của chồi hoa đồng tiền

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng tới khả năng ra rễ của chồi hoa đồng tiền

- Xác định loại giá thể phù hợp cho sinh trưởng và phát triển của hoa đồng tiền trong giai đoạn vườn ươm

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm thực vật học của hoa đồng tiền

2.1.1 Nguồn gốc, vị trí, phân loại

Cây hoa đồng tiền có tên khoa học là “ Gerbera jameanii Bolexaclam ”,

có nguồn gốc từ Nam Phi Năm 1697, Relomen phát hiện thấy ở vùng phía Nam Châu Phi (Delansia) và ông đã đưa về vườn thực vật nước Anh Iwin Lych là người đầu tiên tiến hành lai tạo các giống đồng tiền với nhau Sau đó người Pháp và người Hà Lan cũng tiến hành lai tạo và dần dần hai nước này cũng trở thành trung tâm tạo giống cho đồng tiền thế giới (Đặng Văn Đông và cs, 2003)

Hình 2.1: Đồng tiền lùn (Gerbera Jamesonii Bolus)

Theo hệ thống học thực vật mới nhất, cây hoa đồng tiền thuộc:

Năm 1889, đồng tiền được Hoorker miêu tả lần đầu tiên trong tạp chí

tư vấn Curtis dưới tên gọi Cúc Transrace hay Cúc barbetan

Theo Hà Tiểu Đệ và Cs (2000), cây hoa đồng tiền là cây thân thảo,

rễ chùm, cao 50 - 60cm Thân có lông, lá đứng, hình dạng lá thay đổi theo sự sinh trưởng từ dạng trứng đến dạng trứng dài, lá dài từ 15 - 25cm, rộng 5 - 8cm hình xẻ thùy rộng và sâu, mặt dưới lá có lớp lông nhung

Chi đồng tiền Gerbera có khoảng 40 loài thuộc loại hoa lưu niên ra hoa quanh năm Dựa vào hình thái hoa người ta chia thành 3 nhóm: hoa kép, hoa đơn và hoa đơn nhị kép Hoa của đồng tiền đơn chỉ có một hoặc hai tầng cánh, xếp xen kẽ nhau tạo vòng tròn, hoa mỏng và yếu hơn hoa kép, màu sắc hoa ít hơn, điển hình là trắng, đỏ, tím, hồng Đồng tiền kép có cánh hoa to gồm hai tầng, bông to, đường kính có thể đạt tới 12 - 15 cm, cánh hoa tụ lại thành bông nằm ở đầu trục chính, cuống dài 40 – 60 cm Màu sắc đa dạng như trắng, đỏ, vàng, hồng, gạch cua Hoa đơn nhị kép lại có đặc điểm là bên ngoài cùng cánh đơn, bên trong cánh kép dày đặc, thường màu trắng trong lớp cánh kép màu cánh sen Với sự đa dạng về màu sắc, hình thái đó, đồng tiền đã đóng góp rất lớn trong nghệ thuật trang trí và làm đẹp Vì vậy, đồng tiền rất được ưa chuộng và là đối tượng lý tưởng của nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.1.2 Đặc điểm thực vật học của hoa đồng tiền

Cây đồng tiền thuộc loại cây thân thảo họ cúc với các đặc điểm như sau:

2.1.2.1 Thân, lá

Đồng tiền là cây thân ngầm, không phân cành mà chỉ đẻ nhánh, lá và hoa phát triển từ thân Lá mọc chếch so với mặt đất một góc 15 – 450 Lá có hình lông chim, xẻ thùy nông hoặc sâu, mặt lưng lá có lớp lông nhung

2.1.2.2 Rễ

Rễ cây đồng tiền thuộc loại rễ chùm, phát triển khỏe, rễ hình ống ăn ngang và nổi phía trên mặt luống Chúng thường vươn dài tương ứng với diện tích lá tỏa ra

2.1.2.3 Hoa

Đồng tiền do hai loại hoa nhỏ hình lưỡi và hình ống tạo thành, là loại hoa

tự đơn hình đầu Hoa hình lưỡi tương đối lớn mọc ở phía ngoài xếp thành một vòng hoặc vài vòng nhỏ Trong quá trình hoa nở, hoa hình lưỡi nở trước, hoa hình ống nở theo thứ tự từ ngoài vào trong, theo từng vòng một

2.1.2.4 Quả

Quả đồng tiền thuộc dạng quả bế có lông, không có nội nhũ, hạt nhỏ, một gam hạt có khoảng 280 – 300 hạt (Đào Thanh Vân và cs, 2007)

2.2 Nhân giống hoa đồng tiền

Hoa đồng tiền có thể nhân giống bằng nhiều phương pháp như: nhân giống bằng hạt, tách cây, nuôi cấy mô Nuôi cấy mô trong môi trường nhân tạo được dung 1 cách thông dụng nhất, phương pháp này cho số lượng cây lớn, sạch bệnh, cây trồng từ nuôi cấy mô sẽ sinh trưởng phát triển tốt, sản lượng cao, chất lượng hoa tốt Hệ số nhân giống bằng phương pháp này rất cao, từ một bộ phận nhỏ của cây sau một thời gian ngắn có thể cho ra hàng vạn cây giống đáp ứng nhu cầu sản xuất Do đó, đây là phương pháp nhân giống chủ yếu đối với cây hoa đồng tiền hiện nay

2.2.1 Nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào

Giai đoạn 1: Tạo nguồn vật liệu khởi đầu

Việc tạo nguồn vật liệu ban đầu tốt sẽ là bước quyết định tới sự thành công của các quá trình tiếp theo Vì vậy, để có nguồn mẫu cho quá trình nuôi cấy mô, cần phải lựa chọn các cá thể sinh trưởng phát triển tết từ những cây

mẹ đã được lựa chọn Để hạn chế tỷ lệ nhiễm bệnh khi đưa vào nuôi cấy, ta đánh chúng lên rồi trồng trên nền giá thể trấu hun, sau khi cây đã ổn định trở lại (2 – 3 tuần) khi tiến hành lấy mẫu vào nuôi cấy Nguồn mẫu đưa vào nuôi có thể là thân, đỉnh, ngọn, cuống hoa, đế hoa, cánh hoa, lá non hoặc cuống lá non Mẫu được lấy vào những ngày nắng ráo không có mưa

Giai đoạn 2: Khử trùng nuôi cấy mô

Đỉnh sinh trưởng của Đồng Tiền ít, khi bóc tách lại dễ bị nhiễm bẩn nên thường dùng đế hoa làm nguyên liệu nuôi cấy mô Cắt lấy nụ có đường kính khoảng l cm, lấy bông thấm nước muối rửa sạch, đưa vào tủ nuôi cấy mô và sử dụng các loại hóa chất khử trùng và thời gian khử trùng thích hợp đối với từng loại giống khác nhau.

