Nghiên cứu điều kiện thủy phân nấm men bia bằng protease thương phẩm thu peptide có hoạt tính chống oxi hóa

i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRNG MNH HNG Tờn ti: Nghiên cứu điều kiện thủy phân nấm men bia protease thơng phẩm thu peptide cã ho¹t tÝnh chèng oxi hãa KhãA LUËN TèT NGHIệP ĐạI HọC H o to Chuyờn ngnh Khoa Khoỏ học : Chính quy : Cơng nghệ Thực phẩm : CNSH-CNTP : 2010-2014 Thái Nguyên, năm 2014 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRƯƠNG MẠNH HÙNG Tờn ti: Nghiên cứu điều kiện thủy phân nấm men bia protease thơng phẩm thu peptide có hoạt tính chống oxi hóa KhóA LUậN TốT NGHIệP ĐạI HọC Hệ đào tạo : Chính quy Chun ngành : Cơng nghệ Thực phẩm Lớp : K42 - CNTP Khoa : CNSH-CNTP Khoá học : 2010-2014 Giảng viên hướng dẫn : TS Hoàng Thị Lệ Hằng Viện Nghiên cứu Rau Hà Nội ThS Phạm Thị Vinh Khoa CNSH - CNTP, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên Thái Nguyên, năm 2014 LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình thực tập tốt nghiệp Trung tâm Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm Hà Nội - Sở Khoa học cơng nghệ Hà Nội, để hồn thành đợt thực tập tốt nghiệp nỗ lực thân nhận giúp đỡ tận tình thầy khoa CNSH & CNTP tồn thể chú, anh chị cán Trung tâm Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm Hà Nội Trước tiên xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS Phạm Thị Thu Hiền Trung tâm Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm Hà Nội tạo điều kiện cho tơi thực tập tận tình giúp đỡ tơi hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn thầy Lưu Hồng Sơn - Giảng viên khoa CNSH & CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên tận tình bảo giúp đỡ tơi làm khóa luận Đồng cảm ơn thầy cô khoa CNSH & CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên giúp đỡ suốt q trình học tập Cảm ơn chú, anh chị cán Trung tâm Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm Hà Nội giúp đỡ tơi q trình thực tập Cuối tơi xin cảm ơn gia đình tơi bạn bè giúp đỡ động viên nhiều lúc tơi gặp khó khăn Do thời gian kiến thức hạn chế nên báo cáo tốt nghiệp tránh khỏi thiếu sót Kính mong q thầy khoa CNSH & CNTP Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên thông cảm đóng góp ý kiến giúp cho báo cáo tốt nghiệp tơi hồn thiện Một lần xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày tháng 06 năm 2014 Sinh viên Trương Mạnh Hùng DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Thành phần bã men bia (%) Bảng 2.2: Thành phần chất khô bã men bia (%) Bảng 2.3: Ứng dụng protease công nghiệp .20 Bảng 3.1: Thành phần gel điện di .31 Bảng 4.1: Một số thông số bã nấm men bia sau rửa đắng 33 Bảng 4.2: Tỷ lệ chết tế bào nấm men nhiệt độ khác .34 Bảng 4.3: Đường chuẩn tyrosine 35 Bảng 4.4: Đường chuẩn glutamic .37 Bảng 4.5: Ảnh hưởng nồng độ chế phẩm enzyme Flavourzyme đến khả thuỷ phân protein nấm men 39 Bảng 4.6: Ảnh hưởng nồng độ chế phẩm enzyme Neutrase đến