Giai đoạn 3: Tái sinh chồi

Mục đích của giai đoạn này là tái sinh một cách định hướng của mô nuôi cấy Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ các hợp chất auxin/cytokinin ngoại sinh được đưa vào môi trường nuôi cấy

Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh

Để tạo cây hoàn chỉnh cần cấy chuyển các chồi đồng tiền đơn lẻ hoặc các đoạn cắt vào trong môi trường tạo rễ, đó là than hoạt tính (0.3 – 0.5g/l) và α-NAA ở nồng độ thấp 0.1 – 0.5 ppm Tuy nhiên, cũng có những giống đồng tiền khó hình thành rễ nên cần bổ sung thêm chất điều tiết sinh trưởng thực vật hay phụ gia như IAA 1ppm Thường sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường tạo

rễ, mỗi chồi đồng tiền sẽ có từ 4 – 6 rễ và chiều dài trung bình rễ từ 2 – 3cm Lúc này cây đồng tiền đạt tiêu chuẩn đưa ra vườn ươm

Giai đoạn 5: Đưa cây ra vườn ươm

Đây là giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh (có đủ rễ, thân, hoặc lá) từ ống nghiệm ra đất Ở giai đoạn này cần phải có giá thể và chế độ chăm sóc phù hợp Chuyển cây con đã ra rễ, trồng trên các giá thể thích hợp và dùng lưới phản quang che nắng, che mưa Điều chỉnh sao cho độ ẩm đất đạt 76 – 80%, độ ẩm không khí 82 – 85% Ngoài ra, phải bổ sung dinh dưỡng khoáng cho cây bằng cách phun dung dịch đạm:lân:kali (N:P:K) theo tỷ lệ 1:1:1 với nồng độ 1 - 2 g/1 cho cây Khi cây đã bám rễ trên giá thể, tiến hành phun phân bón Thiên Nông nồng độ 5g/l, 3 ngày phun 1 lần Sau 2 – 3 tuần có thể trồng ra ruộng sản xuất

Khi trồng trên ruộng sản xuất, thời gian đầu cây nuôi cấy mô sinh trưởng

chậm hơn so với giống đồng tiền tách thân Nhưng sau trồng 50 – 60 ngày tốc

độ sinh trưởng của cây in vitro (nuôi cấy mô) tăng vọt Chu kỳ sinh trưởng kéo dài hơn và chất lượng hoa tốt hơn (Đào Thanh Vân và cs, 2007)

 Ưu điểm của phương pháp nhân giống vô tính in vitro:

- Đưa ra sản phẩm nhanh: kĩ thuật nhân giống vô tính cho hệ số nhân giống cao, sản phẩm cây giống đồng nhất

- Tính khả thi rộng

- Có tiềm năng công nghiệp hóa cao: nuôi cấy trong điều kiện chủ động hoàn toàn về môi trường dinh dưỡng, chế độ chiếu sáng và nhiệt độ là tiền đề hoàn toàn thoát khỏi sự lệ thuộc mùa vụ vẫn xảy ra trong sản xuất nông nghiệp

và có thể công nghiệp hóa công việc sản xuất giống trong một dây chuyền sản xuất liên tục

- Nâng cao chất lượng sản phẩm: cải tiến kiểu gen của cây có thể được điều chỉnh bằng cách sử dụng các chất điều tiết sinh trưởng, các kĩ thuật như

chuyển nạp gen trong điều kiện nuôi cấy in vitro Bằng kĩ thuật này có thể chủ

động thay đổi kiểu gen thực vật như mong muốn dễ dàng hơn so với xử lý bằng các chất biến dị vào cây trồng trên đồng ruộng hay trong nhà lưới, nhà kính

- Khả năng tiếp thị tốt: dạng sản phẩm linh hoạt, lợi thế vận chuyển, sản xuất quanh năm làm tăng khả năng tiếp thị và kinh doanh của sản phẩm

 Nhược điểm của phương pháp nhân giống vô tính:

Bên cạnh những ưu điểm trên thì cũng có những nhược điểm mà công nghệ nuôi cấy mô tế bào gặp phải như: đòi hỏi trình độ kĩ thuật cao, kinh phí đầu tư bước đầu cao, thực hiện khó khăn đối với một số loại cây trồng, sản phẩm

bị biến đổi kiểu hình

2.2.2 Nhân giống bằng hạt

Các giống đồng tiền trồng trong chậu chủ yếu được nhân bằng hạt Đồng tiền là loài khó tự thụ phấn Vì vậy muốn lấy hạt nhất thiết phải thụ phấn bổ khuyết bằng hạt Đồng tiền có sức sống rất ngắn (2-3 tháng) nên thường gieo ngay sau khi thu hái Đất gieo hạt cần phối trộn đất mùn + than bùn + cát sông

(2:1:1) Hạt không cần lấp kín hoàn toàn, chỉ rắc 1 lớp đất mịn mỏng, sau đó đậy lại giữ ẩm Hạt đồng tiền ưa ánh sáng nên sau khi gieo hạt phải đưa ra ánh sáng Thời gian gieo thích hợp gieo trong nhà vườn vào tháng 1 đến tháng 2, gieo ngoài trời thì vào tháng 3, sau đó đến vụ trồng vào chậu, đặt trong nhà lưới (Đào Thanh Vân và cs, 2007).

 Ưu điểm:

- Kĩ thuật đơn giản

- Sinh trưởng khỏe, bộ rễ ăn sâu, tuổi thọ cao, cây thích ứng rộng với điều kiện ngoại cảnh

- Hệ số nhân giống cao, sớm cho cây giống

- Giá thành thấp

 Nhược điểm:

- Phát sinh nhiều biến dị

- Khó giữ được những đặc tính, hình thái, năng suất, chất lượng của cây giống ban đầu

- Lâu ra hoa

 Nhân giống bằng hạt chỉ áp dụng trong 1 số trường hợp sau :

- Gieo hạt sản xuất cây làm gốc ghép

- Chỉ gieo hạt đối với những giống chưa có phương pháp nhân giống tốt hơn

- Lai tạo giống mới, phục tráng giống

 Những điểm cần lưu ý khi nhân giống bằng hạt:

 Ưu điểm: cây con, chồi con được lấy ra từ cây mẹ để trồng nên :

- Sớm ra hoa kết quả

- Giữ được đặc tính đi truyền của cây mẹ

- Tỉ lệ trồng sống cao

 Nhược điểm: - Dễ mang mầm sâu bệnh

- Cây không đồng đều

2.3 Tạo giống đồng tiền

2.3.1 Phương pháp lai hữu tính

Giống như các cây họ cúc khác, cây hoa đồng tiền là hoa tự do, hoa hình lưỡi và hoa hình ống tạo thành Nhưng chỉ những hoa hình ống ở giữa có nhị

đực, còn nhị đực ở hoa hình lưỡi đã bị thoái hóa Tuy hoa hình ống là hoa lưỡng tính nhưng do nhị đực chín trước vì vậy rất khó tự thụ phấn, mà muốn kết hạt phải giao phấn Chính vì những đặc điểm như vậy, nên muốn tạo ra giống mới ta phải tiến hành lai hữu tính giữa các cá thể với nhau.

Khi lai cần lấy phấn ở cây bố có hoa chưa nở hoàn toàn, ngược lại nhị cái

ở cây hoa phải nở hoàn toàn mới thành thục, đó là điểm cần đặc biệt lưu ý khi lai Khi hạt chín cần thu hái kịp thời tránh để rụng hạt

2.3.2 Phương pháp chọn biến dị chồi

Phương pháp này là bồi dục từ các chồi đột biến tự nhiên hoặc nhân tạo, các giống được tạo ra theo cách này có nhiều tính trạng giống mẹ, nó giữ được phần lớn ưu điểm của cây gốc và cải thiện khuyết điểm Phương pháp này đơn giản, dễ làm

Biến dị chồi tự nhiên là sự tạo thành những tính trạng thay đổi do sự đột biến gen trong điều kiện tự nhiên Đột biến nhân tạo là dùng các tác nhân dẫn đến đột biến để xử lý cây, nhằm tăng tần suất biến dị nên sử dụng chiếu xạ

2.3.3 Tạo giống bằng kĩ thuật mới

Công nghệ mới ở đây chủ yếu là dùng công nghệ gen để tạo ra giống mới Phương pháp này đòi hỏi trang thiết bị phức tạp, đắt tiền, kĩ thuật cao mà chỉ có

ở một số nước tiên tiến hay những cơ sở đầu tư trang thiết bị hiện đại mới có điều kiện áp dụng

2.4 Kĩ thuật trồng và chăm sóc hoa đồng tiền

2.4.1 Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh

2.4.1.1 Ánh sáng

Cây hoa đồng tiền không ưa cường độ ánh sáng cao, khi trồng cần hạn chế ánh sáng trực xạ Do đó nếu trồng vào mùa nắng nóng cần dùng lưới đen để giảm bớt cường độ ánh sáng.

2.4.1.2 Nhiệt độ

Đa số các giống hiện nay ưa khí hậu mát mẻ, nhiệt độ thích hợp từ 15 -

250C, một số giống chịu được nhiệt độ cao hơn (30 - 340C) Khi nhiệt độ dưới

120C và trên nhiệt độ 350C sinh trưởng phát triển của cây kém, màu sắc hoa nhạt, chất lượng hoa xấu

2.4.1.3 Độ ẩm

Hoa đồng tiền chịu hạn kém Đồng tiền thích hợp với độ ẩm đất 60–70 %

Độ ẩm không khí 55– 65% là điều kiện thuận lợi cho cây phát triển

2.4.1.4 Đất

Đồng tiền thích hợp với đất tơi xốp, độ thông thoáng cao, nhiều mùn, pH

từ 6 – 6,5 Đất trồng hoa đồng tiền cần khả năng giữ nước và thoát nước tốt, mực nước ngầm thấp và ổn định, tránh nơi đất trũng

2.4.2 Kĩ thuật trồng, chăm sóc

2.4.2.1 Chọn cây giống

Hiện nay, các giống đồng tiền kép nhập nội từ Hà Lan, Trung Quốc, Đài Loan đều được ưa chuộng và phù hợp với điều kiện miền Bắc Việt Nam Nên trồng nhiều chủng màu trong 1 vườn để dễ dàng cho việc tiêu thụ sản phẩm Đồng tiền có thể trồng từ cây nuôi cấy mô và cây tách thân Cây nuôi cấy

mô có ưu điểm: cây khoẻ, sạch bệnh, lâu bị thoái hoá, hoa to đẹp nhưng giá thành cao Cây tách thân có ưu điểm giá thành thấp nhưng nhanh thoái hoá, chất lượng hoa kém

2.4.2.2 Mật độ và khoảng cách trồng

Trồng 2 hàng/luống Khoảng cách trồng 30 - 35 x 35 cm, tương ứng mật

độ là 50.000 – 60.000 cây/ha (tức 1.800 – 2.200 cây/1sào Bắc Bộ)

2.4.2.3 Kỹ thuật trồng

- Trồng đồng tiền phải trồng nổi, cổ rễ cao bằng so với mặt đất, nếu trồng sâu cây phát triển chậm hay bị thối thân

- Trồng xong tưới đẫm nước để chặt gốc, nếu cây đồng tiền bị đổ, nghiêng thì dựng lại và bổ sung đất nhỏ vào xung quanh gốc cây