khả thuỷ phân protein nấm men 41 Bảng 4.7: So sánh khả thuỷ phân Flavourzyme Neutrase 43 Bảng 4.8: Kết xác định khả ức chế gốc tự 46 DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ Hình 2.1: Nấm men Saccharomyces Cerevisiae Hình 2.2: Sự tạo thành liên kết peptide Hình 2.3: Cấu trúc pentanpeptide seryl-glycyl-tyrosyl-alanyl-neucine Hình 2.4: Sự tạo phức màu xanh da trời đậm phản ứng Biure Hình 2.5: Cấu trúc vitamin C Hình 2.6: Cấu trúc vitamin E Hình 2.7: Cấu trúc trung tâm hoạt động (TTHĐ) protease 16 Hình 2.8: Sơ đồ phân loại protease 18 Hình 2.9: Sơ đồ thu nhận tinh ACEIPS từ dịch thủy phân casein .24 Hình 4.1: Biểu đồ thành phần hóa học bã nấm men bia sau rửa đắng .33 Hình 4.2: Hình ảnh vi trường kiểm tra tỷ lệ chết nấm men .35 Hình 4.3: Đồ thị đường chuẩn tyrosine 36 Hình 4.4: Đường chuẩn glutamic .38 Hình 4.5: Ảnh hưởng nồng độ chế phẩm enzyme Flavourzyme đến khả thuỷ phân protein nấm men 40 Hình 4.6: Ảnh hưởng nồng độ chế phẩm enzyme Neutrase đến khả thuỷ phân protein nấm men 42 Hình 4.7: So sánh khả thuỷ phân Flavourzyme Neutrase 44 Hình 4.8: Kết điện di peptide từ dịch thủy phân 45 Hình 4.9: Sơ đồ quy trình cơng nghệ thủy phân nấm men bia protease thương phẩm thu dịch peptide kỹ thuật có hoạt tính chống oxi hóa 47 BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên đầy đủ Ký hiệu TTHĐ Trung tâm hoạt động DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl BHT Butylated hydroxytoluen BHA Butylate hydroxyanisole TBHQ Tertbutyl hydroquinone EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid KTĐ Khô tuyệt đối SDS Sodium Dodecyl Sulfate PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis TCA TriCloroacetic Acid SGYAL Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu ACE Angiotensin I Converting Enzyme MỤC LỤC PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Yêu cầu đề tài 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.1 Tổng quan nấm men bia 2.1.1 Tìm hiểu chung bã men bia 2.1.2 Thành phần hóa học dinh dưỡng bã men bia 2.2 Tổng quan peptide có hoạt tính chống oxi hóa 2.2.1 Khái niệm peptide 2.2.2 Quá trình tạo thành liên kết peptide 2.2.3 Cách gọi tên phân loại peptide 2.2.4 Tính chất peptide 2.2.5 Peptide có hoạt tính chống oxi hóa 2.3 Tổng quan protease 15 2.3.1 Giới thiệu chung 15 2.3.2 Phân loại protease 18 2.3.3 Cơ chế hoạt động protease 19 2.3.4 Ứng dụng 20 2.4 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 21 2.4.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 21 2.4.2 Tình hình nghiên cứu nước 22 PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 3.1 Đối tượng (vật liệu) phạm vi nghiên cứu 26 3.2 Hóa chất, dụng cụ thiết bị sử dụng nghiên cứu 26 3.3 Địa điểm thời gian tiến hành nghiên cứu 27 3.3.1 Địa điểm nghiên cứu 27 3.3.2.Thời gian nghiên cứu 27 3.4 Nội dung nghiên cứu 27 3.4.1 Đánh giá chất lượng bã nấm men bia 27 3.4.2 Xác định tỷ lệ nấm men chết 27 3.4.3 Xác định hoạt độ enzyme protease 27 3.4.