2.4.2.4 Kỹ thuật tưới nước

Đối với đồng tiền không nên tưới phun mạnh tránh để nước bắn trực tiếp lên lá và cổ rễ cây sẽ làm đất và vi sinh vật hại gây hại cho cây Nên nắp đặt hệ thống tưới nhỏ giọt Nếu không có điều kiện trên thì tưới nhẹ vào giữa 2 hàng cây, không tưới trực tiếp vào thân và lá, tránh làm đất bắn lên lá và dội nước vào nõn cây Đồng tiền không ưa ẩm quá vì vậy nên tưới vào lúc sáng sớm hoặc chiều mát, vào khoảng 2 – 3 ngày tưới 1 lần tuỳ theo điều kiện thời tiết

2.4.2.5 Kỹ thuật bón phân

- Lượng phân (tính cho 1 sào Bắc Bộ/năm):

+ Phân chuồng hoai mục: 2 - 3 tấn

+ Phân lân: 150 kg Supelan

+ Phân Kali: 120 kg Kali clorua

+ Phân đạm: 120 kg Urê

- Cách bón:

+ Bón lót toàn bộ phân chuồng và 1/2 phân lân

+ Lượng phân còn lại chia đều cho các lần bón, định kỳ 15 - 20 ngày bón 1 lần Ngoài việc bón phân qua rễ, cần phun thêm phân bón lá Các loại phân bón lá có tác dụng kích thích sinh trưởng là: Spray- N- Grow, Growmore, E

2001, phân bón thiên nông

2.4.2.6 Sâu bệnh hại và biện pháp phòng trừ

- Sâu hại: Đồng tiền thường có các loài sâu hại như: Bọ phấn trắng, rệp nhảy, nhện chân tơ, nhện đỏ, bọ trĩ… Biện pháp phòng trừ chung nhất là: Vặt bỏ

lá già, lá bị bệnh, nụ, hoa bị hại để tiêu hủy, làm cỏ vườn sạch sẽ, sử dụng thuốc hóa học để diệt trừ sâu bệnh

- Bệnh hại: Nguồn nấm là mối nguy hiểm nhất đối với hoa đồng tiền, có một số bệnh như: bệnh đốm lá, phấn trắng, nấm hạch, mốc tro, thối gốc.

Biện pháp phòng trừ: Tiêu độc đất nước khi trồng, thường xuyên kiểm tra đồng ruộng, vặt bỏ lá già, nhặt bỏ cây bị bệnh, tiêu độc đất nơi cây bị bệnh hoặc thay bằng đất khác Sử dụng thuốc hóa học để trừ nấm bệnh (Đặng Văn Đông và

cs, 2003)

2.5 Tình hình sản xuất hoa đồng tiền trên thế giới và trong nước

2.5.1 Tình hình sản xuất hoa đồng tiền trên thế giới

Hiện nay, công tác nghiên cứu và sản xuất hoa ở nước ngoài rất phát triển Trình độ tạo giống sản xuất của các nước Hà Lan, Nhật Bản, Mỹ, Đức rất cao như công ty Forist của Hà Lan là công ty dẫn đầu thế giới về tạo giống, nghiên cứu, sản xuất, buôn bán hoa đồng tiền Họ có lực lượng rất mạnh về nghiên cứu khoa học, về thiết bị sản xuất đã tạo ra rất nhiều giống, sản lượng ngày càng nhiều, việc sử lý sau thu hoạch, bảo quản, đóng gói đều ở trình độ rất cao Ở Trung Quốc, ngay từ những năm 20 của thế kỷ XX, họ đã sản xuất được hoa đồng tiền cắt cành nhưng do giống thoái hoá nghiêm trọng nên không phát triển được Đến năm 1987, kỹ thuật nuôi cấy mô và kỹ thuật nhân nhanh giống đã được áp dụng cho cây đồng tiền Nhờ vậy, tình trạng thoái hoá giống được khắc phục, hoa đồng tiền mới phát triển trở lại Hiện nay Thượng Hải là nơi có diện tích trồng lớn nhất với 35 ha, trong đó trung tâm nhân giống hoa Hà Viên Nghê

ở nông trường Đông Hải đứng đầu trong sản xuất và nhân giống hoa đồng tiền

Ở Giang Tô cũng là nơi phát triển mạnh hoa đồng tiền năm 1995 mới có trên

6000 m2, đến năm 1999 đã có tới 6 ha Viện nghiên cứu rau quả, Viện nghiên cứu khoa học nông nghiệp và nông trường Liên Vân … là những đơn vị có diện tích trồng lớn, kĩ thuật tương đối cao (Đào Thanh Vân và cs, 2007)

Tuy nhiên, sản xuất hoa đồng tiền ở một số nước đang phát triển vẫn có nhiều hạn chế Thứ nhất, tính chuyên nghiệp và quy mô sản xuất chưa cao Có rất ít công ty chuyên sản xuất và quy mô sản xuất đồng tiền thường nhỏ, còn rất

manh mún nên hiệu quả kinh tế không cao, không có sản phẩm ưu việt đủ sức cạnh tranh trên thị trường trong nước và quốc tế Ví dụ, ở Tô Châu diện tích trồng hoa đồng tiền lớn nhất không quá 2 ha, nhỏ thì chỉ trên 1.000 m2, sản lượng hoa hàng ngày rất ít, nên phí thu hái, bao gói, vận chuyển không cân xứng, tiêu thụ tại chỗ thì thừa, bán ra ngoài thì không kinh tế nên hiệu quả kinh

tế thấp Hạn chế thứ hai là tổng diện tích sản xuất lớn nhưng sản lượng ít, chất lượng kém Diện tích trồng trọt được mở rộng nhưng phân tán, lực lượng kỹ thuật không tập trung Thêm vào đó là thiết bị sản xuất thấp, chất lượng kém ảnh hưởng nghiêm trọng đến hiệu quả kinh tế Theo thống kê năm 1996, diện tích trồng hoa của Trung Quốc là 75.000 ha, giá trị 600 triệu đô Mỹ Trong khi đó,