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả thuỷ phân protein nấm men chế phẩm enzyme Neutrase enzyme Flavourzyme 27 3.4.5 Xác định peptide phương pháp điện di gel polyacrylamide-SDS (SDSPAGE) 27 3.4.6 Xác định hoạt tính chống oxi hóa chế phẩm peptide chức 27 3.4.7 Viết sơ đồ quy trình cơng nghệ thủy phân nấm men bia protease thương phẩm thu peptide có hoạt tính chống oxi hóa 27 3.5 Phương pháp nghiên cứu 27 3.5.1 Xác định tỷ lệ nấm men chết phương pháp theo dõi vi trường 27 3.5.2 Xác định hoạt độ protease (theo phương pháp Anson cải tiến) 28 3.5.3 Phương pháp ninhydrin xác định hàm lượng acid amin 29 3.5.4 Xác định hàm lượng peptide tổng OPA 30 3.5.5 Xác định peptide phương pháp điện di gel polyacrylamide-SDS (SDSPAGE) (theo HOEFER) 30 3.5.6 Xác định hoạt tính chống oxi hóa phương pháp β-carotene/ Linoleate (Shaikhan et al, 1995) 32 3.5.7 Phương pháp xử lý số liệu 32 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 4.1 Đánh giá chất lượng bã nấm men bia 33 4.2 Xác định tỷ lệ nấm men chết 34 4.3 Xác định hoạt độ enzyme protease 35 4.3.1 Xây dựng đường chuẩn tyzosine 35 4.3.2 Xác định hoạt độ enzyme protease chế phẩm Flavourzyme 37 4.3.3 Xác định hoạt độ enzyme protease chế phẩm Neutrase 0,8L 37 4.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả thuỷ phân protein nấm men chế phẩm enzyme Neutrase enzyme Flavourzyme 37 4.4.1 Xây dựng đường chuẩn glutamic 37 4.4.2 Ảnh hưởng nồng độ chế phẩm enzyme Flavourzyme đến khả thuỷ phân protein nấm men 39 4.4.3 Ảnh hưởng nồng độ chế phẩm enzyme Neutrase đến khả thuỷ phân protein nấm men 41 4.4.4 So sánh hiệu thuỷ phân chế phẩm enzyme Neutrase với chế phẩm enzyme Flavourzyme 43 4.5 Xác định peptide phương pháp điện di gel polyacrylamide-SDS (SDSPAGE) 44 4.6 Xác định hoạt tính chống oxi hóa chế phẩm peptide chức 46 4.7 Hồn thiện quy trình thủy phân, tinh nấm men bia protease thương phẩm thu peptide có hoạt tính chống oxi hóa 47 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 5.1 Kết luận 50 5.2 Kiến nghị 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Peptide protein thường có cấu trúc đoạn ngắn khoảng từ hai đến vài chục amino acid nối với nhau, có khối lượng phân tử thường 6.000 Dalton Mặc dù có cấu trúc nhỏ nhiều peptide có vai trị quan trọng hoạt động trao đổi chất thể Nó có tác dụng y học, công nghệ thực phẩm ngành khác Một tác dụng quan trọng peptide khả chống oxy hóa, ngăn ngừa tác hại gốc tự sinh từ hoạt động trao đổi chất thể Chất chống oxi hóa có mặt loại trái rau quả, thảo dược, trứng, sữa Tuy vậy, hàm lượng chúng biến động khác loại thực phẩm thường kèm với nhiều chất khác Do nhu cầu đặt phải tạo sản phẩm giàu peptide loại để bổ sung cách có kiểm sốt với đối tượng có nhu cầu Qua tìm hiểu thấy bã men bia với hàm lượng protein dồi số nguồn cung cấp peptide chống oxi hóa tiềm Ngày cơng nghệ sản xuất thị trường tiêu thụ bia ngày phát triển, sản lượng bia tạo với số lượng lớn, kéo theo lượng bã men bia thải tăng Ở Việt Nam, nấm men bia thu từ nhà máy bia lớn Ước tính trung bình 1000 lít bia thu 1,5 kg nấm men khơ, chứa khoảng 700g protein [19,2] Năm 2005 sản lượng bia nước đạt 1,5 tỷ lít, tương ứng với 18 triệu sinh khối nấm men thải Đến năm 2010 sản lượng bia nước đạt 2,5 tỷ lít bã men thải 30 triệu [2] Như vậy, lượng protein có chất lượng cao từ nấm men thải trình sản xuất bia tận dụng không nhỏ Việc nghiên cứu chế biến sử dụng nấm men cịn Việt Nam có nghịch lý nấm men thải từ nhà máy bia phần nhỏ bán cho hộ chăn nuôi gia súc sử dụng làm thức ăn trực tiếp, cịn lại thải ngồi mơi trường gây nhiễm mơi trường Xuất phát từ tình hình thực tế trên, để giảm bớt gánh nặng ô nhiễm cho mơi trường đồng thời nghiên cứu tạo sản phẩm chức có ứng dụng 39 4.4.2 Ảnh hưởng nồng độ chế phẩm enzyme Flavourzyme đến khả thuỷ phân protein nấm men Tỷ lệ chế phẩm enzyme bổ sung vào có ảnh hưởng lớn đến khả thuỷ phân protein nấm men Để xác định tỷ lệ enzyme chất thích hợp, ta tiến hành làm mẫu thí nghiệm với tỷ lệ enzyme bổ sung khác nhau: Mẫu 1: Không bổ sung enzyme Mẫu 2: Bổ sung 0,1% enzyme (0,01 g enzyme/10 g nấm men) Mẫu 3: Bổ sung 0,4% enzyme (0,04 g enzyme/10 g nấm men) Mẫu 4: Bổ sung 0,7% enzyme (0,07 g enzyme/10 g nấm men) Mẫu 5: Bổ sung 1% enzyme (0,1 g enzyme/10 g nấm men) Mẫu 6: Bổ sung 2% enzyme (0,2 g enzyme/10 g nấm men) Sản phẩm cuối thu phản ứng thuỷ phân protein acid amin Vì trình nghiên cứu, khả thuỷ phân protein nấm men enzyme xác định qua lượng acid amin tạo thành Bảng 4.5: Ảnh hưởng nồng độ chế phẩm enzyme Flavourzyme đến khả thuỷ phân protein nấm men Hàm lượng acid amin (g/100 g bã men KTĐ) Thời gian thủy phân(giờ) Không bổ sung 0,1% enzyme 0,4% enzyme 0,7% enzyme 1% enzyme 2% enzyme 28,86 32,75 36,58 38,04 40,61 43,36 16 34,40 39,25 48,43 50,05 60,47 63,0 24 34,83 39,83 49,74 55,34 64,20 65,66 32 40,08 51,73 53,18 57,28 64,88 65,66 40 43,31 55,60 55,60 60,06 65,60 67,0 Quá trình thuỷ phân xảy điều kiện nhiệt độ 550C, pH = (điều kiện tối ưu cung cấp hãng sản xuất) Sau lại tiến hành lấy mẫu lần Hàm lượng acid amin xác định theo phương pháp ninhydrin (xem mục 3.5.3) chuyển g/100g men KTĐ Kết trình bày bảng 4.5 hình 4.5 Khả thuỷ phân protein nấm men tăng lên tăng nồng độ enzyme bổ sung Acid amin thu nhiều mẫu bổ sung 2% chế phẩm 40 enzyme Sau 16 thuỷ phân, lượng acid amin thu mẫu không bổ sung enzyme 34,4g, mẫu bổ sung 0,1% enzyme 39,25g, mẫu bổ sung 0,4% enzyme 48,43g, mẫu bổ sung 0,7% 50,05%, mẫu bổ sung 1% enzyme 60,47%, mẫu bổ sung 2% enzyme cao 63% Thời gian (giờ) Hình 4.5: Ảnh hưởng nồng độ chế phẩm enzyme Flavourzyme đến khả thuỷ phân protein nấm men Nồng độ enzyme 0,1% cho lượng acid amin tạo thành thấp nhất, tức hiệu suất thuỷ phân bé (39,25g) tăng 14,5% so với mẫu đối chứng không bổ sung enzyme (34,4 g) sau 16 thuỷ phân Nồng độ enzyme cao 2% cho lượng acid amin nhiều (63g) sau 16 thuỷ phân Nhưng mức tăng không đáng kể so