Hà Lan trồng 8017 ha giá trị sản lượng 3,59 tỷ đôla Mỹ, gấp 56 lần Trung Quốc Trang thiết bị trồng trọt lạc hậu, hàm lượng kỹ thuật cao ít cũng là một hạn chế không nhỏ ở các nước đang phát triển Tỷ lệ thiết bị tiên tiến trong trồng trọt rất nhỏ, cách trồng cổ truyền vẫn chiếm ưu thế khiến sản lượng thấp, chất lượng kém, mùa vụ sản xuất không phù hợp với nhu cầu lúc cần, khả năng cung ứng hoa quanh năm không mạnh do đó giá cả không ổn định, hiệu quả kinh tế thấp Ngoài ra công tác chọn giống mới chậm so với sản xuất, giá thành bao gói cao cũng là những hạn chế trong sản xuất hoa đồng tiền ở một số nước đang phát triển (Đào Thanh Vân và cs, 2007)

2.5.2 Tình hình sản xuất ở Việt Nam

Đồng tiền là 1 trong mười loài hoa quan trọng nhất thế giới sau hồng, cúc, lan, cẩm chướng …

Ở Việt Nam giống hoa đồng tiền đơn được nhập về trồng đầu tiên khoảng

từ những năm 1940 Đặc điểm của giống hoa đơn này là cây sinh trưởng khỏe,

thích nghi tốt với điều kiện tự nhiên, nhưng nhược điểm là hoa nhỏ, cánh đơn, màu sắc đơn điệu, vì vậy hiện nay người ta ít trồng Từ những năm 1990, một vài công ty và những nhà trồng hoa Việt Nam bắt đầu nhập các giống đồng tiền lai từ Đài Loan, Hà Lan, Trung Quốc về trồng Các giống này có ưu điểm: hoa

to, cánh dày, gồm nhiều tầng xếp lại với nhau, màu sắc phong phú, hình dáng hoa cân đối, rất đẹp, năng suất cao Vì vậy những giống này đã được tiếp nhận

và phát triển mạnh mẽ ở khắp mọi vùng, mọi tỉnh thành trên cả nước (Nguyễn Xuân Linh, 1998)

Trong các giống hoa đồng tiền trồng ở Việt Nam thì hoa đồng tiền kép nhập nội là một trong những cây cho hiệu quả kinh tế cao nhất Từ một sào hoa đồng tiền giống mới chăm sóc đúng kĩ thuật có thể cho thu nhập gần 50 triệu/sào/năm

Hiện nay, hoa đồng tiền là loài hoa rất được ưa chuộng với giá cả phải chăng Nhưng tình trạng sản xuất hoa đồng tiền của Việt Nam khó xâm nhập vào thị trường thế giới Vì chất lượng, chủng loại, kích cỡ không đồng đều, chưa đáp ứng được thị hiếu của khách hàng quốc tế

Sự chênh lệch về giá cả thị trường hoa Việt Nam và thị trường hoa thế giới cũng thể hiện rõ Ở hoa đồng tiền, khi bán tại ruộng giá dao động từ 500 – 1500 đồng/bông Trong khi đó, giá bán hoa đồng tiền tại Mĩ là 20000 – 25000 đồng/bông

Trồng đồng tiền không khó nhưng cần nắm rõ đặc tính của nó và có những biện pháp kĩ thuật riêng biệt Nắm được những điều này nghề trồng hoa đồng tiền ở Việt Nam còn nhiều cơ hội để phát triển hơn nữa

2.6 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng nuôi cấy mô nhân giống hoa đồng tiền

2.6.1 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng nuôi cấy mô nhân giống hoa đồng tiền trên thế giới

Trên thế giới vật liệu được sử dụng làm mẫu cấy ở hoa đồng tiền có thể là đỉnh sinh trưởng, đế hoa, lá, cuống lá, bầu nhụy, noãn trong đó tái sinh mẫu từ

lá non là thành công nhất

Theo kết quả của viện nghiên cứu nông nghiệp Ấn Độ, chồi hình thành từ

mô sẹo cho hệ số nhân cao Mô lá hình thành mô sẹo trong môi trường MS bổ sung 0,4 mg/l BA, 4 mg/l NAA và 30 g/l đường saccarose Khi cấy mô sẹo vào môi trường MS bổ sung 2 mg/l NAA và 1 mg/l BA, chồi tái sinh được hình thành với tỉ lệ cao

Theo nghiên cứu của Skoog và Miller năm 1958, quá trình phát triển mô sẹo của hoa đồng tiền cần có cả Cytokinin và Auxin Khi nuôi cấy trong môi trường chỉ có BA hoặc NAA thì mô sẹo không được hình thành Mô sẹo hình thành tốt nhất trong môi trường có nồng độ NAA cao và nồng độ BA thấp

Năm 1973, Pierik và Segers chứng minh rằng sự hình thành mô sẹo sẽ tăng lên khi Cytokinin kết hợp với Auxin trong môi trường nuôi cấy Theo Huang (2001), dùng môi trường MS bổ sung 1 mg/l BA và 0,05 mg/l IBA là thích hợp cho sự hình thành mô sẹo từ đỉnh chồi và từ cuống lá

Theo viện nghiên cứu nông nghiệp Ấn Độ, môi trường nuôi cấy chỉ có

BA mà không kết hợp với NAA cho hệ số nhân chồi thấp, môi trường chỉ chứa NAA thì không có chồi nào xuất hiện Môi trường ra rễ tốt nhất là MS + NAA + IBA Theo

Barbaso (1992), rễ phát triển tốt hơn trong môi trường MS + IAA với nồng độ 0,5; 1,0; 2,0; 4,0 mg/l

Tác giả U.Laneri và cộng sự (2000) đã nghiên cứu xử lí gây đột biến chồi Đồng Tiền (giống hoa Đồng Tiền màu hồng) ở liều xử lí 2 krad (0,98 krad/h) Sau đó nhân các cây sống sót sau 2 lần cấy chuyển Sau khi hình thành rễ, cây con được trồng trong nhà kính và được phân tích Đã thu được 15% sự đa dạng sau trồng trong nhà kính về số lượng hoa, chiều dài và chiều rộng cánh hoa