với mẫu bổ sung 1% enzyme (60,47g), tức tăng 4,25% (so với mẫu bổ sung 1% enzyme), lượng enzyme phải dùng cao gấp đôi Sử dụng enzyme nồng độ lợi mặt kinh tế Vì vậy, ta chọn tỷ lệ chế phẩm Flavourzyme bổ sung 1% cho thí nghiệm Ở mẫu bổ sung 1% enzyme hiệu suất thuỷ phân tăng 78% so với mẫu không bổ sung enzyme sau 16 thuỷ phân 41 4.4.3 Ảnh hưởng nồng độ chế phẩm enzyme Neutrase đến khả thuỷ phân protein nấm men Để xác định tỷ lệ chế phẩm enzyme Neutrase 0,8L thích hợp cần bổ sung Ta tiến hành mẫu thí nghiệm với nhiệt độ thuỷ phân 500C tỷ lệ enzyme bổ sung khác nhau: - Mẫu 1: Không bổ sung enzyme - Mẫu 2: Bổ sung 0,1% enzyme (0,01ml enzyme/10g nấm men) - Mẫu 3: Bổ sung 0,2% enzyme (0,02ml enzyme/10g nấm men) - Mẫu 4: Bổ sung 0,3% enzyme (0,03ml enzyme/10g nấm men) Sau lại lấy mẫu lần, xác định hàm lượng acid amin tạo thành (quy g/100g men KTĐ) theo phương pháp ninhydrin (mục 3.5.3) Kết trình bày hình 4.6 bảng 4.6 Bảng 4.6: Ảnh hưởng nồng độ chế phẩm enzyme Neutrase đến khả thuỷ phân protein nấm men Thời gian thủy phân(giờ) Hàm lượng acid amin (g/100 g men KTĐ) Không bổ sung enzyme 0,1% Neutrase 0,2% Neutrase 0,3% Neutrase 12,35 16,58 19,64 23,88 28,40 32,08 33,38 36,09 12 33,08 38,53 44,03 46,14 16 35,37 45,60 51,44 51,44 20 38,83 46,97 53,32 53,52 24 40,26 49,35 54,48 55,29 28 41,25 51,04 54,72 55,29 32 42,38 53,08 54,72 55,48 42 Hình 4.6: Ảnh hưởng nồng độ chế phẩm enzyme Neutrase đến khả thuỷ phân protein nấm men Kết thu cho thấy việc bổ sung chế phẩm enzyme Neutrase 0,8L vào làm hiệu thuỷ phân tăng hẳn so với mẫu không bổ sung enzyme Cụ thể là, sau 16 thuỷ phân hàm lượng acid amin tạo thành mẫu so sánh với mẫu đối chứng không bổ sung enzyme sau: Tăng 29% (đạt 45,6g) mẫu bổ sung 0,1% enzyme, tăng 45,5% (đạt 51,44 g) mẫu bổ sung 0,2% enzyme, tăng 45,5% (đạt 51,44 g) mẫu bổ sung 0,3% enzyme Nồng độ enzyme 0,3% cho lượng acid amin tạo thành cao nồng độ enzyme 0,2% chút 12 Nhưng sau 12 thuỷ phân, đường biểu diễn gần trùng nhau, tức hiệu thuỷ phân chúng Lượng acid amin tạo thành tất mẫu tăng mạnh thời gian thuỷ phân từ - 16 giờ, sau 16 thuỷ phân lượng acid amin tạo thành tăng chậm nhiều (acid amin tạo thành mẫu bổ sung 0,2% enzyme tăng 32% tăng thời gian thuỷ phân từ lên 12 giờ, tăng 16,8% tăng 43 thời gian thuỷ phân từ 12 lên 16 giờ, tăng 3,65% tăng thời gian thuỷ phân từ 16 lên 20 giờ) Vì vậy, ta chọn thời gian thuỷ phân 16 thời gian thích hợp để tiến hành phản ứng thuỷ phân 4.4.4 So sánh hiệu thuỷ phân chế phẩm enzyme Neutrase với chế phẩm enzyme Flavourzyme Các enzyme protease có nguồn gốc khác khả phân cắt chúng lên mạch protein khác Kết hàm lượng acid amin tạo thành dịch thuỷ phân cấu tỷ lệ thành phần sản phẩm khác Để so sánh hiệu thuỷ phân chế phẩm enzyme Neutrase Flavourzyme, ta chọn điều kiện thuỷ phân cho mẫu điều kiện thích hợp cho hoạt động nó, tức là: Đối với chế phẩm enzyme Flavourzyme: Thuỷ phân điều kiện tối ưu nồng độ enzyme 1%, nhiệt độ thuỷ phân 550C, pH = Đối với chế phẩm enzyme Neutrase: Thuỷ phân điều kiện tối ưu nồng độ enzyme 0,2%, nhiệt độ thuỷ phân 500C, pH = 16 Bảng 4.7: So sánh khả thuỷ phân Flavourzyme Neutrase Thời gian (giờ) 12 16 20 24 Flavourzyme 1% 20,14 40,61 49,74 60,47 62,00 64,20 Neutrase 0,2% 20,02 33,38 44,03 51,44 53,32 54,48 44 Hàm lượng acid amin (g/100 g men KTĐ) 70 Flavourzyme 1% Neutrase 0,2% 60 50 40 30 20 10 12 16 20 24 Thời gian (giờ) Hình 4.7: So sánh khả thuỷ phân Flavourzyme Neutrase Từ đồ thị cho thấy: Hàm lượng acid amin tạo thành mẫu thuỷ phân Flavourzyme cao mẫu thủy phân Neutrase khơng nhiều Trong lượng Flavourzyme sử dụng lại cao nhiều so với Neutrase Do vậy, tính theo hiệu kinh tế rõ ràng sử dụng Neutrase tiết kiệm Do Neutrase chọn làm enzyme sử dụng cho trình thủy phân 4.5 Xác định peptide phương pháp điện di gel polyacrylamideSDS (SDS-PAGE) Đề tài cần tạo peptide 10kDa theo nghiên cứu trước peptide phân đoạn có hoạt tính chống oxi hóa cao nên cần khảo sát thời gian để enzyme chọn thủy phân giới hạn khoảng Không tạo đoạn peptide dài mà không cắt vụn thành acid amin Vì vậy, mẫu nấm men thủy phân enzyme Neutrase điều kiện tối ưu kiểm tra sản phẩm tạo thành theo thời gian phương pháp SDS-PAGE 45 M: Maker Giếng 3: Mẫu điện di sau thủy phân 3h Giếng 1: Mẫu điện di sau thủy phân 1h Giếng 2: Mẫu điện di sau thủy phân Giếng 4: Mẫu điện di sau thủy phân 4h Giếng 5: Mẫu điện di sau thủy phân 5h Hình 4.8: Kết điện di peptide từ dịch thủy phân Do sản phẩm cần sau thủy phân peptide nên dựa vào thời gian thủy phân tạo acid amin enzyme, tiến hành khảo sát thời gian enzyme thủy phân giờ, giờ, giờ, giờ, Sau lấy hỗn hợp thủy phân qua màng cut-off 50kDa, màng lọc phân đoạn peptid có khối lượng 50kDa Sau đem chia phân đoạn thành phần: phần chạy điện di cịn phần đem thử hoạt tính chống oxi hóa Theo kết điện di (Hình 4.8), ta thấy giếng tương ứng với mẫu sau 5h thủy phân, băng điện di peptide 10kDa hiển thị đậm Tuy vậy, thủy phân lâu khả peptide bị cắt vụn acid amin cao Do cần thêm bước kiểm tra hoạt tính chống oxi hóa thơng qua khả ức chế gốc tự (tác nhân gây oxi hóa chủ yếu) để khẳng định chắn 46 4.6 Xác định hoạt tính chống oxi hóa chế phẩm peptide chức Lấy 100µl chất cần nghiên cứu cho vào ống nghiệm, thêm nước cất đến thể tích 1ml Sau thêm vào ống 1ml DPPH (0,2 mM ethanol) ủ nhiệt độ phòng 30 phút Mẫu kiểm chứng chuẩn bị tương tự mà khơng có chất cần nghiên cứu Độ hấp thụ (A) dung dịch đo bước sóng 517nm Chất ức chế nhóm tự DPPH theo phần trăm (I%) tính từ biểu thức: I% = [(Ađối chứng - Amẫu)/ Ađối chứng] x 100% Bảng 4.8: Kết xác định khả ức chế gốc tự TT Thời gian thủy phân (giờ) AĐối chứng AMẫu I(%) Mẫu 1 0,588 0,574 2,372 Mẫu 2 0,588 0,569 3,259 Mẫu 3 0,588 0,491 16,47 Mẫu 4 0,588 0,481 18,03 Mẫu 5 0,588 0,487 17,17 Qua bảng 4.8 nhận thấy hoạt tính chống oxi hóa mẫu thủy phân sau 5h cao tương ứng với mẫu giếng phù hợp với nghiên cứu trước chứng minh peptide thấp phân tử