M Jerzy và cộng sự (2003) đã nghiên cứu ảnh hưởng của 4 yếu tố tới sự

hình thành chồi bất định của mô lá Đồng Tiền ‘Sardis’ Chồi bất định được hình thành cơ bản ở cuống lá (được tách ra từ các mô ghép) Việc bổ sung 6-benzylamino-purine (BAP) trong môi trường nuôi cấy hiệu quả hơn khi bổ sung 6-furfuryl amino-purine (kinetin) Các lá không có cuống hoặc bị cắt ½ chiều dài đã không hình thành chồi bất định Sự hình thành các chồi bất định có nguồn gốc từ 1 cây đơn lẻ thấp hơn so với sự hình thành các chồi có nguồn gốc từ cụm

mô ghép Trong 1 thí nghiệm khác, các tác giải đã nghiên cứu khả năng tái sinh tạo chồi bất định của 27 cây Đồng Tiền ở điều kiện ex vitro

Huang LiYun và cộng sự (2008) đã nghiên cứu tái sinh từ đế hoa của

giống hoa Gerbera jamesonii cv Dahonghua tạo chồi bất định Nghiên cứu này

nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hoà sinh trưởng thực vật khác nhau đến

sự tái sinh callus và hình thành chồi từ mâu cấy là đế hoa, nghiên cứu đã thiết lập 1 hệ thống tái sinh có hiêụ quả Các kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng môi trường tái sinh tối ưu nhất cho sự cảm ứng hình thành callus là môi trương MS

cơ bản có bổ sung 10mg/l BAP và NAA Môi trường MS + 2 mg/l BAP + 1.0 mg NAA + 5.0 mg AD/litre được sử dụng cho việc cảm ứng tạo chồi sau 30 ngày MS + 2.0 mg benzyadenine + 0.5 mg NAA/l được sử dụng để nhân chồi (nhân nhanh) Môi trường ½ MS có bổ sung 0.2 mg IBA/l là môi trường ra rễ Bổ sung 30 mg/l Kanamycin vào trong môi trường để bảo quản nguồn gen

Velananni, J và cộng sự (2008) đã nghiên cứu việc nuôi cấy đỉnh sinh

trưởng của giống hoa Đồng Tiền Gerbera jamesonii Adlam trên môi trường MS

có bổ sung các nồng độ auxin và xytokinin khác nhau Kết quả thu được các đỉnh sinh trưởng đã không có sự cảm ứng hình thành chồi cũng như callus nào khi nuôi cấy trên môi trường không bổ sung chất điều tiết sinh trưởng Môi trường MS bổ sung IAA (2 mg/l) + BAP (10 mg/l) đã phát triển 6 chồi, nếu bổ sung thêm kháng sinh Ka thì hình thành 4 chồi Các chồi nhỏ được nuôi cấy trên

môi trường bổ sung IAA phát triển mạnh hơn so với bổ sung IBA sau 4 tuần nuôi cấy.

Theo Shagufta Naz và cộng sự (2012) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các

loại mẫu cấy khác nhau đến nhân giống in vitro cây hoa đồng tiền Kết quả

nghiên cứu cho thấy để cảm ứng chồi từ callus, từ nguồn mẫu ban đầu là đỉnh sinh trưởng meristem môi trường thích hợp là MS bổ sung 10 mg/l BAP Khi bổ sung them NAA và Kinetin cho chất lường chồi tốt hơn Sáu khi chồi có kích thước 5cm được chuyển sang môi trường tạo rễ là môi trường MS + 10 mg/l NAA Sau đó cây ra rễ được chuyển sang trồng trên cát ẩm trong nhà lưới

2.6.2 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng nuôi cấy mô nhân giống hoa đồng tiền trong nước

Năm 1975, phương pháp nhân giống in vitro được ứng dụng ở nước ta và đến

nay đã được sử dụng khá phổ biến Nhiều giống cây trồng được sản xuất như hoa lan, cúc, cẩm chướng Trong đó, hoa đồng tiền được sản xuất rộng rãi và cho giá trị kinh tế cao

Theo kết quả nghiên cứu của Ngô Năng Vịnh, Hà Thị Thúy, Dương Minh Nga 3(2003), môi trường tạo callus và tái sinh chồi tối ưu là MS + 0,2 mg/l TDZ + 0,1 mg/l NAA + 50 g/l saccarose + 6 g/l agar Môi trường nhân nhanh tốt nhất

là môi trường bán lỏng MS + 1,5 mg/l BA + 10% nước dừa + 1 mg/l B1 + 50 g/l saccarose + 3 g/l agar Môi trường ra rễ là môi trường MS + 0,5 mg/l NAA + 50 g/l saccarose + 6 g/l agar Gía thể thích hợp nhất cho cây con trong giai đoạn vườn ươm là hỗn hợp 1 đất + 1 trấu hun + ¼ vi sinh

Theo nghiên cứu của Hoàng Thị Nga và cộng sự (2003), môi trường tái sinh tối ưu là MS + 1 mg/l BA + 0,2 mg/l Kinetin + 0,2 mg/l IAA + 25 g/l saccarose + 6,5 g/l agar Sau 8 – 10 tuần, chồi được chuyển sang môi trường nhân nhanh

MS + 1 mg/l Kinetin + 10% nước dừa + 25 g/l saccarose + 6,5 g/l agar Môi trường tạo cây hoàn chỉnh là MS + 0,1 mg/l NAA + 25 g/l saccarose + 6,5 g/l agar Gía thể thích hợp nhất cho việc ra cây là: 1 mùn + 1 trấu hun

Năm 2003, Đặng Văn Đông và Đinh Thế Lộc đưa ra quy trình nhân nhanh hoa đồng tiền Môi trường tạo chồi tốt nhất là MS + 4 mg/l BA + 0,2 mg/l NAA + 0,2 mg/l IAA Sau 4 tuần, chồi được hình thành và chuyển vào môi trường MS + 5 mg/l KT + 1 mg/l IAA Chồi cao khoảng 2cm thì chuyển sang môi trường tạo rễ tối ưu ½ MS + 0,1 mg/l NAA Sau khoảng 4 tuần sẽ ra rễ dài 2-3 cm Chuyển cây con đã ra rễ trồng trên giá thể gồm 1 phần mùn cưa, 1 phần than bùn, 1phần vụn đá xốp rồi dung lưới cản quang che nắng, che mưa Sau 2-3 tuần cây sẽ sống, tăng dần cường độ chiếu sáng, chăm sóc 5-6 tuần có thể đưa ra trồng ngoài ruộng.

Trung tâm Nghiên cứu Khoai tây, Rau và Hoa đã bước đầu nghiên cứu

thành công và là nơi cung cấp giống hoa đồng tiền in vitro Môi trường tạo chồi

nhân nhanh được sử dụng là MS + 0,3 – 0,5 mg/l BA + 30 g/l saccarose + 7 g/l agar Hệ số nhân chồi cao nhất trong môi trường MS + 0,3 – 0,5 mg/l BA + 25 g/l saccarose + 7 g/l agar Rễ phát triển trong môi trường MS + 0,3 mg/l NAA + 0,2 g/l than hoạt tính + 30 g/l saccarose + 7 g/l agar

Năm 2007, Dương Tấn Nhựt và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của kiểu gen, loại mô nuôi cấy và môi trường nuôi cấy tới sự tái sinh chồi của

Gerbera jamesonii bằng cách sử dụng đế hoa được nuôi cấy lớp mỏng tế bào

theo chiều ngang Phương thức nhân giống hàng loạt sử dụng đế hoa cắt lát mỏng theo chiều ngang tế bào của Đồng Tiền (tTCL) đã được nuôi cấy Các thông số kiểu gen, tuổi của nụ hoa, vị trí của đế hoa tTCLs đã được xác định thành công Ở các loài Đồng Tiền lai cho thấy tỷ lệ tái sinh chồi khác nhau,

sự cảm ứng callus bằng nuôi cấy tTCL từ đế hoa tất cả đều có tỷ lệ tái sinh chồi trên 57% Các chồi hoa đuơc lựa chọn khoảng ngày tuổi thứ 10 cho tỷ lệ tái sinh chồi đạt 91% sau 6 tuần nuôi cấy trên môi trường MS cơ bản [Murashige, T., Skoog, F., 1962 được bổ sung 0.02 mg l−1 thidiazuron (TDZ), 0.8 mg l−1 adenine

và 10% (v/v) nước dừa (CW) Nó có ý nghĩa hơn những nụ hoa có từ 7 – 9 ngày tuổi (22% and 54%) Tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất (94–100%) ở lớp giữa của đế

hoa Đối với việc nhân chồi hàng loạt, cụm chồi được cấy chuyển trên môi trường ½ MS có bổ sung 0.5 mg l−1 indole-3-butyric acid (IBA), 0.5 mg l−1 6-benzyladenine (BAP) và 2.0 mg l−1 kinetin sau 4 tuần nuôi cấy Cây con được hình thành khi nuôi cấy các chồi đơn trên môi trường ½ MS có bổ sung 1 mg l−1 IBA Tất cả các cây con đều thích nghi tốt với điều kiện trong nhà lưới.

Theo nghiên cứu của Nguyễn Văn Hồng (2009) kĩ thuật khử trùng đế hoa đồng tiền non tốt nhất là khử trùng bằng 0,1% HgCl2 trong thời gian 10 phút Môi trường tạo callus là MS + 30g/l saccarose + 6,5g/l agar +1,5 mg/l 2,4D Môi trường tái sinh tối ưu là MS + 30 g/l saccarose + 6,5g/l agar +1 mg/l BAP + 0,2 mg/l Kinetin + 0,1 mg/l NAA Môi trường nhân nhanh tốt nhất là MS + 30 g/l saccarose + 6,5g/l agar + 1,5 mg/l BAP + 15% nước dừa Môi trường ra rễ MS +

30 g/l saccarose + 6,5g/l agar + 0,15 mg/l NAA mang lại hiệu quả ra rễ tốt nhất trong giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh từ chồi hoa đồng tiền Gía thể tốt nhất để ra cây trong giai đoạn vườn ươm là giá thể đất + cát+ trấu hun+ phân vi sinh Sông Gianh (1:1:1:1/4)

Theo kết quả nghiên cứu của Tưởng Thị Lý và cộng sự (2011) môi trường vào mẫu thích hợp với giống đồng tiền G05.76 ; G05.82 là MS + 0,6 mg/l TDZ + 30 g/l đường Môi trường nhân nhanh tối ưu đối với giống G05.76 và G05.82

là MS + 0,5 mg/l BA + 1 mg/l Kinetin Môi trường ra rễ thích hợp đối với G05.76 là MS +0,2 mg/l NAA + 1 mg/l IBA + 40 g/l saccarose Môi trường ra

rễ thích hợp đối với giống G05.82 là MS + 0,6 mg/l NAA + 40 g saccarose

Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Kim Thu và cộng sự (2014) kĩ thuật khử trùng đế hoa đồng tiền non là khử trùng bằng cồn 700 trong thời gian 1 phút sau đó tiếp tục khử trùng bằng Giaven 10% trong 15 phút Môi trường tái sinh được sử dụng là môi trường MS + 30 g/l saccarose + 9 g/l agar + 0,7 mg/l BA Môi trường nhân nhanh thích hợp là MS + 30 g/l saccarose + 9 g/l agar + 0,5 mg/l BA + 0,1 mg/l GA3 Môi trường ra rễ là MS + 30 g/l saccarose + 9 g/l agar + 0,3 mg/l NAA + 2g/l than hoạt tính

Từ những nghiên cứu trên chúng tôi thấy rằng, cây hoa đồng tiền nhân nhanh tốt nhất trong môi trường MS có bổ sung BA, α – NAA cho hiệu quả ra rễ tốt nhất, môi trường ra rễ thích hợp là MS.

Tóm lại, việc nhân nhanh cây hoa đồng tiền không cần các kĩ thuật đặc biệt so với kĩ thuật nhân nhanh các cây trồng khác, sử dụng các chất điều tiết sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin và auxin phổ biến hiện nay như BA, Kinetin, NAA để điều khiển sự phát sinh chồi, tạo rễ cây hoàn chỉnh

PHẦN III VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Cây hoa đồng tiền lùn (Genbera Jamesonii Bolus).

3.2.2 Vật liệu

Hình 3.1 Bao bì đồng tiền lùn nhiều màu 3.2 Nội dung nghiên cứu và phương pháp nghiên cứu.

3.2.1 Nội dung 1: Giai đoạn nuôi cấy khởi động

 Phương pháp xử lí mẫu: hạt giống hoa đồng tiền lùn được lắc trong cồn 700 trong 4 phút, sau đó tráng lại 5 lần bằng nước cất vô trùng Sau đó, cấy hạt giống vào môi trường vào mẫu ( môi trường MS )

 Hạt giống hoa đồng tiền lùn được theo dõi trong 1 tuần để phát hiện thời gian nảy mầm của hạt Sau đó, chồi đồng tiền lùn nảy mầm từ hạt tiếp tục được theo dõi trong 3 tuần Chồi đồng tiền lùn phát triển khỏe mạnh cấy trên môi trường MS sẽ được cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh

- Hạt giống hoa đồng tiền lùn:

hạt F1 được nhập khẩu từ Mỹ bởi công

ty hạt giống hoa Việt Nam (FVN).

3.2.2 Nội dung 2 : Giai đoạn nhân nhanh cụm chồi

- Vật liệu sử dụng để nhân nhanh là các chồi đơn sinh trưởng phát triển khỏe mạnh có chiều cao từ 2,5 - 3 cm ,có từ 3 - 4 lá cấy vào môi trường nhân nhanh đã chuẩn bị

- Các thí nghiệm:

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến hiệu quả nhân chồi

Nồng độ BA (mg/l)

CT1CT2CT3CT4CT5

00,10,30,50,7

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến hiệu quả nhân chồi

Công thức Nồng độ Kinetin (mg/l)

CT1CT2CT3CT4CT5

00,10,30,50,7

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp của BA và nước dừa tới sự nhân nhanh của chồi hoa đồng tiền (Nồng độ BA được sử dụng trong thí nghiệm là nồng độ cho kết quả tốt nhất trong thí nghiệm 1 Kí hiệu là BA*)

Công thức Nồng độ BA tốt nhất

(mg/l)

Nước dừa (ml/l)

Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp của BA và Kinetin tới sự nhân nhanh của chồi hoa đồng tiền (Nồng độ BA được sử dụng trong thí nghiệm

là nồng độ cho kết quả tốt nhất trong thí nghiệm 1 Kí hiệu là BA*)

Công thức Nồng độ BA tốt nhất

(mg/l)

Nồng độ Kinetin (mg/l)

CT1CT2CT3CT4CT5

Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp của Kinetin và α - NAA tới sự nhân nhanh của chồi hoa đồng tiền (Nồng độ Kinetin được sử dụng trong thí nghiệm là nồng độ cho kết quả tốt nhất trong thí nghiệm 2 Kí hiệu là K*)

Công thức Nồng độ Kinetin tốt nhất

(mg/l)

Nồng độ α – NAA

(mg/l)

- Các chỉ tiêu theo dõi:

+ Hệ số nhân chồi = (∑số chồi bật/∑số chồi cấy)

+ Chất lượng chồi bật

+ Chiều cao chồi (cm)

3.2.3 Nội dung 3 : Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh

- Mẫu nuôi cấy: chồi hoa đồng tiền khỏe mạnh có từ 3 – 5 lá thu được từ quá trình nhân nhanh

Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của α - NAA đến sự tạo rễ của chồi đồng tiền in vitro

Công thức Nồng độ α - NAA (mg/l)

CT1CT2CT3CT4CT5

00,10,20,40,8

Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến sự tạo rễ của chồi đồng tiền

in vitro

00,10,20,40,8

Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến sự tạo rễ của chồi đồng tiền in vitro

Công thức Nồng độ than hoạt tính

(g/l)

CT1CT2CT3CT4CT5

00,250,350,500,75

- Các chỉ tiêu theo dõi:

+ Tỉ lệ chồi ra rễ

Tỉ lệ chồi ra rễ = (∑số chồi ra rễ / ∑số chồi cấy) * 100 %

+ Số rễ/cây

Số rễ/cây = ∑số rễ ra / ∑số cây tạo thành

+ Chiều dài rễ/cây: tính từ cổ rễ đến chóp rễ

+ Màu sắc rễ

3.2.4 Nội dung 4 : Giai đoạn vườn ươm

Cây con được đưa ra ngoài vườn ươm: cây con có từ 3-5 lá, cao khoảng 3,5-5 cm, có từ 3 - 4 rễ

Thí nghiệm 9: Nghiên cứu ảnh hưởng của loại giá thể đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây con sau nuôi cấy mô

CátTrấu hunĐất + Cát (1:1)Đất + Cát + Trấu hun

Chế độ chăm sóc: Cây con được trồng trong nhà lưới, ngày tiến hành tưới phun

2 lần bằng nước sạch ( giữ độ ẩm giá thể đạt 75-85%)

3.2.5 Phương pháp xử lý số liệu.

- Các công thức thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 10 mẫu/CT

- Môi trường nền: MS + 30 g/l saccarose + 6,8 g/l agar, pH = 5,8

- Điều kiện nuôi cấy: Phòng thí nghiệm vô trùng với các điều kiện vật lý như sau: Ánh sáng: 2000 – 3000 lux; Thời gian chiếu sáng: 12 – 16 h/ngày; Nhiệt độ: 24 ± 20C; Độ ẩm: 60 – 70 %

- Các số liệu được tính toán trên máy tính theo chương trình Microsoft Excel và chương trình IRISTART 5.0

3.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian: 6 tháng từ 12/2016 đến 05/2017.

- Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn Đột biến và ưu thế lai, Viện Di truyền nông

nghiệp